Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Патогенез БП 13
1.1.1. Клиническая характеристика БП 13
1.1.2. Нейрогистологическая характеристика БП 15
1.1.3. Спорадические и семейные формы БП 17
1.2.Гипотетические молекулярные механизмы гибели дофаминергических нейронов при БП 24
1.3. Альфа-синуклеин в патогенезе БП 27
1.3.1. Моногенные формы БП, обусловленные мутациями в гене SNCA 27
1.3.2. Модели БП на основе экзогенной экспрессии альфа синуклеина 29
1.3.3. Агрегация альфа-синуклеина 34
1.3.4. Химические модификации альфа-синуклеина 39
1.4. Обогащенная лейциновыми повторами киназа 2 (LRRK2) и БП 40
1.4.1. Мутации в гене LRRK2 и их распространенность 40
1.4.2. Функции LRRK2 и влияние мутаций в гене LRRK2 на активность белка 42
1.4.3 Нейрогистологическая картина мозга пациентов БП с мутациями в гене LRRK2 48
1.5. Лимфоциты периферической крови как объект исследования при изучении патогенеза нейродегенеративных заболеваний 49
Глава 2. Материалы и методы 54
2.1. Характеристика обследованных групп 54
2.2. Выделение ДНК из периферической крови человека 55
2.3. Идентификация мутаций G6055A (G2019S), С4321Т (R1441C),T4838C(V1613A) 56
2.3.1 Идентификация мутации G6055A (G2019S) 56
2.3.2 Идентификация мутации C4321T(R1441С) 58
2.3.3 Идентификация мутации T4838C(V1613A) 2.4. Метод «дозы гена» для определения мультипликаций гена SNCA 61
2.5. Выделение фракции лимфоцитов периферической крови 64
2.6. Оценка уровня мРНК гена SNCA 64
2.7. Измерение уровня белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови 67
2.8. Статистическая обработка данных 69
Глава 3. Результаты и обсуждение 70
3.1. Выявление пациентов с /лК/?АТ2-ассоциированной БП
3.2. Оценка мультипликаций гена SNCA 77
3.3. Измерение уровня мРНК гена SNCA в лимфоцитах периферической крови исследуемых групп 78
3.4. Измерение уровня белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови 81
3.5. Влияние клинических характеристик на уровень мРНК гена SNCA и белка альфа-синуклеина 88
3.5.1. Пол 88
3.5.2. Возраст 89
3.5.3. Возраст начала и длительность заболевания 90
3.5.4. Приём Л-ДОФА-содержащих препаратов 93
Заключение 95
Выводы 96
Список литературы 97
- Моногенные формы БП, обусловленные мутациями в гене SNCA
- Нейрогистологическая картина мозга пациентов БП с мутациями в гене LRRK2
- Измерение уровня белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови
- Измерение уровня мРНК гена SNCA в лимфоцитах периферической крови исследуемых групп
Введение к работе
Актуальность проблемы
Болезнь Паркинсона (БП) является распространенным
нейродегенеративным заболеванием среди лиц среднего и пожилого возрастов. Частота встречаемости данного заболевания среди лиц старше 60 лет составляет 1-2 % (Brooks et al, 2002). Развитие симптомов (ригидность мускулатуры, тремор, брадикинезия, нарушение позы) коррелирует с гибелью дофаминергических нейронов черной субстанции (ЧС) мозга, приводя к снижению концентрации дофамина в полосатом теле. Следует отметить, что симптомы БП проявляются при гибели 50-80 % дофаминергических нейронов ЧС мозга человека. Механизм гибели дофаминергических нейронов ЧС при БП остаётся неясным. По этой причине не существует лабораторных диагностических тестов БП и доля случаев неправильной постановки диагноза достигает 25 % (Bennett et al, 1996; Bower et al, 2002). Выяснение механизма гибели дофаминергических нейронов при БП является важной задачей не только для понимания общего патогенеза заболевания, но и для разработки превентивной терапии. При этом важным подходом для изучения молекулярно-генетических основ БП представляется исследование моногенных форм заболевания с известной этиологией.
