Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 12-56
1.1. Характеристика вируса классической чумы свиней 12-29
1.1.1 Морфология и физические свойства 12-16
1.1.2 Классификация 16
1.1.3 Патогенез и патология 16-20
1.1.4 Культивирование 20-21
1.1.5 Эпизоотология 21-24
1.1.6 Иммунитет и вакцинация 24-25
1.1.7 Меры борьбы и профилактики 25-27
1.1.8 Диагностика 27-29
1.2 Характеристика вируса репродуктивно респираторного синдрома свиней - 30-47
1.2.1 Морфология и физические свойства 32-36
1.2.2 Классификация 36
1.2.3 Патогенез и патология 36-39
1.2.4 Культивирование 39
1.2.5 Эпизоотология 40-41
1.2.6 Иммунитет 41
1.2.7 Меры борьбы и профилактики 41-45
1.2.8 Диагностика . ( 45-47
1.3 Филогенетический анализ 47-54
1.3.1 Генетическая вариабельность и классификация изолятов вируса КЧС 48-51
1.3.2 Генетическая вариабельность и классификация изолятов вируса РРСС 51-54
1.4 Заключение по литературному обзору 55-56
II. Материалы и методы исследования 57-68
2.1 Материалы 57-61
2.1.1 Штаммы и изоляты вирусов КЧС и РРСС и культуры 57-58 клеток
2.1.2 Химические реагенты 59
2.1.3 Реагенты и наборы для молекулярной биологии 59-60
2.1.4 Оборудование 60-61
2.2 Методы I 61-
2.2.1 Культивирование 61
2.2.2 Выделение РНК из культуры клеток 61 -63
2.2.3 Проведение ОТ-ПЦР 63-66
2.2.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле 66
2.2.5 Очистка ПЦР-фрагментов при помощи набора дляочистки ПЦР-продуктов (Promega).. 66
2.2.6 Подготовка ПЦР-фрагментов для секвенированияметодом гель-электрофореза и очистки при помощи наборов для выделения из геля (Prbmega и QIAGEN). 66
2.2.7 Подготовка ПЦР-фрагментов для секвенирования методом очистки в агарозном геле при помощи Nal 66-61
2.2.8 Рестрикция 67
2.2.8 Определение первичных нуклеотидныхпоследовательностей 67-68
2.2.9 Компьютерный анализ полученных первичныхнуклеотидных последовательностей и построение филогенетических дендрограмм 68
III. Результаты 69-89
3.1 Разработка метода дифференциации вакцинного и вирулентных (полевых) штаммов вируса КЧС 69-73
3.1.1 Результаты сравнительного рестриктазного I картирования генома вакцинного штамма КС 70-71
3.1.2 Идентификация вакцинного штамма КС и его дифференциация от референтных штаммов и полевых изолятов71-73
3.2 Филогенетическая характеристика полевых изолятов вируса КЧС, циркулирующих на территории России, и сравнение их со штаммом КС 73-80
3.2.1 Филогенетическая характеристика вакцинного штамма КС вируса КЧС
3.2.2 Филогенетическая характеристика российских полевых изолятов вируса КЧС 74-80
3.3 Разработка метода выявления генома вируса РРСС помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с 80-84
3.4 Изучение распространения вируса РРСС на территории России и Белоруссии при помощи метода ОТ-ПЦР с дифференцирующей системой праймеров 85-87
3.5 Филогенетическая характеристика полевых изолятов вируса РРСС, циркулирующих на территории России и Белоруссии 87-89
Обсуждение 90-101
Выводы 102
Список литературы 104-121
- Характеристика вируса репродуктивно респираторного синдрома свиней
- Филогенетический анализ
- Подготовка ПЦР-фрагментов для секвенирования методом очистки в агарозном геле при помощи Nal
- Филогенетическая характеристика полевых изолятов вируса КЧС, циркулирующих на территории России, и сравнение их со штаммом КС
Введение к работе
В настоящее время классическая чума свиней и репродуктивно-респираторный синдром свиней - заболевания, часто регистрируемые на территории России (и ряда других ( стран) и приносящие серьезный экономический ущерб промышленному свиноводству. Проблема контроля распространения данных вирусов актуальна как для стран, свободных от этих болезней, так и для стран, где по-прежнему регистрируются вспышки данных заболеваний. Разработка надежных современных средств диагностики и профилактики - важная задача на пути борьбы с распространением возбудителей данных заболеваний и понимания механизмов их эволюционного развития.
