Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы И
1.1. Общие сведения о репродуктивно-респираторном синдроме свиней 11
1.1.1. Основные пути распространения, клинические признаки и патологоанатомические изменения при РРСС 12
1.1.2. Локализация вируса РРСС в организме свиней 15
1.2. Иммунобиологическая характеристика вируса РРСС 17
1.2.1. Классификация, морфология и химический состав 17
1.2.2. Генетическая, антигенная вариабельность и родство штаммов вируса РРСС... 18
1.2.3. Репродукция вируса РРСС in vivo и in vitro 20
1.3. Культуральные свойства вируса РРСС 23
1.3.1. Культивирование вируса РРСС в первичных и перевиваемых культурах клеток 24
1.3.2. Титрование вируса РРСС с использованием различных культур клеток 25
1.4. Методы диагностики РРСС 26
1.4.1. Выделение и идентификация вируса РРСС 26
1.4.2. Серологические методы диагностики РРСС 29
1.5. Иммунитет при РРСС 35
1.5.1. Клеточный иммунитет 36
1.5.2. Гуморальный иммунитет 37
1.6. Вакцины против РРСС 39
1.7. Заключение по обзору литературы 42
2. Собственные исследования 46
2.1. Материалы и методы... 46
2.1.1. Вирусы 46
2.1.2. Культуры клеток 46
2.1.3. Подопытные животные 48
2.1.4. Сыворотки и питательные среды 48
2.1.5. Оборудование, химреактивы, конъюгаты и растворы 49
2.1.6. Культивирование вируса РРСС 53
2.1.7. Определение инфекционного титра вируса РРСС 54
2.1.8. Очистка и инактивация вирусного материала 55
2.1.9. Адъюванты 55
2.1.10. Изготовление вакцины 55
2.1.11. Определение антигенной активности вакцины 56
2.1.12. Заражение животных испытуемым вируссодержащим материалом 57
2.1.13. Постановка серологических реакций 58
2.1.14. Обработка полученных результатов 62
2.2. Результаты собственных исследований 63
2.2.1. Культивирование вируса РРСС в перевиваемой культуре клеток MARC-145 и альвеолярных макрофагах свиней (АМС) 63
2.2.1.1. Культивирование перевиваемой культуры клеток MARC-145 63
2.2.1.2. Особенности репродукции вируса РРСС, штамма Lelystad, в перевиваемой культуре клеток MARC-145 67
2.2.1.3. Изучение особенностей репродукции вируса РРСС, штамма NVSL,
в перевиваемой культуре клеток MARC-145 70
2.2.1.4. Культивирование вируса РРСС в альвеолярных макрофагах свиней 73
2.2.1.5. Изучение иммунобиологических свойств вируса РРСС, штамма Lelystad,
на подсвинках 75
2.2.2. Оптимизация лабораторных методов выделения и обнаружения
вируса РРСС 77
2.2.2.1. Оптимизация непрямой реакции иммунофлюоресценции для выявления антигена вируса РРСС 77
2.2.2.2. Выделение вируса РРСС от экспериментально зараженных животных. 83
2.2.3. Выделение и изучение иммунобиологических свойств полевых изолятов вируса РРСС, циркулирующих среди свинопоголовья на территории России 85
2.2.3.1. Изучение иммунобиологических свойств некоторых изолятов вируса РРСС на поросятах 86
2.2.3.2. Выделение вируса РРСС в АМС 88
2.2.3.3. Выделение вируса РРСС в перевиваемой культуре клеток MARC-145 89
2.2.3.4. Испытание чувствительности к вирусу РРСС различных первичных, перевиваемых культур клеток и куриных эмбрионов 91
2.2.4. Изучение иммунобиологических свойств изолята «Кемеровский-96» вируса РРСС 93
2.2.4.1. Культуральные свойства изолята «Кемеровский-96»
вируса РРСС 93
2.2.4.2. Изучение иммунобиологических свойств изолята «Кемеровский-96» на свиньях 95
2.2.4.3. Контроль изолята «Кемеровский-96» на специфичность и отсутствие контаминации 98
2.2.4.4. Изучение антигенной активности изолята «Кемеровский-96» 99
2.2.5. Оптимизация и модификация методов оценки антигенной
активности вакцин против РРСС 100
2.2.5.1. Оптимизация и модификация реакции нейтрализации (РН)
для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней и кроликов 101
2.2.5.2. Оптимизация и модификация непрямой реакции
иммунофлюоресценции (НРИФ) для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней и кроликов 105
2.2.5.3. Оптимизация и модификация реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней и кроликов 109
2.2.5.4. Оптимизация и модификация непрямого метода иммуноферментного
анализа (ИФА) для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней.. 113
3. Обсуждение результатов исследований 120
4. Выводы 126
5. Практические предложения 128
6. Список литературы
- Иммунобиологическая характеристика вируса РРСС
- Оборудование, химреактивы, конъюгаты и растворы
- Особенности репродукции вируса РРСС, штамма Lelystad, в перевиваемой культуре клеток MARC-145
- Изучение иммунобиологических свойств изолята «Кемеровский-96» на свиньях
Введение к работе
Актуальность темы. Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) - контагиозное заболевание, наносящее ощутимый экономический ущерб свиноводству. Оно характеризуется поздними абортами, преждевременными опоросами, прохо-лостами у свиноматок, рождением мертвых или нежизнеспособных поросят, гибелью новорожденных поросят, поражением органов дыхания у поросят разных возрастных групп [3,21].