Семейные формы БП составляют 10-15 % всех случаев БП (Gasser et.al, 2007). В настоящее время описано шесть генов, мутации в которых приводят к развитию наследственных форм БП (Lesage et al, 2009). Наиболее частой причиной развития наследственных форм БП являются мутации в гене обогащенной лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2), приводящие к аутосомно-доминантной форме заболевания (Farrer et al, 2006). Шесть мутаций в гене LRRK2 в настоящее время признаны определенно патогенными: G6055A (G2019S), С4321Т (R1441C), C4321G (R1441G), G4322A (R1441H), A5096G (Y1699C) и Т6059С (I2020T), из которых наиболее распространенной является мутация G6055A (G2019S) (85 % от всех 1і?і?іС?-ассоциированньіх случаев БП). На втором месте по частоте выявления - мутация С4321Т (R1441С) (около 10 %) (Giasson et al., 2008). В зависимости от популяции G6055A (G2019S)-ассоциированная БП встречается в 5-40 % случаев семейной БП (Di Fonzo et al, 2005). В Европе мутация G6055A (G2019S) выявляется также в 1 % случаев спорадической БП (Giasson etal, 2008).
Ранее нами было показано, что частота І,і?і?іС?-ассоциированной БП среди пациентов с семейной формой БП в северо-западном регионе России составляет 6%. В пяти семьях была выявлена G6055A (G2019S)-ассоциированная БП, в одной семье описана новая мутация Т4838С (V1613A), приводящая к развитию БП с преобладающим тремором (Иванова, 2008). Выявление /,і?і?іС?-ассоциированной БП впервые дает возможность создания репрезентативной группы пациентов с однородной этиологией БП. Такая группа пациентов может быть использована как для исследования молекулярных механизмов развития БП, так и для выявления биомаркеров развития более общих форм заболевания.
В настоящее время считается, что в основе молекулярных механизмов БП лежит нарушение фолдинга и полимеризация белка альфа-синуклеина (ген
SNCA) (Singleton et al, 2005; Cookson, van der Brug, 2008). Альфа-синуклеин является основным компонентом телец Леви, как при наследственных, так и при спорадических формах БП (сБП) (Spillantini et al, 1997; Hasegawa et al, 2006; Periquet et al., 2007). Точечные мутации в гене SNCA (Polymeropoulos et al, 1997; Conway et al, 1998; Fredenburg et al, 2007), а также дупликация и трипликация гена SNCA приводят к развитию наследственных форм БП (Miller et al, 2004); нейротоксичность агрегатов альфа-синуклеина была многократно продемонстрирована in vitro, а также на трансгенных животных (мыши и дрозофила) (Conway et al, 1998; Waxman et al, 2008; Feany et al, 2000). Известно, что фосфориллирование альфа-синуклеина повышает его нейротоксичность (Anderson et al, 2006).
В большинстве случаев при 1і?і?іС?-ассоциированной БП наблюдается классическая картина нейродегенерации с формированием телец Леви (Hernandez et al, 2005), в которых LRRK2 обнаруживается наряду с альфа-синуклеином (Perry et al, 2008). Показано, что мутация G6055A (G2019S) приводит к повышению киназной активности LRRK2 (Jaleel et al, 2007). При этом физиологические субстраты LRRK2 и механизмы, лежащие в основе развития БП при мутациях в гене LRRK2, остаются неизвестными. Неизвестно также, оказывают ли влияние мутации гена LRRK2 на метаболизм альфа-синуклеина.
Изложенные выше данные явились основанием для проведения настоящего исследования.
Цель исследования
Исследование уровня белка альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA в лимфоцитах периферической крови у пациентов с 1і?і?іС?-ассоциированной БП.
Задачи исследования
Определение частоты мутаций G6055A (G2019S), С4321Т (R1441C), Т4838С (V1613A) гена LRRK2 у пациентов с БП в северо-западном регионе России.
Анализ уровня белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с 1і?і?іС?-ассоциированной БП, у пациентов со спорадической БП и лиц с отсутствием неврологических заболеваний.
Оценка влияния возраста, пола и приема Л-ДОФА-содержащих препаратов на уровень белка альфа-синуклеина в исследуемых группах.