Вирус классической чумы свиней (КЧС) вызывает заболевание, приносящее значительные экономические потери свиноводческой промышленности. Характерными признаками заболевания являются лихорадка, нервные нарушения, геморрагические явления, высокий уровень смертности. Этиологический агент, вызывающий КЧС, наряду с вирусами диареи крупного рогатого скота и пограничной болезни овец принадлежит к роду Pestivirus семейства Flaviviridae.
Поголовная вакцинация живой вакциной против КЧС практикуется в ряде стран (в том числе и в России). Это осложняет выявление инфицированных животных серологическими методами, т.к. большинство животных серопозитивны. Различные) варианты полимеразнои цепной реакции (ПЦР) для обнаружения пестивирусов в целом и для специфичного определения вируса КЧС не обеспечивают возможности дискриминации между вирулентными изолятами и вакцинными штаммами КС и ЛК-ВНИИВВиМ, применяемыми на территории России.
В соответствии с эпизоотологической важностью и затруднениями в диагностике КЧС возникла потребность в разработке новейших методов быстрой детекции, идентификации и классификации вирусов.
Филогенетический анализ позволяет оценить степень эволюционного родства между различными штаммами вируса КЧС, выяснять происхождение вспышек и изучать эволюцию вирусов.
Большая коллекция изолятов вируса КЧС со всего мира собрана в Ганновере в Референтной Европейской Лаборатории по КЧС. Используя материалы данной коллекции, мы получили возможность дать наиболее полную филогенетическую характеристику изолятам с территории России и определить эволюционную' дистанцию между ними и известными референтными штаммами, а также оценить возможность того, что российские полевые изоляты могли служить причиной обширных эпизоотии КЧС 1997 на территории стран Евросоюза.
Репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС) - вирусная болезнь, характеризующаяся наличием двух клинических форм: репродуктивных нарушений, у взрослых свиней и пневмонии с высоким уровнем смертности у молодых поросят. Репродуктивные проблемы у свиноматок проявляются в наличии поздних абортов, преждевременных опоросов, рождении слабых^ недоразвитых и мертворожденных поросят. Респираторные симптомы представлены выраженными дыхательными затруднениями, лихорадкой и интерстициальной пневмонией у новорожденных поросят.
Возбудитель болезни - вирус, который в настоящее время отнесен к
роду Arterivirus семейства Arteriviridae в порядке Nidovirales. Впервые
этиологическую роль его в возникновении РРСС доказали в 1991
голландские ученые из Центрального ветеринарного института г. Лелистада.
РРСС был впервые обнаружен в 1986-1987 годах в племенных хозяйствах
I США и Канады, а в 90-е годы его появление зафиксировали во многих
странах Европы, Южной Америки и Азии и в России. Быстрое
распространение РРСС нанесло (и продолжает наносить) огромные убытки
свиноводству разных стран, и экономический ущерб от него занял одно из
первых мест по сравнению с другими болезнями.
В настоящее время выделяют д^а генетических типа вируса РРСС: американский и европейский, отличающихся нуклеотидной и аминокислотной последовательностями. Из-за высокой генетической изменчивости полного антигенного перекреста в серологических реакциях между ними не существует.
Диагностика болезни основывается на эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных и результатах лабораторных исследований по изоляции и идентификации возбудителя, а также по выявлению специфических антител в сыворотке крови. Идентификация возбудителя РРСС осуществляется (при помощи культивирования в первичной культуре альвеолярных макрофагов поросенка с последующим иммунохимическим окрашиванием зараженных клеток мечеными моноклональными антителами, что занимает много времени и является трудоемким методом. По литературным данным ПЦР является надежным и высокоспецифичным методом прямого обнаружения генома возбудителя РРСС и выявления случаев носительства. В России до сих пор отсутствовали средства для диагностики и эпизоотического мониторинга РРСС, а данные о характеристиках вирусных изолятов недостаточны, хотя и свидетельствуют о циркуляции вируса РРСС ; преимущественно европейского типа. Для понимания современной ситуации необходимо при помощи молекулярных методов провести исследование распространенности вируса РРСС и создать систему типирования изолятов с использованием молекулярных методов, полученных из различных краев и областей РФ и Белоруссии.