РРСС был впервые зарегистрирован в свиноводческих хозяйствах США и Канады в 1986-1987гг., а возбудитель заболевания был выделен при помощи первичной культуры альвеолярных макрофагов свиней (АМС) в 1991 году. В последующее десятилетие это заболевание было установлено в большинстве стран мира с развитым свиноводством [75, 211].
Возбудителем РРСС является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Arteriviridae, роду Arterivirus [82, 240].
Для вируса РРСС характерна генетическая и антигенная вариабельность [8, 118, 235]. Ежегодно в различных странах мира выделяют новые изоляты вируса РРСС, только в Испании их насчитывают свыше 66 [180]. На основании генетических и антигенных отличий изоляты разделяют на две генетические группы: американскую и европейскую [166, 216, 224]. По данным GenBank (банк генетических последовательностей) и литературы, в Юго-Восточной Азии, в том числе и в Китае, в последнее время циркулирует вирус РРСС американского генотипа, вызывающий болезнь свиней, сходную по течению и клиническому проявлению с классической чумой свиней (быстрое распространение, заболеваемость до 100%, смертность - 25-50%) [255]. Во многих лабораториях разработаны и совершенствуются различные серологические и молекулярно-биологические методы диагностики РРСС [14, 17].РРСС изучается с 1991 г. во многих странах мира, а в России и других странах СНГ он известен только с 1993 г. [12, 21]. Несмотря на это, до сих пор существуют трудности при выделении вируса и его адаптации в течение длительного культивирования к первичным и перевиваемым культурам клеток [5, 40].
Вирус РРСС очень изменчив - генетические различия между российскими изо-лятами составляют до 17% [9, 117]. В связи с этим, выделение новых изолятов вируса РРСС, циркулирующих в свиноводческих хозяйствах России, изучение и использование их для оптимизации средств диагностики и специфической профилактики являются актуальными задачами.
Цель и задачи исследования. Основной целью исследования являлось выделение и изучение культуральных свойств изолятов вируса РРСС и оценка возможности их использования для приготовления диагностических и вакцинных препаратов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- выделить изоляты вируса РРСС, циркулирующие в свиноводческих хозяйствах России;
- изучить особенности репродукции вируса РРСС в различных системах культивирования с использованием референтных штаммов;
- изучить культуральные и антигенные свойства выделенных изолятов по сравнению с известными штаммами вируса РРСС;
- оптимизировать и модифицировать методы лабораторной диагностики РРСС с использованием реакции нейтрализации (РН), непрямой реакции иммунофлюорес-ценции (НРИФ), непрямой реакции гемагглютинации (РНГА) и непрямого варианта ИФА;
- оценить возможность применения оптимизированных и модифицированных серологических реакций для оценки антигенной активности вакцин;
- исследовать сыворотки крови свиней на наличие антител к вирусу РРСС от экспериментально зараженных и вакцинированных против РРСС животных;
- провести серомониторинг по РРСС в России.