Анализ уровня мРНК гена SNCA лимфоцитов периферической крови у пациентов с /,і?і?іС?-ассоциированной БП, у пациентов со спорадической БП и лиц с отсутствием неврологических заболеваний.
Оценка влияния возраста, пола и приема Л-ДОФА-со держащих препаратов на уровень мРНК гена SNCA в исследуемых группах.
Научная новизна
Впервые у пациентов с 1і?і?іС?-ассоциированной формой БП проведено исследование уровня белка альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA лимфоцитов периферической крови. Впервые показано снижение уровня
белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с 1і?і?іС?-ассоциированной БИ по сравнению с группой пациентов со спорадической БП и контролем. Впервые оценено влияние возраста, пола, возраста начала заболевания, длительности заболевания, приема Л-ДОФА-содержащих препаратов на уровень мРНК и альфа-синуклеина среди пациентов с БИ в России.
Практическая значимость работы
Изучение механизма нейродегенерации при моногенных формах БИ, в частности при 1і?і?іС?-ассоциированной форме заболевания, позволит ближе подойти к пониманию патогенеза более распространенных спорадических форм БП. Полученные данные представляют интерес для понимания молекулярных основ патогенеза 1і?і?іС?-ассоциированной БП. Разработанный метод генотипирования наиболее распространенной среди семейных случаев БП мутации G6055A (G2019S) гена LRRK2 может быть использован в клинической практике при выявлении /,і?і?іС?-ассоциированньіх форм БП. Это позволит проводить ДНК-диагностику членов семей пациентов с данной формой заболевания и осуществлять постановку на учет к невропатологу носителей мутации до начала проявления клинических симптомов заболевания.
Основные положения, выносимые на защиту
Частота мутации G6055A (G2019S) гена LRRK2 выше среди пациентов с семейной формой БП (7 %), чем среди пациентов со спорадической формой заболевания (0,4 %). Частота мутации С4321Т (R1441C) среди спорадических случаев БП в северо-западном регионе России составляет 0,4 %.
Уровень белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови снижен в группе пациентов с /,і?і?іС?-ассоциированной БП по сравнению с пациентами со спорадической БП и лицами с отсутствием неврологических заболеваний.
Пациенты с ранней формой БП (начало до 50 лет) характеризуются высоким уровнем белка альфа-синуклеина по сравнению с пациентами с более поздним дебютом заболевания.
У лиц с отсутствием неврологических заболеваний наблюдается увеличение уровня мРНК гена SNCA с возрастом.
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации
Осмотр пациентов, забор у них периферической крови осуществлялся д.м.н., профессором А. Ф. Якимовским. Разработка методов ПЦР и рестрикционного анализа проведены совместно с О. Н. Ивановой. Скрининг мутаций в группе пациентов с БП выполнен автором лично. Измерение уровня белка альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA в лимфоцитах периферической крови пациентов с БП, обусловленной мутациями гена LRRK2, пациентов со сБП и в контроле проведены автором лично. Оценка мультипликаций гена SNCA была проведена автором лично. Автор провел статистический анализ
всех полученных данных и сформулировал выводы. Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно.
Апробация работы
Предложенные к защите результаты были доложены на конференции «Человек и здоровье-2007», Санкт-Петербургская медицинская академия им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербург (2007); европейской конференции по генетике человека, Ницца, Франция (2007); 12-м конгрессе европейской федерации неврологических ассоциаций, Мадрид, Испания (2008); I национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения, Москва (2008); V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва (2009); 9-й международной конференции по болезням Альцгеймера и Паркинсона, Прага, Чехия (2009); 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых учёных, Пущино (2010); VI съезде Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону (2010).
Публикации
Результаты диссертационной работы отражены в 20 печатных работах соискателя, в том числе опубликовано 6 статей, из них 4 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы (198 наименований). Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами, 26 рисунками и фотографиями.
Моногенные формы БП, обусловленные мутациями в гене SNCA
БП - хроническое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание ЦНС, связанное с гибелью нейронов ЧС и нарушением деятельности базальных ганглиев. Средний возраст начала заболевания составляет 55 лет.