Таким образом, очевидна актуальность разработки комплекса мер для
выявления вируса РРСС, циркулирующего на территории России,
определения его принадлежности к тому или иному генетическому типу,
выяснения путей его попадания в хозяйства и предотвращения его
дальнейшего распространения. I
Данная работа объединяет разработку современных методов для быстрого обнаружения, идентификации и классификации возбудителей двух
наиболее экономически и эпизоотологически значимых заболеваний свиней: вируса классической чумы и вируса репродуктивного и респираторного синдрома.
Характеристика вируса репродуктивно респираторного синдрома свиней
Терпстра (Terpstra, 1988) отмечает, что в замкнутых хозяйствах современного типа человек является основным фактором, осуществляющим механический перенос вируса от стада к стаду, тогда как в хозяйствах с небольшим поголовьем свиней ответственность несет транспорт и ввоз инфицированных свиней. Необходимо проводить вирусологическое и серологическое обследование для подтверждения или исключения возможности заражения скрытой инфекцией свиноферм, занимающихся разведением свиней (Vannier et al., 1986). Вирусоносительство. Вирусоносительство и вирусовыделение у свиней после серовакцинации, перенесших подострую и al., 1992). Наиболее характерным для РРСС является широкое разнообразие клинических проявлений с подострым протеканием инфекции. Системные признаки включают: смерть (особенно во время острой фазы заболевания), анорексию, агалактию, пирексию, летаргию, изменения окраски кожи. Рядом исследователей были также описаны бесплодие и нарушения полового цикла свиноматок (Hopper et.al. 1992; Gordon 1992; Done et.al 1996).
Изоляты существенно различаются по вирулентности, и их антигенная и генетическая гетерогенность чрезвычайно высока. Американский и Европейский типы вируса РРСС представлены различными генотипами, причем изоляты американского типа весьма сильно различаются на генетическом уровне, а европейские очень консервативны и филогенетически близки друг к другу. В настоящее время РРСС регистрируется повсеместно и считается глобальным экономически значимым заболеванием (Meng, X., 2000). По морфологии вириона, геномной организации, стратегии репликации и антигенному составу вирус РРСС сильно напоминает прочие артеривирусы. Все артеривирусы инфицируют макрофаги и способны вызывать длительную бессимптомную инфекцию. Вирус очень изменчив внутри вида. Происхождение вируса РРСС неизвестно. Штаммы, обнаруженные в США, в большинстве своем антигенно очень сильно отличаются от таковых, найденных в Европейских странах!, хотя некоторые перекрестные серологические реакции между ними возможны. Генетические исследования также указывают на существенные различия между американским и европейским типами изолятов, включая делеции и точечные мутации в нуклеотидной последовательности. Недавние исследования показали присутствие изолятов европейского типа на территории США (Bautista, 1993b). Механизм, позволяющий артеривирусам избегать иммунного ответа организма хозяина, до сих пор неизвестен.