Научная новизна исследований. Новизна исследования состоит в том, что:
- выделен и адаптирован к перевиваемой культуре клеток MARC-145 изолят вируса РРСС «Кемеровский-96»;
- изучены иммунобиологические свойства изолята «Кемеровский-96», который был депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов (ФГУ «ВГНКИ»), используемых в ветеринарии и животноводстве, под наименованием штамм «КПР-96»-ДЕП и предложен для использования в качестве производственного;
- на основе штамма «КПР-96» созданы моно- и ассоциированная вакцины против РРСС;
- для оценки антигенной активности вакцин против РРСС рекомендованы модифицированные серологические реакции: РН, НРИФ, РНГА и ИФА.
Научная новизна исследования подтверждена тремя патентами Российской Федерации:
- Патент на изобретение №2295567 «Штамм «КПР-96» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов» (2007г.);
- Патент на изобретение №2236253 «Вакцина эмульсионная инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (2004г.);
- Патент на изобретение №2269361 «Вакцина ассоциированная эмульсионная инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней» (2006г.).
Практическая значимость исследований. Результаты исследований вошли в нормативную документацию:
- Нормативные документы на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней» (ТУ 9384-026-00008064-99), утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30.06.1999г. (изменения внесены 01.04.2005г.);
- Нормативные документы на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (ТУ 9384-153-00495527-2005), утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30.06.2006г.
Кроме того, результаты исследований использованы при подготовке следующих методик и методических указаний, которые одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»:
1. «Методика постановки реакции нейтрализации для ретроспективной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС)» (1995г.)
2. «Методические указания по выявлению и титрованию специфических антител в сыворотке крови свиней к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) с помощью непрямой реакции иммунофлюоресценции (НРИФ)» (1999 г.)
3. «Методические указания по применению набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в реакции непрямой гемагглютинации» (1999г.)
4. «Методика определения антител в сыворотке крови свиней к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом непрямого иммуноферментного анализа» (2000г).
Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе две работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены, обсуждены и опубликованы в материалах научных конференций «Современные аспекты ветеринарной патологии животных» (Владимир, 1998г.), «Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных» (Воронеж, 1999г.), «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2000г.), «Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных» (Воронеж, 2005г.), «Актуальные проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса» (Иваново, 2005г.), «Проблемы инфекционной патологии свиней» (XIV Московский Международный ветеринарный конгрьс Москва, 2006г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 1994-2006гг.
Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие доктор ветеринарных наук Ш.К. Куляшбекова (раздел 2.2.1.1), кандидат ветеринарных наук С.А. Кукушкин (разделы 2.2.1.4, 2.2.3.1), кандидат ветеринарных наук И.А. Тетерин (раздел 2.2.4.4), кандидат ветеринарных наук А.И. Егорова (раздел 2.2.5.3), кандидат ветеринарных наук И.Я. Курман (раздел 2.2.5.4), за что автор приносит им сердечную благодарность.
Основные положения, выносимые на защиту
- результаты выделения из патологических материалов вируса РРСС и его адаптации к различным культурам клеток;
- оптимизация и модификация лабораторных диагностических реакций с использованием РН, НРИФ, РИГА и ИФА для серодиагностики РРСС;
- результаты обнаружения вируса РРСС при помощи НРИФ в патологических материалах, полученных от экспериментально инфицированных или переболевших свиней;
- оценка антигенной активности вакцин против РРСС с помощью РН, НРИФ, РНГАиИФА;
- результаты исследований на наличие антител к вирусу РРСС в сыворотках крови, полученных от свиней из хозяйств и от экспериментально зараженных животных, в РН, НРИФ, РИГА и ИФА.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 168 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и приложения. Список используемой литературы включает 256 источников, из которых 213 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 3 рисунками и 35 таблицами.
Исследования по диссертационной работе являются частью комплексных тем НИР «Проведение исследований по разработке и освоению в условиях производства средств и методов борьбы с особо опасными и карантинными болезнями и инфекциями сельскохозяйственных животных» (государственный контракт №808/26) и «Совершенствование методов диагностики и профилактики инфекционных заболеваний свиней» (шифр «Ветеринарное благополучие» 3-02), которые выполнялись в 1994-2006гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (до 2003 г. -ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир).
Иммунобиологическая характеристика вируса РРСС
Возбудителем РРСС является РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Arterivirus, семейству Arteriviridae, порядку Nidovirales [39,202,211].