По частоте встречаемости БП занимает второе место среди дегенеративных заболеваний ЦНС после болезни Альцгеймера. За последние десятилетие наблюдается неуклонный рост заболеваемости БП, а также "омоложение" заболевания: появились понятия "ранний паркинсонизм"- с дебютом заболевания 40-50 лет и "ювенильный "- 20- 40 лет (Illarioshkin et al., 2003).
В мире в настоящее время насчитывается 3,7 млн (0,06% населения) людей с БП (Крыжановский и др., 2002). В большинстве популяций частота паркинсонизма среди лиц старше 65 лет колеблется от 1,8 до 3,6% (Левин, Докадина, 2005). Эпидемиологические исследования, проведенные в России, показали, что в Санкт-Петербурге частота данного заболевания достигает 0,7% (Крыжановский и др., 2002). Среди всех больных БП 10-15 % имеют отягощенный семейный анамнез по данному заболеванию (Gasser et al., 2007).
Впервые симптомы заболевания были описаны Джеймсом Паркинсоном в 1817 году в его монографии "Essay on the Shaking Pasly". В 1874 году Шарко, изучающий психогенные аспекты болезни, предложил именовать данное заболевание "болезнью Паркинсона". В разработке представлений о патогенезе паркинсонизма большой вклад внес К.П.Третьяков, детально описавший морфологические признаки заболевания, при котором главная роль отводилась дегенерации нейронов ЧС. Кроме того, К.П. Третьяков обнаружил в цитоплазме нейронов ЧС концентрические включения и назвал их тельцами Леви в честь автора, впервые описавшего их еще в 1913 году.
После нейроморфологических работ К.П.Третьякова и пандемии летаргического энцефалита первоначальные представления о психогенной природе заболевания сменились на дегенеративно-постэнцефалическую теорию БП. Термин атеросклеротический паркинсонизм получил широкое распространение в литературе и врачебной практике в 1929 году.
Современная международная классификация паркинсонизма в сокращенном виде выглядит следующим образом:
Ряд авторов выделяет в первом пункте вышеуказанной классификации такие формы заболевания, как "ранний паркинсонизм" и "ювенильный паркинсонизм", семейные формы БП и спорадические формы БП. В дальнейшем будет идти речь только о БП ("первичный", идиопатический паркинсонизм).
Существенный прогресс в понимании патогенеза БП, достигнутый в последние годы, во многом обязан достижениям функциональной нейрохимии, благодаря которым была обоснована дофаминергическая концепция БП. Интенсивное изучение нейрохимических аспектов БП началось с 1960 года, когда выяснилось, что в базальных ганглиях пациентов с БП содержание дофамина существенно истощается. Было показано, что данные изменения обусловлены дегенеративным процессом в нейронах ЧС (Голубев и др., 2000). С тех пор усилия многих исследователей направлены на поиски методов и средств, которые позволили бы повысить содержание дофамина в ЦНС у этих больных.
К симптомам БП относят: повышенный тонус скелетной мускулатуры по экстрапирамидному типу, пониженную двигательную активность (брадикинезия), низкочастотный (4-8 Гц) тремор покоя конечностей и других частей тела, постуральную неустойчивость. К основным симптомам заболевания часто добавляются психические изменения, преимущественно эмоционально-мотивационных и когнитивных функций, вегетативные расстройства (по парасимпатическому типу): со стороны желудочно-кишечного тракта (запоры, диспепсии), сердечно-сосудистой системы (гипотония, брадикардия), кожных покровов (сальность, шелушение). В зависимости от преобладания в клинических проявлениях БП одного из компонентов классической триады симптомов определяется форма заболевания. Большинство авторов выделяют дрожательные, ригидные, смешанные и акинетические формы БП (Голубев и др., 2000).
Нейрогистологическая картина мозга пациентов БП с мутациями в гене LRRK2
В настоящее время доминирует гипотеза о том, что токсичны не сами фибриллы альфа-синуклеина, а некие интермедиаты, образующиеся в процессе их образования, называемые протофибриллами. Протофибриллы - маленькие олигомерные структуры, которые содержат (3-складчатую структуру. Всего in vitro наблюдалось несколько видов протофибрилл: протофибриллы сферической, колыдеподобной структуры и трубочек (Voiles et al., 2003).