Нейтрализующие антитела обнаруживаются на первый-второй месяц после инфицирования и, похоже, не уменьшают виремию, а, напротив, усиливают инфекцию, увеличивая поглощение вирусных частиц макрофагами (Yoon et.al. 1996). Морфология и физические свойства I Вирион диаметром 40-65 нм содержит изометрический нуклеокапсид диаметром 20-35 нм. Его плавучая плотность в хлориде цезия - 1.19 г/мл. Вирус оболочечный и потому обладает чувствительностью к жировым растворителям. Кратковременная инкубация в неионном детергенте способствует выходу вирусного нуклеокапсида из оболочки. Геном представлен одиночной полиаденилированной цепью РНК, положительной полярности, размером 15 kb. З -конец генома полиаденилирован, на 5 -конце присутствует САР-структура. Из 8 перекрывающихся открытых рамок считывания (ORF) самыми большими I являются 1а и lb, кодирующие вирусную полимеразу, они занимают 80% генома. За ними следуют 6 ORF, кодирующих в основном структурные белки, которые транслируются с образованием субгеномных РНК. Перекрывание между ORF у штамма Lelystad от 1 п.о. (пар оснований) разделяющая ORF4 и ORF5. Кодирующая область генома ограничена 5 - и З -нетранслируемыми областями. Недавно были получены данные о том, что в геноме артеривирусов может быть еще один структурный ген. В районе между OPClb и ОРС2 вируса артрита лошадей была обнаружена дополнительная рамка считывания, кодирующая структурный белок из 67 аминокислот. Новая рамка считывания получила название ОРС2а, прежняя ОРС2 теперь называется OPC2b. Предполагают, что эквивалент ОРС2а может присутствовать и в геноме вируса РРСС (Snijder et.al. 1999). Для репликации вируса РРСС требуется образование как минимум 6 субгеномных мРНК. Эти субгеномные мРНК вместе с вирионной геномной РНК образуют формацию З -котерминальной гнездовой посадки. Каждая из этих субгеномных мРНК содержит общую 5 -лидерную последовательность, длиной около 200 п.о. (Meulenbufg et аІ., 1993а, b, 1997а; Meng et al., 1994, 1996b, Snijder and Meulenburg, 1998; Morozov et al., 1996; Allende et al., 1999). Участок РНК, соединяющий субгеномную мРНК с лидерной последовательностью, консервативен и состоит из 6 нуклеотидов - UCAACC.
Субгеномные мРНК моноцистронные, не упаковываются в вирион и являются трансляционно активными. Точный механизм трансляции и транскрипции не известен, хотя считается, что он сходен с таковым у коронавирусов. Широко известно о более высоком уровне вариабельности РНК содержащих вирусов из-за сниженной корректирующей активности ферментов во время репликации (Witte et al., 2000). Внутри одного организма, инфицированного РНК-содержащим вирусом, РНК существуют в виде популяции гетерогенных, хотя и близкородственных последовательностей, являющихся вариантами одной — доминантной - и появляющихся в результате мутаций и рекомбинаций. Такие последовательности называются квазивидами. Рекомбинации РНК являются мощным и эффективным инструментом, позволяющим вирусу адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды и избегать давления селективного отбора, что приводит к возникновению рекомбинантов, обладающих значительными эволюционными преимуществами. Недавно Yuan et al. (1999) обнаружил доказательства наличия рекомбинаций между гомологичными РНК вируса РРСС, при
Филогенетический анализ
Молекулярная эпидемиология изучает такие проблемы как сохранение возбудителя в природе, распространение инфекции, эволюция инфекционных болезней, возникновение "новых," патогенов и принципы классификации существующих и т. п. Конечной целью эпидемиологических исследований является ликвидация, сокращение или ограничение распространения инфекционных болезней. Филогенетический анализ является одним из основных подходов в молекулярной эпидемиологии, позволяющим определить степень родства между полевыми изолятами, выделенными во время различных вспышек, и референтными штаммами. Генетическую и антигенную вариабельность вирусов изучают методом частичного секвенирования определенных фрагментов геномов и аминокислотных последовательностей различных цирусных изолятов и сравнения их с рядом наиболее известных референтных штаммов, нуклеотидные и аминокислотные последовательности которых расшифрованы полностью. Надежность данного метода проявляется в том, что результаты, получаемые при секвенировании разных фрагментов геномов, очень сходны между собой.
Типирование с моноклональными антителами и частичное секвенирование показало, что изоляты вируса КЧС могут быть отнесены в разные группы и подгруппы (Paton et al., 2000; Lowings et al., 1996). Возможность различать между собой изоляты необходима для того, чтобы иметь возможность изучать распространение вспышек и эволюцию вируса.