Вирионы вируса РРСС представляют собой сферические или аморфные частицы диаметром от 45 до 100 нм. Они состоят из изометрического нуклеокапсида диаметром от 25 до 35 нм и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются гликопротеиновые выступы длиной от 12 до 15 нм. Геном вируса представляет собой линейную позитивную одноцепочечную РНК размером 15 тысяч нуклеотидов. Вирион состоит из нуклеокапсидного (N), мембранного (М) и оболочечного (Е) протеинов. В состав оболочки вириона входят липиды и углеводы как часть гликопротеинов. На поверхности оболочки находятся поверхностные гликонротеины GS и GL [75, 82, 151, 155, 159,165, 167, 184,190, 197,211,232,238,240,245,251].
Геном вируса РРСС содержит восемь открытых рамок считывания (ОРС), которые кодируют гены репликаз (ОРС 1а и lb), оболочечные белки (ОРС 2-6) и нуклео-капсидный белок (ОРС 7). Определены шесть структурных белков вируса РРСС и их соответствующих генов: негликозилированный нуклеокапсидный белок N (молекулярная масса 15 Ша), кодируемый ОРС 7, негликозилированный трансмембранный белок М (молекулярная масса 18 kDa), кодируемый ОРС 6, и четыре N-гликозилированных белка с молекулярной массой 25; 31-35; 45-50; 29-30 Ша, кодируемые ОРС 5, ОРС 4, ОРС 3, ОРС соответственно [82, 110, 111, 121, 122, 146, 148, 163,166, 184, 190, 197,211, 216, 251].
Плавучая плотность вирионов европейского типа в хлористом цезии составляет от 1.17 до 1.20 г/см , в сахарозе - от 1.13 до 1.17 г/см [47, 69, 197]. Плавучая плотность оболочечных вирионов американского типа в хлористом цезии составляет от 1.18 до 1.30 г/см3, в сахарозе - от 1.18 до 1.23 г/см3, а безоболочечных («ядроподоб-ных структур») в хлористом цезии - от 1.28 до 1.31 г/см [71, 82, 88,151].
Вирус РРСС неустойчив к физико-химическому воздействию, так как он разрушается липидными растворителями (хлороформом, эфиром) и различными детергентами (деоксихолатом хлорида, Triton Х-100, NP-40), но не фреоном-113, не ингибиру-ется антибиотиками. Вирус стабилен при рН в пределах от 5.0 до 7.0. Устойчивость вируса изменяется одновременно с изменением рН и температуры хранения. Вирус, в составе патологического материала или вируссодержащей суспензии с добавлением креопротекторов, способен длительное время сохранять свои физико-химические свойства при температуре хранения от -20 до -70С [199].
Следовательно, вирус РРСС неустойчив к физико-химическому воздействию липидными растворителями, стабилен при рН в пределах от 5.0 до 7.0 и температуре хранения от -20 до -70С [199]. Из литературных данных мы получили сведения о значениях плавучей плотности вирионов в сахарозе и хлористом цезии, которые необходимы для получения очищенного концентрированного вируса методом градиентного центрифугирования [47,69,71, 82, 88,151,197].
На основании различий в нуклеотидной и аминокислотной последовательностях выделяют две генетические группы вируса РРСС: американскую и европейскую. Идентичность данных геногрупп на нуклеотидном уровне составляет 55-70% [65, 69, 82, 88, 124, 167, 197, 211, 235, 239]. Генетические отличия между изолятами вируса РРСС внутри двух геногрупп могут привести к ложно отрицательному результату в ПНР [192].
Изоляты вируса РРСС, относящиеся к европейской и американской геногруп-пам, имеют антигенные отличия друг от друга [82, 167, 197, 235]. Антигенные различия выявляли также и внутри каждой генетической группы [61, 65, 197,211].
С помощью мультиплексной ПЦР и метода сьюти-гибридизации возможно дифференцировать изоляты европейского и американского генотипов. При помощи НРИФ невозможно выявить антигенные отличия между различными изолятами вируса РРСС [57, 65, 86, 117, 133, 135, 148, 190, 192,244].
Российские изоляты вируса РРСС, за редким исключением, относят к европейской генетической группе. Данные изоляты вируса РРСС отличаются друг от друга по нуклеотидной последовательности на 6-17% и от штамма Lelystad на 8-16% [8, 13, 57, 117,117а].
В ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» было изучено генетическое многообразие свыше 30 российских и белорусских изолятов вируса РРСС по сравнению с 10 итальянскими изолятами того же вируса. В результате проведенного исследования установили, что уровень нуклеотидных отличий между отечественными и западноевропейскими изолятами не превышал 17% [9].
Зарубежные исследователи относили к разным штаммам изоляты вируса РРСС, имеющие генетические отличия друг от друга на уровне 0.5-1%. Генетические исследования позволяли выявить соотношения между штаммами, но не давали возможность предсказать их иммунобиологические свойства [111, 187, 234].
Анализ ГЩР-амплифицированных продуктов методом амплификации - секве-нирования нуклеокапсидного гена, кодируемого ОРС 7, позволял дифференцировать полевые изоляты и вакцинные штаммы вируса РРСС [28, 31,90,163].
Зарубежные исследователи при изучении полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса РРСС наблюдали возникновение у них различных генетических мутаций [57, 60, 68, 110, 114, 118, 158, 163, 195, 196, 206, 211,233].
Различные изоляты вируса РРСС, циркулирующие среди свиней в хозяйстве, по мнению Pesch S. с соавторами, не могут переходить один в другой путем мутации и рекомбинации, они сосуществуют независимо друг от друга [180].
Различия между изолятами вируса РРСС европейской и американской геног-рупп по генетическим и антигенным свойствам свидетельствуют о длительном периоде их независимого развития [62, 116, 121, 119]. Существует гипотеза о происхождении двух генотипов от одного вируса на разных континентах независимо друг от друга , 84, 146].
Оборудование, химреактивы, конъюгаты и растворы
Для культивирования вируса РРСС применяли следующие культуры клеток: - первичную культуру альвеолярных макрофагов свиней АМС, которую получали от клинически здоровых поросят в возрасте 4-6 недель; - перевиваемую культуру клеток MARC-145 (клон клеток почки эмбриона макаки -резус МА-104), привезенную из США (National Animal Disease Center UIDA, Agricultural Research Service, Ames, Iowa, 50010, USA); - перевиваемую культуру клеток почки эмбриона макаки - резус МА-104; - перевиваемую культуру клеток почки зеленой африканской мартышки Vero и другие, полученные из коллекции культур клеток ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».
Культуры клеток в виде выращенного монослоя или суспензии клеток получали сначала из лаборатории болезни Марека и культивирования клеток (заведующая лабораторией д.вет.н. Ш.К. Куляшбекова), затем из отдела культивирования культур клеток (заведующий лабораторией к.б.н. Б.Л. Манин).
Возможность репродукции вируса РРСС исследовали на 9-11-дневных СПФ-куриных эмбрионах, полученных из лаборатории болезней птиц. Перевиваемую культуру клеток MARC-145 выращивали в стационарных условиях по следующей схеме: - культивирование в монослое клеток MARC-145 вели до конечной стадии ло гарифмической фазы роста; з - дезагрегация монослоя клеток осуществляли с помощью 15-20 см диспергирующей смеси, состоящей из 0.02% раствора версена и 0.25% раствора трипсина в соотношении 9:1. Данную смесь наносили на монослой клеток и выдерживали на контакте 15-20 минут при 37С в термостате; - отделение клеток монослоя от субстрата, для чего сливали диспергирую-щую смесь, вносили в клинский матрас 50 см питательной среды RS-3M или Игла и тщательно встряхивали до полной диссоциации клеток; - получение клеточной суспензии, для этого в клинский матрас добавляли от 200 до 300 см полной ростовой среды RS-3M или Игла, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и 0.3 мг/см3 глютамина. Затем подсчитывали количество клеток в 1 смъ в камере Горяева и ресуспендировали клетки в ростовой среде до посевной концентрации 150 тыс. кл/см ; - посев клеточной суспензии по 150 см? в специально подготовленные клин-ские матрасы.