При этом механизмы нейротоксичности протофибрилл альфа-синуклеина неясны. Имеется предположение, что протофибриллы могут формировать поры, способные к встраиванию в мембрану и изменяющие её проницаемость и, как следствие, клеточный гомеостаз.
В настоящее время существует два гипотетических механизма, предполагающих роль олигомерных видов альфа-синуклеина в мембранной проницаемости: 1 - олигомеры могут внедряться в мембрану и приводить к образованию пор или канало-подобных структур, которые могли бы приводить к неконтролируемой проницаемости мембраны (Goldberg et al., 2000); 2 - олигомеры могут повышать способность ионов проходить через мембранный бислой, без образования при этом пор (Kayed et al., 2004). Процесс накопления альфа-синуклеина в клетке может также быть обусловлен нарушением в клетке процесса деградации белка. Протеолиз альфа-синуклеина может осуществляться как с помощью убиквитинизации, так и по лизосомальному пути (Hasegawa et al., 2002). Об этом свидетельствует наличие в клетке убиквитинированного альфа-синуклеина, а также идентификация последовательности VKKDQ, распознаваемая шапероном при шаперон-обусловленной аутофагии. Нарушение этих процессов может приводить к накоплению альфа-синуклеина, формированию агрегатов и гибели клетки. Остаётся, однако, неизвестным, каким образом влияют на метаболизм альфа-синуклеина и образование олигомеров мутации в других генах (кроме SNCA) наследственных форм БП.
Предполагается, что химические модификации альфа-синуклеина, такие, как окисление, азотирование или фосфорилирование, могут усиливать его нейротоксичность. Было показано, что альфа-синуклеин может окисляться, и этот процесс рассматривается как один из возможных механизмов цитотоксичности. Ключевыми в процессе окисления альфа-синуклеина являются тирозиновые остатки в положениях 39,125,133 и 136 (Olteanu et al., 2004). Считается, что окисление альфа-синуклеина приводит к олигомеризации белка, благодаря образованию о,о -дитирозиновых олигомеров. В настоящее время предполагается возможная промежуточная роль окисленного альфа-синуклеина в процессе его олигомеризации и последующем образовании фибрилл.
Нитрозилирование альфа-синуклеина - другой возможный механизм нейротоксичности. При наличии активных форм кислорода оксид азота формирует пероксинитрит, обеспечивающий превращение остатков тирозина в тех же положениях, что и при окислении, в 3-нитротирозин (Ischiropoulos et al., 2003), что способствует стабилизации олигомеров альфа-синуклеина (Norris et al., 2003).
Фосфорилирование является наиболее общим механизмом для регуляции активности и функции белков. Ранее была показана связь фосфориллирования цитоскелетного белка tau и болезни Альцгеймера. У пациентов с деменцией с тельцами Леви в тельцах Леви был обнаружен фосфориллированный в положении S129 альфа-синуклеин (Anderson et al., 2006). In vitro установлено, что С-концевая часть альфа-синуклеина содержит несколько сайтов фосфориллирования (S87, Туг125, ТугІЗЗ, Туг 136) (Ellis et al., 2001). Несмотря на обилие информации о фосфориллированных формах альфа-синуклеина, вопрос о нейротоксичности фосфориллированных форм альфа-синуклеина остаётся открытым.
О-гликозилированная форма альфа-синуклеина (альфа-Sp22) с массой 22 кДа была выделена из экстрактов мозга человека, где альфа-Sp22 в отличие от мономерного немодифицированного (19кДа) альфа-синуклеина выделялся в комплексе с ЕЗ-убиквитинлигазой, паркином (Shimura et al., 2001). Неясной остается связь альфа-8р22 с патогенезом БП, хотя при этом имеются данные о том, что паркин участвует в убиквитинизации альфа-8р22, и при мутациях гена PARK2 альфа-8р22 способен накапливаться в клетках. Надо отметить, что дисфункция паркина, обусловленная мутациями в гене PARK2, приводит к развитию ранних аутосомно-рецессивных ювенильных форм БП (как правило до 30 лет) с отсутствием телец Леви в дофаминергических нейронах (Poorkaj et al., 2004).