Для вируса КЧС была разработана система молекулярного типирования и распределения изолятов по 3 основным филогенетическим группам, на основании секвёнирования 3 различных фрагментов генома и сранения полученных результатов с данными о наиболее хорошо изученных референтных штаммах вируса КЧС. Референтными штаммами являются: Alfort 187, Alfort Tubingen, Brescia, CAP, Glentorf, ALD, GPE-, Chinese, C-strain, Riems, P97, Kanagawa, для них полностью расшифрованы первичные нуклеотидные последовательности (информация доступна через интернет) и хорошо изучена структурно-функциональная организация. В связи с появлением современной капиллярной технологии секвёнирования, обладающей значительной пропускной способностью, процедура проведения полноразмерного геномного секвёнирования стала требовать минимального количества времени и трудозатрат. Поэтому в настоящее время полностью определена структура геномов для сотен изолятов вируса КЧС, информация по частичному секвенированию фрагментов геномов вируса КЧС представлена чрезвычайно широко и доступна через интернет.
Для вируса КЧС сравнительное секвенирование проводят по 3 фрагментам генома: из 5 нетрацслируемой области (NTR) (Hofmann et al., 1994; Greiser-Wilke et al., 1998; Becher et al., 1999), 5 вариабельной области гена поверхностного гликопротеина Е2 (Lowings et al., 1996; Vilcek et al., 1996; Becher et al., 1999; Parchariyanon et al., 2000) и неструктурного гена NS5B (Bjorklund et al., 1999). Сравнительный анализ на основе последовательности гена Е2 показал наличие 2 главных филогенетических групп, что говорит об очевидном наличии двух предков, от которых произошло все разнообразие существующих ныне изолятов. Проведенныйфилогенетический анализ изолятов с разйых континентов позволил выделить 3 филогенетические группы (Paton et al., 2000), причем изоляты, принадлежащие 3 группе, встречаются только в Азии. Начиная с 1990 года, все проверенные изоляты с европейской части материка принадлежат одной из 3 подгрупп 2 группы (2.1, 2.2, 2.3), в то время как выделенные ранее изоляты отнесены к 1 группе (Moennig, V.,2003). Два наиболее вариабельных гена в геноме вируса КЧС Е2 и NS2, в то время как область высокой гомологии включает 5 NTR и ген NS3. Сравнение последовательностей 5 NTR генома пестивирусов позволило распределить изоляты по подгруппам, соответствующим таковым, полученным при типировании с МАт.
Группа I, представляемая штаммом Brescia, состоит из давно охарактеризованных и сравнительно недавно выделенных Американских и Азиатских штаммов, а также английиских штаммов 1950-х гг. Эта группа подразделяется на две подгруппы. Группа II, представляемая штаммом Alfortl87, состоит из недавно выделенных Европейских изолятов, наряду со штаммом Osaka, который был выделен в Японии от свиней европейского происхождения. Основываясь на генетических различиях, группа была подразделена на 2 подгруппы. Изоляты из Малой Азии входят в обе подгруппы, что говорит о множественном происхождении современных вспышек в этой стране. Все 10 проверенных вакцинных штаммов были отнесены к группе I, что предполагает наличие общего предшественника. Японский штамм Kanagawa, выделенный в 1974 году, и штамм British Congenital Tremor (1964 года) - наиболее обособленные варианты вируса КЧС.
