Введение к работе
Актуальность проблемы. Дозовая компенсация генов половых хромосом является одной из наиболее интересных и интенсивно разрабатываемых проблем современной биологии. Необходимость дозовой компенсации ьозникает у организмов, половые хромосомы которых значительно отличаются по морфологии и генетическому содержанию. Специализация половых хромосом у самцов млекопитающих приводит к нарушению соотношения уровней экспрессии генов Х-хромосомы между полами, которое устраняется с помощью подавления транскрипции, инактивации, генов на одной из двух Х-хромосом у самок. Процесс инактивации Х-хромосомы изучается уже на протяжении нескольких десятилетий. И хотя в понимании его механизмов достигнуг значительный прогресс, остается еще целый ряд невыясненных вопросов.
Гены Х-хромосомы самок млекопитающих в различной степени вовлечены в систему дозовой компенсации. Так, ряд генов избегает инактивации и сохраняет экспрессию на неактивной Х-хромосоме. Имеющиеся данные о статусе экспрессии генов Х-хромосомы у человека, мыши и некоторых других видов (Jegalian, Page, 1998; Disteche et al, 2002; Carrel, Willard, 2005; Yen et al, 2007) указывают на то, что избегающие инактивации гены характерны для X-хромосомы многих таксонов плацентарных млекопитающих. Было выдвинуто несколько гипотез, объясняющих различия в статусе экспрессии генов X-хромосомы, однако причины, по которым те или иные гены избегают инактивации, на сегодняшний день не известны.
Существует две формы процесса инактивации Х-хромосомы: импринтированная и случайная. Импринтированная инактивация Х-хромосомы, унаследованной от отца, наблюдается у некоторых видов плацентарных млекопитающих (например, грызунов) на предымплантационных стадиях развития эмбриона и сохраняется в клетках экстраэмбриональных тканей. В клетках, из которых формируются ткани собственно эмбриона, во время имплантации происходит реактивация отцовской Х-хромосомы и последующий процесс случайной инактивации либо отцовской, либо материнской X-хромосомы. Оба типа инактивации зависят от экспрессии гена Xist. Установление неактивного состояния сопровождается распространением Xist РНК вдоль инактивируемой Х-хромосомы, утратой модификаций, характерных для транскрипционно активного хроматина, и приобретением модификаций транскрипционно неактивного хроматина (Heard, Disteche, 2006; Шевченко и др., 2006). Было показано, что при случайной инактивации в соматических тканях человека и коровы модификации хроматина на неактивной Х-хромосоме формируют два типа гетерохроматина, которые ассоциированы с различными типами G-бэндов и отличаются по времени репликации в поздней Бчразе (Chadwick, Willard, 2004; Coppola ei al, 2008). Тем не менее, остается неясным, свойственна ли такая организация хроматина неактивной Х-хромосоме других видов плацентарных млекопитающих, а также принимают ли эти два тина гетерохроматина участие в поддержании неактивного состояния Х-хромосомы при импринтированной инактивации.
Случайная инактивация Х-хромосомы в отличие от импринтированной стабильно поддерживается в раду клегочных поколений. Принято считать, что
за стабильность случайной инактивации у 'человека и мыши отвечает мегилирование ДНК промоторных областей генов неактивной Х-хррмосомы. Роль метилирования ДНК в процессе имприцтированной инактивации еще только предстоит выяснить, поскольку в настоящее время существует очень мало данных как о статусе метилирования, так и о статусе экспрессии генов X-хромосомы в экстраэмбриональных тканях самок млекопитающих.
Решению вопросов о том, с чем связаны различия в статусе экспрессии генов на неактивной Х-хромосоме, и о роли модификаций хроматина в процессах случайной и импринтированной инактивации, будет способствовать детальное изучение процесса инактивации Х-хромосомы у других видов млекопитающих. В лаборатории эпигенетики развития Института цитологии и генетики СО РАН проводится исследование процесса инактивации X-хромосомы у обыкновенных полевок рода Microtus. В данной работе на примере обыкновенных полевок впервые проведено сравнение статусов экспрессии и метилирования генов, а также распределения модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме при случайной и импринтированной инактивации.
Цель и задачи работы. Цель работы - установление статуса экспрессии генов и модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Определение статуса экспрессии генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок;
-
Сравнение статуса метилирования промоторных областей и/или первых экзонов генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок;
-
Выяснение характера распределения модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме в фибробластах, трофобластных стволовых клетках и клетках экстраэмбриональной эндодермы обыкновенных полевок.
Научная новизна работы. На основе клеточных линий самок межвидовых гибридов М. rossiaemeridionalis х М. arvalis создана модельная система для изучения статуса экспрессии генов Х-хромосомы, и определен статус экспрессии 15 генрв в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. Проведено, сравнение профиля экспрессии генов Х-хромосомы обыкновенных полевок с данными, имеющимися по человеку и мыши. Впервые установлен статус метилирования промоторных областей и/или первых экзонов 4 генов X-хромоеомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. На примере трофобластных стволовых клеток и клеток экстраэмбриональной эндодермы обыкновенных полевок впервые исследовал характер распределения модификаций хроматина на мегафазных хромосомах при импринтированной инактивации Х-хромосомы.
Положения, выносимые на защиту.
-
В экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок инактивация X-хромосомы является менее полной и/или стабильной по сравнению с соматическими тканями;
-
В соматических тканях обыкновенных полевок в отличие от экстраэмбриональных тканей наблюдается четкое соответствие между статусом метилирования промоторной области и/или 1 экзона генов X-хромосомы и их транскрипционной активностью;
-
При случайной и импринтировашюй инактивации у обыкновенных полевок поддержание неактивного состояния Х-хромосомы осуществляется с помощью двух типов гетерохроматина, различающихся по составу и локализации.
Научно-практическая значимость работы. Результаты данной работы вносят вклад в понимание эпигенетических механизмов случайной и импринтированной инактивации Х-хромосомы, а также механизмов регуляции экспрессии генов Х-хромосомы у самок млекопитающих.
Апробация работы. Результаты работы представлены на второй
международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Париж, 17-22
сентября 2006 г.), на Международной молодежной научно-методической
конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9-12
мая 2007 г.), на Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск,
31 августа - 6 сентября 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института
цитологии и генетики СО РАН. '
По теме диссертации опубликованы три работы. Одна - в рецензируемом отечественном журнале, две - в рецензируемых зарубежных журналах.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Саузерн блот-гибридизация геномной ДНК выполнялась совместно с к.б.н. А.И. Шевченко. Анализ результатов иммунофлуоресцентного окрашивания метафазных хромосом клеточных линий обыкновенных полевок проводился совместно с к.б.н. СВ. Павловой и к.б.н. А.И. Шевченко.
Структура и объем диссертации. Диссертация. включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы (182 наименования). Работа изложена на 124 страницах, содержит 12 рисунков и 8 таблиц.