Локус PARK8 был картирован в 2002 году в японской семье (Fimayama et al., 2002). Впервые практически одновременно мутации в гене LRRK2, расположенном в этом локусе, были обнаружены у пациентов с БП в одной британской семье, а также в семьях басков (Paisan-Ruiz et al., 2004; Zimprich et al., 2004). Ген LRRK2 находится на длинном плече 12 хромосомы и состоит из 51 экзона. Было показано, что данный ген экспрессируется во многих структурах головного мозга (ЧС, мозжечок), в спинном мозге, а также на более низком уровне, в периферических органах: сердце, легких, печени, почках, плаценте (Giasson et al., 2006).
Измерение уровня белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови
В тоже время в работе Kim с соавторами было показано увеличение уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов со сБП (Kim et al., 2004).
Необходимо отметить, что во все вышеназванные исследования входила гетерогенная группа пациентов со сБП неизвестной этиологии. В настоящей работе впервые включена в исследование однородная по этиологии группа пациентов с 1,.К&Ю-ассоциированной БП.
В данной однородной по этиологии выборке пациентов нами впервые проведена оценка уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови и показано снижение альфа-синуклеина только в группе с 1&&К2-ассоциированной БП. Ранее группа пациентов с LRRK2 ассоциированной БП была исследована с целью выявления нарушений в работе киназного каскада при этой форме заболевания (White et al., 2007). Мы предполагаем, что уровень альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови зависит от этиологии заболевания и не может быть использован как прогностический маркер развития БП.
Как было описано ранее, LRRK2 имеет киназный домен, обладающий гомологией с МАРККК-киназами, которые выполняют огромное количество функций в клетках, участвуя в их пролиферации, дифференцировке и механизмах их выживания (Miloso et al., 2008; Sweatt et al., 2004). MAPKKK являются ферментами, часто действующими в качестве инициаторов сигнальных каскадов, являясь регуляторами транскрипции (Yang et al., 2003). Обычно подобные киназы способны участвовать по крайней мере в одном из трёх классических МАРК каскадов: ERK (extracellular signal-regulated kinases), р38МАРК и JNK (C-Jun Nerminal kinases). Недавно Carballo-Carbajal и соавторы показали in vitro способность LRRK2 регулировать транскрипцию гена SNCA (Carballo-Carbajal et al., 2010). Оказалось, что LRRK2 способен селективно активировать ERK путь. При этом его активация за счёт LRRK2-стимулированной эндогенной транскрипции SNCA приводит к повышенной экспрессии гена SNCA, в то время как мутации G6055A (G2019S), С4321Т (R1441C) гена LRRK2 способствовали значительному уменьшению мРНК гена SNCA. Выявленное нами снижение уровня альфа-синуклеина у пациентов с мутациями в гене LRRK2 нельзя объяснить влиянием LRRK2 на транскрипцию гена SNCA, поскольку мы не наблюдали изменений уровня мРНК. Полученные нами результаты скорее позволяют предположить изменения не на уровне транскрипции, а на уровне белок-белковых взаимодействий.
Известно, что альфа-синуклеин является основным компонентом телец Леви, которые являются нейропатологическим признаком различных нейродегенеративных заболеваний, в том числе и БП. В большинстве случаев при LRRK2-ассоциированной БП наблюдается классическая картина нейродегенерации с формированием телец Леви (Hernandez et al., 2005), в которых LRRK2 оказывается колокализован с альфа-синуклеином (Perry et al, 2008). В тоже время появились первые результаты, указывающие на вовлеченность LRRK2 в непосредственное взаимодействие с альфа-синуклеином (Qing et al., 2009). В системе in vitro было продемонстрировано участие LRRK2 в фосфориллировании альфа-синуклеина по Ser 129. При этом было также показано, что фосфориллирование в случае LRRK2 дикого типа выражено в меньшей степени, нежели в случае LRRK2 с мутацией G6055A (G2019S). При этом повышенная киназная активность LRRK2 при мутации G6055A (G2019S) была многократно показана ранее (West et al., 2005; Greggio et al., 2006; MacLeod et al., 2006; Smith et al., 2006).