Эпизоотия КЧС случилась на территории ряда стран Европейского сообщества в 1997, начавшись со вспышки в Германии, далее она распространилась на Нидерланды (Terfpstra, С, and A.J. de Smit, 2000), Италию, Испанию и Бельгию. Молекулярное типирование показало принадлежность вируса к группе 2. Было отмечено, что это новый заносвируса на территорию стран Евросоюза, так как он не обнаруживался там с 1993 года. В 2000 году была зафиксирована вспышка КЧС в Англии (Paton, 2002).В странах Евросоюза применяются различные стратегии для искоренения КЧС среди домашних и диких свиней. Для домашних свиней строго придерживаются политики «невакцинирования» и поголовного убоя инфицированных животных, а вот для диких кабанов оральная иммунизация сочетается с выборочным отстрелом. Предварительные исследования показали недостаточную чувствительность и специфичность имеющихся
Подготовка ПЦР-фрагментов для секвенирования методом очистки в агарозном геле при помощи Nal
Выделение проводилось согласно методикам производителей. Выделенный фрагмент ДНК использовали для секвенирования и для рестрикции. 1. Для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля наносили по 30-100 мкл ПЦР продуктов или по 20 мкл плазмидной ДНК. Электрофорез проводили при описанных выше условиях. Затем вырезали фрагмент геля, содержащий ДНК, используя трансиллюминатор с ультрафиолетовым светом с длинной волны 254 нм. 2. Вырезанные фрагменты . агаррзы с ДНК помещали в микроцентрифужные пробирки, затем к ним добавляли 0.9 мл Nal и инкубировали при 37С до полного растворения агарозы. 3. Затем в пробирки добавляли 5-10 мкл сорбента (glassmilk), тщательно размешивали и инкубировали в течение 0.5-16 часов при периодическом помешивании. 4. Затем центрифугировали 30 секунд, при 13000 об/мин, удаляли надосадок. 5. Промывали осадок 75% этанолом и, не подсушивая, элюировали ДНК с сорбента (glassmilk) 1ХТЕ. . / 6. Концентрацию выделенного фрагмента ДНК определяли методом гель-электрофореза при стандартных условиях. 7. Выделенный фрагмент ДНК использовали для секвенирования или для рестрикции. анализа реакция проводилась в конечном объеме 20 мкл. Реакционная смесь содержала 5-10 мкл очищенного амплификата, 1 мкл рестриктазы,. 2 мкл, соответствующего 1
Ох буфера (для рестриктазы Bgll - React2 (Gibco BRL); Kpnl, PstI "One For All" (Pharmacia)). Объем доводили водой до 20 мкл. Реакция инкубировалась 1 час, при 37 С. Для секвенирования по двум цепям использовали те же праймеры, что и для проведения ПНР. Для определения первичной нуклеотидной последовательности были использованы автоматические машины ABI Prism, принцип действия которых заключался во встраивании флуоресцентно меченных дидезоксинуклеотидов, терминирующих синтез цепи. Для анализа полученных первичных нуклеотидных последовательностей был использован пакет программ CLUSTAL software (Stadejek et al., 1997). Филогенетические деревья были построены при помощи пакета компьютерных программ PHYLIP (Stadejek et al., 1996), для определения степени филогенетического родства был выбран метод NEIGHBOR-JOINING (Felsenstein, 1989; Vilcek et al., 1996). Дифференцирующий метод основан на различиях в первичных структурах геномов вакцинного штамма КС и вирулентных изолятов. Ранее в нашей лаборатории геном вакцинного штамма КС был секвенирован и сравнен с другими сиквенсами геномов рефернетных штаммов вируса КЧС из генбанка (Гребенникова с соавт., 1998, 1999). В геноме вакцинного штамма были обнаружены уникальные сайты рестрикции. Чтобы выявить вакцинный штамм, мы разработали метод, основанный на проведении ОТ ПЦР определенных участков генома, несущих маркерные рестриктные сайты, и последующей обработкой ПЦР-продуктов соответствующими рестриктазами. Теоретическая основа, позволяющая разработку подобного метода, состоит в следующем. В процессе эволюции происходит накопление случайных мутаций в вирусном геноме.
