Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общая характеристика инициации транскрипции прокариот 6
1.1. РНК-полимераза Escherichia coli как типичный представитель РНК-полимераз эубактерий. Строение минимального (кор-фермента) и холофермента РНК-полимеразы 6
1. 2. Структурные элементы промоторов и их взаимодействие с РНК-полимеразой 9
1. 3. Современное представление о механизме инициации транскрипции прокариот 12
Глава 2. Активация экспрессии генов 17
2.1. Взаимодействие активаторов с С-концевым доменом а-субъединицы (aCTD) 19
2.2. Активаторы, контактирующие с областью 4 а -субъединицы РНК-полимеразы 21
2. 3. Другие поверхности РНК-полимеразы, взаимодействующие с активаторами инициации транскрипции 21
2. 4. Активаторы транскрипции, осуществляющие два контакта с РНК-полимеразой 22
2. 5. Влияние активаторов на конформацию промотора 23
2. 6. Зависимость экспрессии промоторов от действия нескольких активаторов транскрипции 25
2. 7. Регуляция промоторов с участием белка CRP 26
2. 7.1. Общая характеристика белка CRP 27
2.7. 2. Классификация CRP-зависимых промоторов 28
Глава 3. Механизмы транскрипционной репрессии 39
3.1. Ингибирование связывания РНК-полимеразы с промотором 39
3. 2. Ингибирование промотора на стадии образования транскрипционного пузырька 41
3. 3. Репрессоры, влияющие на процесс освобождения промотора 42
3. 4. Некоторые репрессоры бактериальной транскрипции 44
3. 4. 1. Белок-репрессор Lad 45
3. 4. 2. Белок-репрессор GalR 47
3. 4. 3. Белок-репрессор CytR 49
Глава 4. Особенности структурно-функциональной организации и регуляции генов катаболизма нуклеозидов 53
4.1. Структура и регуляция экспрессии генов fifeo-оперона 54
5. 2. Регуляции экспрессии гена cdd 59
4. 3. Регуляции экспрессии гена udp 60
Экспериментальная часть материалы и методы 61
Глава 5. Структурно-функциональная характеристика генов udp из грамотрицательных бактерий 74
5.1. Клонирование и определение нуклеотидных последовательностей гена udp из Yersinia pseudotuberculosis и Vibrio cholerae 74
5. 2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей фермента уридинфосфорилазы из гамма-протеобактерий Е. coli, S. typhimurium, Y. pseudotuberculosis и V. cholerae 82
5. 3. Сравнительный анализ структурно-функциональной организации регуляторной области гена udp грамотрицательных бактерий 89
Глава 6. Мутационный анализ регуляторной области гена udp Е. coli и S. typhimurium 100
6.1. Получение мутаций в регуляторной области гена udp Е. coli, их классификация и первичная характеристика 100
6.1.1. Характеристика мутаций, затрагивающих Прибнов-блок 104
6. 1. 2. Свойства мутантов с модифицированными сайтами связывания белка CRP 107
6.1. 3. Свойства мутантов с модифицированными сайтами связывания белка-репрессора CytR 111
6. 2. Сравнительная характеристика мутаций в области сайта связывания белка-репрессора CytR промоторов udpP Е. coli и udpP S. typhimurium 113
6. 2.1. Влияние нуклеотидных замен на экспрессию генов udp Е. coli и S. typhimurium. Изучение способности мутантных промоторов к связыванию с ос-субъединицей RNAP в системе in vitro 114
6. 2. 2. Влияние полученных мутаций на способность промотора к титрованию белка-репрессора CytR in vivo. Изучение способности мутантных промоторов к связыванию с регуляторным белком CytR 119
Обсуждение 123
Выводы 130
Список литературы
- Структурные элементы промоторов и их взаимодействие с РНК-полимеразой
- Другие поверхности РНК-полимеразы, взаимодействующие с активаторами инициации транскрипции
- Репрессоры, влияющие на процесс освобождения промотора
- Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей фермента уридинфосфорилазы из гамма-протеобактерий Е. coli, S. typhimurium, Y. pseudotuberculosis и V. cholerae
Введение к работе
Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции является одной из центральных проблем современной молекулярной биологии и генетики. Начиная с классических работ Жакоба и Моно, послуживших основой для создания концепции оперона, стало очевидным, что регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции осуществляется путем взаимодействия специфических регуляторных белков с промотор-операторными участками генов и оперонов. На протяжении многих лет считалось общепризнанным, что бактериальные регуляторные белки содержат всю необходимую структурную информацию, обеспечивающую распознавание и связывание со специфическими последовательностями-мишенями в молекуле ДНК, в то время как регуляция с участием мультибелковых комплексов характерна исключительно для эукариотических генов. В последнее время появляется все больше и больше экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что механизм регуляции транскрипции, основанный на белок-белковых взаимодействиях довольно широко используется и в прокариотических системах. К таким системам относятся гены, контролирующие транспорт и катаболизм нуклеозидов у Е. coli, которые входят в состав так называемого CytR-регулона. Экспрессия генов CytR-регулона находится под негативным контролем белка-репрессора CytR, а также регулируется позитивно с участием активирующего транскрипцию комплекса циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) - белок-рецептор цАМФ (CRP) [65]. Показано, что промоторы, по крайней мере, четырех генов deoP2, cddP, udpP и nupGP, входящих в состав этого регулона, имеют общий план строения и содержат два тандемно расположенные сайта связывания белка CRP, между которыми находится сайт узнавания для белка-репрессора CytR [199]. Получены убедительные доказательства того, что кооперативное связывание белков CytR и CRP с промотором обеспечивается за счет их прямого белок-белкового взаимодействия [184]. Интересная особенность структуры белка репрессора CytR состоит в том, что он представляет собой димер, два домена которого соединены подвижным линкером, что обеспечивает связывание нативного белка CytR с операторами различной конфигурации. В последнее время стали появляться данные, свидетельствующие о том, что функция белка CytR в клетке не ограничивается его участием в регуляции экспрессии генов транспорта и катаболизма нуклеозидов, а, по всей видимости, связана также с регуляцией более глобальных процессов в бактериальной клетке. Так, оказалось что белковый комплекс цАМФ-CRP/CytR
5 вовлечен в регуляцию экспрессии одного из промоторов гена гроН, кодирующего
-1-у
синтез сигма-фактора (а ), ответственного за контроль генов теплового шока [91]. Кроме того, в недавно появившейся работе [66] показано, что у патогенных бактерий Vibrio cholerae белок CytR подавляет экспрессию генов, ответственных за формирование так называемых биопленок (biofilm). Эти данные свидетельствуют о важной роли белка CytR в процессе патогенеза, а также указывает на возможную роль эффекторов белка CytR — нуклеозидов в качестве сигнальных молекул для перехода от планктонной формы существования бактерий к стадии образования биопленок.
Несмотря на обилие экспериментальных данных о строении и функционировании CytR-регулируемых промоторов в системах in vivo и in vitro, многие аспекты CytR-зависимой регуляции транскрипции остаются неясными. Так, согласно общепринятой модели CytR-регуляции, негативное действие белка CytR основано на его конкуренции с РНК-полимеразой за связывание с белком CRP в процессе формирования транскрипционного комплекса, то есть другими словами, белок CytR действует не как классический репрессор транскрипции, а как антиактиватор, предотвращая активацию транскрипции комплексом цАМФ-CRP [118]. Однако недавно появились данные, свидетельствующие о том, что белок CytR может влиять и непосредственно на взаимодействие РНК-полимеразы с кор-промотором, включающим области -35 и -10, то есть проявляет свойства классического репрессора транскрипции [178].
Данная работа посвящена изучению особенностей структурно-функциональной организации регуляторной области гена udp у гамма-протеобактерий Escherichia coli. Salmonella typhimurium, Yersinia pseudotuberculosis и Vibrio cholerae и выяснению механизма регуляции гена udp с участием белка-репрессора CytR и комплекса цАМФ-CRP.