Совсем недавно Paleologou KE и соавторы с использованием образцов мозга пациентов с болезнью Альцгеймера, деменцией с тельцами Леви и множественной системной атрофией обнаружили накопление фосфориллированного в положении S87 альфа-синуклеина (Paleologou et al., 2010) как в цитоплазме клеток, так и в тельцах Леви. Более того, было обнаружено, что фосфориллирование альфа-синуклеина в положении S87 препятствует его связыванию с мембранами клетки, вероятно, нарушая его конформационное состояние альфа-спирали, переход в которое сопровождается при взаимодействии с мембранами везикул (Paleologou et al., 2010). В нашем исследовании мы использовали антитела к альфа-синуклеину человека (BD Transduction Labs, США), иммуногенные к 15-123 аминокислотам, позволяя выявлять формы альфа-синуклеина, содержащие все известные на сегодняшний день сайты фосфориллирования (у 125, si 29, у 133, si 36), кроме белка фосфориллированного по Ser в позиции 87 (s87). Нами выявлено снижение уровня альфа-синуклеина у пациентов с мутациями в гене LRRK2, на фоне нормальной экспрессии гена SNCA, что не исключает накопление фосфориллированной формы s87 альфа-синуклеина у этих пациентов.
В настоящее время основная гипотеза гибели дофаминергических нейронов ЧС связана с агрегацией альфа-синуклеина в них. Ранее Miller с соавторами с использованием метода вестрн блоттинга показал наличие агрегатов альфа-синуклеина в образцах ткани мозга пациентов с трипликацией гена SNCA, при этом не обнаруживая их в лимфоцитах периферической крови (Miller et.al., 2004). В нашем исследовании с использованием того же метода и аналогичных антител, бэндов с изменённой подвижностью, свидетельствующих о наличии олигомерных форм белка, в лимфоцитах периферической крови пациентов с LRRK2-ассоциированной БП также обнаружено не было. Это может в частности объясняться более коротким временем жизни лимфоцитов периферической крови по сравнению с дофаминергическими нейронами. В тоже время Manning с соавторами высказали предположение о возможном отсутствии взаимодействия тех же антител с агрегированными формами альфа-синуклеина (Manning-Bog et al.), что может в свою очередь объяснять отсутствие бэндов с изменённой подвижностью и возможное наличие агрегатов альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови пациентов с Я&0-ассоциированной БП.
Измерение уровня мРНК гена SNCA в лимфоцитах периферической крови исследуемых групп
В тоже время в работе Kim с соавторами было показано увеличение уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов со сБП (Kim et al., 2004).
Необходимо отметить, что во все вышеназванные исследования входила гетерогенная группа пациентов со сБП неизвестной этиологии. В настоящей работе впервые включена в исследование однородная по этиологии группа пациентов с 1,.К&Ю-ассоциированной БП.
В данной однородной по этиологии выборке пациентов нами впервые проведена оценка уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови и показано снижение альфа-синуклеина только в группе с 1&&К2-ассоциированной БП. Ранее группа пациентов с LRRK2 ассоциированной БП была исследована с целью выявления нарушений в работе киназного каскада при этой форме заболевания (White et al., 2007). Мы предполагаем, что уровень альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови зависит от этиологии заболевания и не может быть использован как прогностический маркер развития БП.
Как было описано ранее, LRRK2 имеет киназный домен, обладающий гомологией с МАРККК-киназами, которые выполняют огромное количество функций в клетках, участвуя в их пролиферации, дифференцировке и механизмах их выживания (Miloso et al., 2008; Sweatt et al., 2004). MAPKKK являются ферментами, часто действующими в качестве инициаторов сигнальных каскадов, являясь регуляторами транскрипции (Yang et al., 2003). Обычно подобные киназы способны участвовать по крайней мере в одном из трёх классических МАРК каскадов: ERK (extracellular signal-regulated kinases), р38МАРК и JNK (C-Jun Nerminal kinases). Недавно Carballo-Carbajal и соавторы показали in vitro способность LRRK2 регулировать транскрипцию гена SNCA (Carballo-Carbajal et al., 2010). Оказалось, что LRRK2 способен селективно активировать ERK путь. При этом его активация за счёт LRRK2-стимулированной эндогенной транскрипции SNCA приводит к повышенной экспрессии гена SNCA, в то время как мутации G6055A (G2019S), С4321Т (R1441C) гена LRRK2 способствовали значительному уменьшению мРНК гена SNCA. Выявленное нами снижение уровня альфа-синуклеина у пациентов с мутациями в гене LRRK2 нельзя объяснить влиянием LRRK2 на транскрипцию гена SNCA, поскольку мы не наблюдали изменений уровня мРНК. Полученные нами результаты скорее позволяют предположить изменения не на уровне транскрипции, а на уровне белок-белковых взаимодействий.