Эти мутации (в случае их безвредности для вирусного метаболизма) прочно закрепляются в потомстве и служат надежным генеалогическим свидетельством о происхождении каждого вновь выделенного изолята вируса КЧС. Все до сих пор известные изоляты вируса КЧС по международной классификации разбиты на несколько групп и подгрупп, в каждой из которых есть наиболее хорошо изученные референтные штаммы. Известна подробная информация о молекулярной структуре геномов референтных штаммов. Сравнение первичной структуры геномов всех известных штаммов и вакцинного штамма КС позволяет выявить десятки нуклеотидных замен, уникальных для вакцинного штамма. С этой точки зрения возможность идентификации вакцинного штамма методом, сиквенса его генома не вызывает сомнений. Уникальные нуклеотидные замены в вакцинном штамме могут попасть на активный (или мутантный) рестриктный сайт, что может привести к его подавлению (или восстановлению). Для штамма КС найдено 16 таких сайтов. Из данных, приведенных в -таблице 8j следует, что в 18 случаях геном вируса КС имеет уникальные рестриктные характеристики по сравнению с практически всеми известными генотипами. В 2 случаях (строки 7 и 11 в I табл. 2) штамм Р97 имеет сходство со штаммом КС. Это сходство, однако, не следует из их эволюционной близости, т.к. штамм Р97 вообще не относится к группе 1 по европейской классификации. В 16 случаях штамм КС имеет уникальные рестриктные характеристики. Вероятность того, что представители известных и охарактеризованных филогенетических групп (на основании которых разрабатывался тест) вдруг получат случайные мутации, приводящие к изменению хотя бы 2 или 3 сайтов рестрикции, так, как они изменены у штамма КС, исчезающе мала. Эти расчеты (не приводятся) основаны на высокой генетической стабильности вируса КЧС. I Таким образом, теоретически, 16 маркерных сайтов, найденных в штамме КС гарантируют его идентификацию среди представителей всех известных генетических групп. В случае если вирулентный изолят будет иметь сходнуб рестриктную карту с вакцинным штаммом, следует предположить, что такой изолят произошел из вакцинного штамма. Для того чтобы оценить возможность подобного события, мы в настоящей работе предприняли попытку филогенетической характеристики вакцинного штамма КС и российских полевых изолятов вируса КЧС, а также проанализировали результаты филогенетического анализа вируса КЧС российских и зарубежных авторов.
Филогенетическая характеристика полевых изолятов вируса КЧС, циркулирующих на территории России, и сравнение их со штаммом КС
Положение вакцинного штамма КС на основании приведенных данных следующее: по европейской классификации он относится к группе 1, подгруппе 1.2, в которой основным референтным штаммом служит штамм Brescia. - В соответствии с молекулярно-эпидемиологическими исследованиями (Vilcek et al., 1996) вакцинный штамм LK также принадлежит группе 1, подгруппе 1.2 вместе со штаммом Brescia. Эти результаты были получены на основании секвенирования фрагментов из 254 и 207 нуклеотидных пар, принадлежащих вариабельным областям гена Е2 и гена полимеразы соответственно. Сравнение полноразмерных последовательностей геномов подтвердило принадлежность штамма КС к группе 1.2. Рис 6. Филогенетическое родство штамма КС с другими референтными штаммами. 3.2.2 Филогенетическая характеристика российских полевых изолятов вирус КЧС. Фрагмент в 190 нуклеотидных пар, соответствующий вариабельному 5 -концевому участку гена Е2 был амплифицирован у 32 полевых изолятов при помощи гнездовой системы праймеров E2F(out)-E2R(out) и E2F(inn)-E2R(inn). При помощи праймеров CSFV UP-1 и CSF R411 был амплифицирован фрагмент размером 200 нуклеотидных пар из 5 нетранслируемой области для 29 полевых изолятов. При помощи праймеров S1 и S2 был амплифицирован фрагмент в 327 нуклеотидных пар последовательности гена NS5B для 17 полевых изолятов. Соответствующие фрагменты генома были амплифицированы также и для 3 аттенуированных штаммов вируса КЧС (КС, ЛК-ВНИИВВиМ и 238Н). В исследование также были включены два высоковируленетных штамма-пробойника Ши-Мынь (EMBL) и Ши-Мынь (ВГНКИ), применяющиеся для определения эффективности вакцинации. Для штамма Ши-Мынь (EMBL) были амплифицированы все три целевых фрагмента, а для штамма Ши-Мынь (ВГНКИ) был амплифицирован только фрагмент в
Все полученные ПЦР-продукты были очищены методом гель-электрофореза были секвенированы и на основании анализа полученных данных и сравнения их с сиквенсами ряда известных референтных штаммов были построены 3 филогенетических дерева. Филогенетическое положение российских изолятов вируса КЧС показано на рисунках ниже (рис. 8-11). Все они попадают в группу 1, подгруппу 1.1, представителем которой являются референтные штаммьі Alfort 187, ALD, Glentorf. Географическое распространение изолятов вируса КЧС показано в таблице в разделе і "материалы и методы". При сравнении первичных нуклеотидных последовательностей в областях 5 NTR и NS5B изолята 238Н и штамма Ши-Мынь была обнаружена 100% гомологичность. Основываясь на сравнении последовательностей гена Е2 полевых изолятов вируса КЧС с референтными также видно, что они принадлежат к подгруппе 1.1, образуя 2 кластера: Ши-Мынь (включающий в себя 25 в 1945 году и использовался в России в течение 30 лет как штамм-пробойник для проверки становления иммунитета при вакцинации. Он также попадает в подгруппу 1.1 и, вероятно, имеет отношение к разнообразию генотипов вируса КЧС, представленных на территории России. Ранее в нашей лаборатории при сравнении последовательностей области гена Е2 штамма Ши-Мынь (EMBL) и штамма Ши-Мынь (ВГНКИ) было обнаружено, наличие большого количества нуклеотидных замен, говорящих, возможно, о том, что это 2 разных высоковирулентных штамма.