Первичную культуру альвеолярных макрофагов свиней (АМС) получали по следующей схеме: -обескровливание животных, С этой целью клинически здоровых поросят-отъемышей в возрасте 4-6 недель, полученных из благополучных в отношении РРСС и других инфекций хозяйств, обескровливали, не допуская попадания крови в трахею; -изолирование легких. Отпрепарированные легкие помещали в стерильный сосуд с ФБР, содержащим антибиотики (гентамицин в дозе 0.8 мг/см3); - получение АМС. АМС вымывали из легких при помощи ФБР (рН 7,2) или питательной среды Игла, содержащей антибиотики (25 мкг/см3 канамицина, 0.0025 мг/см3 амфотерицина и 0.04 мг/см3 нистатина); - приготовление суспензии АМС. АМС трехкратно промывали в ФБР путем центрифугирования при 2000 об/мин. и удаления надосадка. Затем АМС ресуспендировали в питательной среде Игла, содержащей 10% фетальной сыворотки КРС, 0. мг/см глютамина и антибиотики (25 мкг/см канамицина, 0.0025 мг/см амфотерицина и 0.04 мг/см3 нистатина); - подсчет клеток проводили в камере Горяева по общей формуле для АМС и клеток MARC-145 и вычисляли их концентрацию в 1 см3 по формуле: axlQQQxn 0.9 , где а - среднее число АМС в приготовленной суспензии; 1000 - число мм3 в 1 см3; п - степень разведения суспензии; 0.9 - объем камеры Горяева в мм3; - посев суспензии АМС в матрасы или микропланшеты. Получали посев ную концентрацию АМС, разбавляя их ростовой питательной средой Игла, от 3 1060 кл/см3 (для посева в матрасы) до 6 1060 кл/см3 (для посева в микропланшеты); - культивирование АМС проводили в течение 18-20 часов при +37С в СОг инкубаторе с содержанием 5% С02.
В лабораторных опытах использовали свиней пород крупная белая и ландрас из благополучных по РРСС и другим инфекционным заболеваниям хозяйств: - поросят-сосунов разного возраста с массой тела 1.5-8 кг - 23 шт.; - подсвинков 2-4 мес. возраста с массой тела 15-30 кг - 146 шт.; - супоросных свиноматок с массой тела 100-120 кг - 2 шт.
Для изучения безвредности и иммуногенной активности вакцин кроме свиней использовали лабораторных животных: - кроликов пород советская шиншилла и серебристый с массой тела 2-2.5кг -175 шт.; - морских свинок двухцветных с массой тела 250-300 г - 40 шт.; - белых мышей беспородных с массой тела 18-2ІГ - 230 шт.
Особенности репродукции вируса РРСС, штамма Lelystad, в перевиваемой культуре клеток MARC-145
Из данных таблицы 4 следует, что первые признаки ЦПД вируса РРСС, штамма Lelystad, в виде сферических образований клеток (конгломератов), приподнимающихся над поверхностью монослоя, отмечали через 1-2 дня после инокуляции вируса. Уплотнение оболочек клеток, образование цитоплазматических выростов на поверхности клеток, потерю клетками части цитоплазматического вещества, и, вследствие это го, сморщивание (пикноз) клеток, слияние в одном направлении от двух до пяти клеток (образование симпластов) наблюдали спустя 2-3 дня. Разрушение межклеточных связей и дезагрегацию клеток отмечали через 3-4 дня после инфицирования. Отслоение клеток от субстрата регистрировали через 4-5 дней и объединение симпластов в сетчатую структуру (псевдосинцитий) - через 4-7 дней после внесения вируса. Титр вируса от второго к восьмому серийному последовательному пассажу возрастал от 2.75+0.25 до 5.28+0.32 lg ТЦД50/см3.
Была установлена прямо пропорциональная зависимость между множественностью заражения и сроком проявления ЦПД вируса РРСС в монослое клеток MARC-145. Результаты проведенных опытов показали, что для полноценной репродукции вируса РРСС необходимо инфицировать монослой клеток с множественностью заражения не менее 0.01-0.02 ТЦД50/КЛ. и адсорбировать вирус на клетках MARC-145 в течение 1.5-2.0 часов при температуре 37С.
Известно, что выход вируса зависит от сроков инкубирования и степени проявления ЦПД вируса. Результаты изучения зависимости титра вируса РРСС от степени поражения монослоя клеток MARC-145 представлены в таблице 5.