Известно, что альфа-синуклеин является основным компонентом телец Леви, которые являются нейропатологическим признаком различных нейродегенеративных заболеваний, в том числе и БП. В большинстве случаев при LRRK2-ассоциированной БП наблюдается классическая картина нейродегенерации с формированием телец Леви (Hernandez et al., 2005), в которых LRRK2 оказывается колокализован с альфа-синуклеином (Perry et al, 2008). В тоже время появились первые результаты, указывающие на вовлеченность LRRK2 в непосредственное взаимодействие с альфа-синуклеином (Qing et al., 2009). В системе in vitro было продемонстрировано участие LRRK2 в фосфориллировании альфа-синуклеина по Ser 129. При этом было также показано, что фосфориллирование в случае LRRK2 дикого типа выражено в меньшей степени, нежели в случае LRRK2 с мутацией G6055A (G2019S). При этом повышенная киназная активность LRRK2 при мутации G6055A (G2019S) была многократно показана ранее (West et al., 2005; Greggio et al., 2006; MacLeod et al., 2006; Smith et al., 2006).
Совсем недавно Paleologou KE и соавторы с использованием образцов мозга пациентов с болезнью Альцгеймера, деменцией с тельцами Леви и множественной системной атрофией обнаружили накопление фосфориллированного в положении S87 альфа-синуклеина (Paleologou et al., 2010) как в цитоплазме клеток, так и в тельцах Леви. Более того, было обнаружено, что фосфориллирование альфа-синуклеина в положении S87 препятствует его связыванию с мембранами клетки, вероятно, нарушая его конформационное состояние альфа-спирали, переход в которое сопровождается при взаимодействии с мембранами везикул (Paleologou et al., 2010). В нашем исследовании мы использовали антитела к альфа-синуклеину человека (BD Transduction Labs, США), иммуногенные к 15-123 аминокислотам, позволяя выявлять формы альфа-синуклеина, содержащие все известные на сегодняшний день сайты фосфориллирования (у 125, si 29, у 133, si 36), кроме белка фосфориллированного по Ser в позиции 87 (s87). Нами выявлено снижение уровня альфа-синуклеина у пациентов с мутациями в гене LRRK2, на фоне нормальной экспрессии гена SNCA, что не исключает накопление фосфориллированной формы s87 альфа-синуклеина у этих пациентов.
В настоящее время основная гипотеза гибели дофаминергических нейронов ЧС связана с агрегацией альфа-синуклеина в них. Ранее Miller с соавторами с использованием метода вестрн блоттинга показал наличие агрегатов альфа-синуклеина в образцах ткани мозга пациентов с трипликацией гена SNCA, при этом не обнаруживая их в лимфоцитах периферической крови (Miller et.al., 2004). В нашем исследовании с использованием того же метода и аналогичных антител, бэндов с изменённой подвижностью, свидетельствующих о наличии олигомерных форм белка, в лимфоцитах периферической крови пациентов с LRRK2-ассоциированной БП также обнаружено не было. Это может в частности объясняться более коротким временем жизни лимфоцитов периферической крови по сравнению с дофаминергическими нейронами. В тоже время Manning с соавторами высказали предположение о возможном отсутствии взаимодействия тех же антител с агрегированными формами альфа-синуклеина (Manning-Bog et al.), что может в свою очередь объяснять отсутствие бэндов с изменённой подвижностью и возможное наличие агрегатов альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови пациентов с Я&0-ассоциированной БП.