В данных исследованиях мы провели аналогичное сравнение по области гена NS5B, подтвердив предположение о том, что в России для проверки напряженности иммунитета применяются 2 различных, хотя и близкородственных, штамма. Несмотря на широкий географический разброс, проверенные полевые изоляты демонстрируют тесное генетическое родство. Изоляты, проанализированные в настоящей работе, выделены примерно 1994-1999 гг., когда в России отмечалось повышенное количество вспышек КЧС. Из филогенетической картины, представленной на рисунке, видно, что эти вспышки вызваны, хотя и близкородственными, но разными штаммами. Только изоляты 712 и 714, выделенные в Пермской и Липецкой областях, по-видимому, идентичны. Вероятно, одна из этих вспышек привела к другой в результате заноса вирусного возбудителя. Ни результаты, полученные в настоящих исследованиях, ни результаты отечественных исследователей (Bezborodova et al., 1999) не показали наличия ни одного изолята, эволюционно близкого к вакцинным штаммам КС и ЛК-ВНИИВВиМ (Vlasova et al., 2003). Таким образом, несмотря на то, что данные вакцины применялись в Российской Федерации на протяжении более чем 30 лет, не обнаружено признаков из .реверсии к дикому типу. Это еще раз доказывает их безопасность и обоснованность применения на территории нашей страны. Результатом проведённых исследований является наличие чувствительной и надежной системы для быстрого обнаружения, дифференциации и молекулярного типирования различных штаммов вируса КЧС, которая является необходимым инструментом при наблюдении за циркуляцией и эволюцией вируса КЧС. В ходе работы по разработке системы для выявления генома вирусов РРСС можно выделить следующие этапы: 1. Подбор специфических праймеров для детекции РНК американского и европейского типов вируса РРСС. 2. Подбор и оптимизация условий проведения ПНР на референтных штаммах NADC-8 (американский тип) и Lelystad (европейский тип) вируса РРСС. 3. Определение чувствительности системы детекции РНК вируса РРСС I методом ПЦР. 4. Проверка специфичности системы детекции РНК вируса РРСС методом ПЦР. 5.
Проведение широких производственных и комиссионных испытаний; применение разработанного метода для скрининга большого количества полевых изолятов. Набор специфических праймеров был разработан на основе опубликованных первичных последовательностей геномов референтных I штаммов VR-2332 и Lelystad. Праймеры были подобраны на область ORF7, т.к. она является наиболее консервативной в геноме вируса РРСС. При помощи компьютерных программ (Amplify 1.0, Oligo 4.0-s - Macintosh) данные праймеры были проверены на специфичность и универсальность со всеми известными референтными штаммами вируса РРСС американского и европейского типа, последовательности которых были получены из Генбанка. Для повышения чувствительности была разработана «гнездовая» система праймеров, с двумя парами внутренних праймеров. Ввиду того, что уровень гомологии между геномами двух типов вируса составляет всего 50 I 80%, оказалось легче подобрать типоспецифичные праймеры. Две пары