Из данных таблицы 5 видно, что максимальное накопление вируса на уровне 4.88+0.12 - 5.25±0.25 lg ТЦД5о/см3 отмечали через 48-72 часа после инокуляции при появлении в клеточном монослое сморщенных (пикнотических) клеток и формировании симпластов. Через 24 часа, как и после 96 часов, титр вируса был низкий - в пре делах от 1.87±0.13 до 2.75±0.25 lg ТЦД50/см3.
В процессе культивирования проводили наблюдения за состоянием монослоя клеток. Первоначально отмечали отслаивание отдельных клеток с измененной морфологией от поверхности матраса. Затем в монослое клеток образовывались пустоты, которые вскоре исчезали из-за усиленной пролиферации клеток, и целостность монослоя восстанавливалась вновь. Через 24 часа после инфицирования клеточного моно-слоя титр вируса составлял 2.75+0.25 lg ТЦД5о/см По мере накопления вируса в культуральной среде наблюдали возрастающее нарушение целостности монослоя клеток, и через 48-72 часа титр вируса был в пределах от 4.88±0.12 до 5.25+0.25 lg ТЦД50/см3. По мере отслаивания инфицированных вирусом РРСС клеток, на поверхности матраса оставался только «цитоскелет» из нечувствительных или малочувствительных к вирусу РРСС клеток MARC-145.
При проведении культивирования вируса РРСС, штамм Lelystad, в культуре клеток MARC-145, выращенной в роллерах, титр вируса составлял 5.78±0.22 lg ТЦД5о/см , что превышало накопление вируса РРСС по сравнению с монослойным стационарным методом культивирования на 0.5-1.0 lg ТЦД5о/см .
Таким образом, оптимальными условиями культивирования вируса РРСС, штамма Lelystad, в культуре клеток MARC-145 являлись: использование питательных сред 199, RS-3M и Игла с содержанием 9-10% сыворотки крови КРС в ростовой среде и 1-2% - в поддерживающей среде, а также внесение глютамина в количестве 0.3-1.0 мг/см3. Следовательно, для получения наибольшего выхода вируса РРСС, штамма Lelystad, необходимо выросший монослой клеток MARC-145 инфицировать вирусом с множественностью заражения не менее 0.01-0.02 ТЦД5о/кл, адсорбировать вирус на клетках в течение 1.5-2 часов при температуре 37С и замораживать инфицированный монослой клеток через 48-72 часа после внесения вируса.
Представителем американского генотипа вируса РРСС является штамм NVSL, который нами был получен из научно-исследовательского центра здоровья животных, штат Айова (США) в 1995 году.
Инфицирование перевиваемой культуры клеток вирусом РРСС, штамма NVSL, проводили аналогично, как и вирусом штамма Lelystad: при получении первого пассажа в клинский матрас на выращенный монослой культуры клеток MARC-145 наносили 1 см3 вируссодержащей суспензии, при проведении следующих серийных последовательных пассажей в клинские матрасы с клеточным монослоем вносили по 10 CMJ культурального вируса РРСС.
Цитопатическое действие вируса РРСС, штамма NVSL, на культуре клеток MARC-145 сильно отличалось от ЦПД вируса штамма Lelystad. В данном случае не наблюдали образования симпластов из слившихся клеток и их объединения в псевдосинцитий, а отмечали только формирование сферических скоплений клеток, приподнимающихся над монослоем, затем разрушение монослоя клеток, округление, пикноз и отслоение клеток от поверхности матраса (табл. 6).
Изучение иммунобиологических свойств изолята «Кемеровский-96» на свиньях
Как видно из таблицы 20, на вторые сутки после интраназального заражения подсвинков, у одного животного наблюдали повышение температуры тела до 40.2С. У двух животных, инфицированных внутримышечно, регистрировали повышение температуры тела до 40.5 и 40.7С в течение 2-4 дней.
До начала опыта и через 28 дней после заражения у всех подсвинков отбирали пробы крови и сыворотки исследовали в коммерческом наборе ИФА фирмы «IDEXX» (США). Результаты исследования показали, что перед опытом все подсвинки были серонегативными, а через 28 дней стали серопозитивными к вирусу РРСС.
Таким образом, изучение иммунобиологических свойств изолята «Кемеровский-96» вируса РРСС на подсвинках показало, что он является слабовирулентным для подсвинков, так как у животных наблюдали незначительное повышение температуры тела (до 40.7С) на 2-4 сутки после инфицирования. Других каких-либо клинических признаков у экспериментальных поросят не отмечали.
В следующем опыте двух супоросных свиноматок, доставленных из благополучного в отношении РРСС хозяйства, на 85-88 дни супоросности инфицировали вирусом РРСС, изолята «Кемеровский-96», интраназально в дозе ЮхЮ50 ТЦД5о/см3.
От обеих свиноматок, которые опоросились на 114 день после осеменения, было получено 23 поросенка: 18 (78.3%) здоровых, 3 (13%) с патологией глаз в виде недоразвития век и глазного яблока и 2 (8.7%) нежизнеспособных (погибли в течение первых нескольких дней).
От свиноматок, экспериментально инфицированных вирусом изолята «Кеме-ровский-96», отбирали пробы крови до начала опыта и сразу после опороса (а также пробы молозива) и сыворотки исследовали на наличие антител к вирусу РРСС в коммерческом наборе ИФА фирмы «IDEXX» (табл. 21).
Как видно из результатов таблицы 21, до начала опыта обе свиноматки были серонегативными к вирусу РРСС. В пробах сывороток крови и молозива, отобранных от свиноматок в день опороса, были выявлены антитела к вирусу РРСС на высоком уровне.
От новорожденных поросят (до приема молозива) отбирали пробы крови и сыворотки исследовали на наличие антител к вирусу РРСС. Данные сыворотки оказались серонегативными к вирусу РРСС, следовательно, поросята не были инфицированы внутриутробно (в период неонатального развития). Затем, периодически, в течение 77 дней от поросят отбирали пробы крови и сыворотки исследовали на наличие антител к вирусу РРСС. У большинства поросят в возрасте от 3 до 20 дней выявляли антитела к вирусу РРСС. Затем доля серопозитивных животных уменьшилась - в возрасте от 27 до 35 дней обнаруживали антитела к вирусу РРСС только у пятой части от общего количества поросят. По мере взросления поросят, доля серопозитивных к вирусу РРСС животных уменьшалась - у поросят в возрасте от 42 до 56 дней отмечали наличие антител к вирусу РРСС только у восьмой части от общего количества животных. Все поросята к 77 дню стали серонегативными.
В результате проведенных исследований выяснили, что колостральный иммунитет у поросят-сосунов сохраняется на недостаточно высоком уровне до 56 дней после рождения. Через 2.5 месяца все поросята становятся серонегативными.
Специфичность и отсутствие вирусной контаминации подтвердили при исследовании 5, 10 и 25 пассажей вируса РРСС, изолята «Кемеровский-96», методом ПЦР на наличие геномов вирусов РРСС, ПВИС, КЧС, болезни Ауески, цирковирусов и ко-ронавирусов. В результате исследования указанных проб культурального вируса выявили в них только наличие генома вируса РРСС. С помощью дифференцирующей системы праймеров американского и европейского генотипов сотрудники лаборатории диагностики особо опасных болезней животных ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» доказали принадлежность изолята «Кемеровский-96» к европейскому генотипу вируса РРСС.
Идентификацию изолята «Кемеровский-96» с вирусом РРСС осуществляли также при помощи реакции иммуноферментного анализа (ИФА) и непрямой реакции иммунофлюоресценции (НРИФ) с использованием сывороток крови свиней, иммунизированных вирусом РРСС прототипного европейского штамма Lelystad.
Отсутствие вирусной контаминации было также подтверждено при исследовании парных сывороток крови подсвинков, иммунизированных вирусом изолята «Кемеровский-96». Через 21-28 дней после начала опыта у подсвинков наблюдали прирост антител только к вирусу РРСС. Не было отмечено прироста специфических антител к вирусам КЧС, ТГЭС, ПВИС, гриппа свиней и болезни Ауески.
Вируссодержащую культуральную суспензию периодически высевали на питательные среды, используемые для выращивания бактерий: тиогликолевую, Китта-Тарроци, жидкую среду Сабуро, МПБ, МПА, сахарный бульон и агар, затем инкубировали при различных температурных режимах (от 22 до 37С) в течение двух недель. Ежедневный визуальный осмотр не выявил наличия бактериальной или грибковой контаминации.
![Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней [Электронный ресурс]](/i/i/4361/178845.png "Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней [Электронный ресурс] Воробьева Ирина Валерьевна")