6 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Структурные элементы промоторов и их взаимодействие с РНК-полимеразой
Бактериальные промоторы содержат две области, которые для большинства типов промоторов принято называть блоками -10 и -35 в соответствии с их расположением относительно стартового сайта транскрипции в направлении 5 по нематричной нити. Существует несколько разных классов промоторов с различной нуклеотидной последовательностью этих блоков. Каждый класс промоторов узнается определенной специфической а-субъединицей РНК-полимеразы. Как уже упоминалось, существует несколько разных типов а-факторов [41, 64, 69, 81]. У Е. coli главным является фактор а7 , кодируемый геном rpoD и узнающий промоторы с каноническими блоками -10 (5 -ТАТААТ-3 ) и -35 (5 TGACA-3 ), находящимися на расстоянии 16-18 пн друг от друга. Указанные последовательности являются консенсусными и выведены на основе статистической обработки нуклеотидного состава большого количества индивидуальных бактериальных промоторов, узнаваемых субъединицей а70 РНК-полимеразы (Еа70). Структура типичного консенсусного а -зависимого промотора и его функционально важные участки показаны на рисунке 1. [139]. Т Т G А Помимо главного сигма-фактора а , необходимого для транскрипции генов, вовлеченных в фундаментальные клеточные функции во время экспоненциального роста, у Е. coli идентифицированы пять минорных а-факторов, контролирующих транскрипцию специализированных генов. Фактор ст (ген rpoS) является ключевым фактором во время стрессового ответа при переходе из экспоненциальной фазы роста в стационарную. Фактор ст (ген rpoF) управляет транскрипцией генов, участвующих в клеточной подвижности (биогенезе жгутиков) и хемотаксисе. Консенсусные последовательности промоторов, узнаваемые а-факторами ст и а , пока не установлены. Фактор ст24 (ген гроЕ) участвует в транскрипции некоторых генов в условиях "теплового шока" (при повышении температуры выращивания бактерий до 48, когда все остальные о-факторы неактивны). Гомологи фактора ст24 имеются у многих других бактерий. Они участвуют в экспрессии генов, которые кодируют белки, функционирующие вне цитоплазмы: в клеточной мембране, в периплазматическом пространстве или вне клеток. Поэтому эту группу ст-факторов выделяют в особое семейство, под контролем которого находятся гены, ответственные за синтез нецитоплазматических белков [124]. Консенсусный промотор для а24 у Е. coli имеет первичную структуру: 5 -GAACTT(-35)-Ni6CTGA(-10)-3 . Совершенно другая структура промоторов обнаружена у генов, индукция которых происходит в условиях теплового шока: область -35 этих промоторов содержит последовательность 5 -CTTGAA-3 , а область -10 последовательность 5 -ССССАТ-ТА-3\ Эти промоторы узнаются ст-фактором теплового шока ст (ген гроН). Особую группу образуют промоторы генов азотного метаболизма, находящиеся под контролем а-фактора а54 (ген rpoN). Эти промоторы характеризуются как необычным расположением -35 и -10 блоков относительно старта транскрипции (-24 пн и -12 пн, соответственно), так и расстоянием между ними (5 пн). Поэтому два блока 5 -CTGGCGC-3 и 5 TGCA-3 у этих промоторов принято называть блоками -12 и -24, соответственно [81]. Во время экспоненциального роста количество синтезируемого в клетке главного сигма-фактора ст70 составляет примерно 40% от количества минимального фермента РНК-полимеразы, тогда как содержание минорных ст-факторов в клетке существенно ниже. Количественное соотношение различных форм холофермента РНК-полимеразы определяется конкуренцией между ст-факторами за минимальный фермент и в первом приближении соответствует относительным содержанием разных ст-факторов в клетке. Главные ст-факторы имеют молекулярную массу 80-90 кДа у грамотрицательных бактерий (как ст70 у Е. coli) и 40-60 кДа у грамположительных бактерий. Все минорные ст-факторы, кроме ст54, имеют гораздо меньший размер (около 30 кДа). Все а-факторы являются кислыми белками, заряженными положительно при рН 7,0 [64, 69].
У бактериальных промоторов обнаружены два дополнительных структурных элемента, которые влияют на процесс инициации транскрипции. Область, расположенная после сайта инициации транскрипции в районе от +1 до +20 нуклеотида, получившая наименование DSR-элемента [21]. DSR-элементы могут in vivo увеличивать активность промотора более чем в 10 раз. Однако в экспериментах in vitro, выполненных в условиях варьирования концентрации РНК-полимеразы, каких-либо изменений в эффективности образования открытого комплекса не наблюдалось. Поэтому предполагается, что DSR-элементы влияют на транскрипцию на стадии образования инициирующего комплекса. Результаты исследований in vitro показали, что эти элементы могут влиять на уровень абортивной инициации транскрипции. Перед -35 элементом в направлении 5 по нематричной нити была обнаружена А/Т-богатая область, получившая название UP-элемент [68, 166]. В настоящее время наиболее детально охарактеризован UP-элемент промотора ггпВ Р1, который расположен между -40 пн и -60 пн относительно старта транскрипции. Взаимодействие а-субъединицы РНК-полимеразы с UP-элементом увеличивает эффективность ее связывания с промотором, а также стимулирует протекание дальнейших стадий инициации транскрипции [157, 188]. UP-элементы были идентифицированы у большинства бактериальных и фаговых промоторов, которые могут взаимодействовать с РНК-полимеразами, содержащими различные ст-факторы [68]. В одной из последних работ Р. Гоурса с соавт. показано, что описанный ранее UP-элемент на самом деле состоит из двух отдельных субсайтов, каждый из которых может сам по себе связываться с холоферментом РНК-полимеразы, а точнее с его С-концевым доменом а-субъединицы, и в результате этого взаимодействия стимулировать транскрипцию [51]. При этом выяснилось, что эффективность стимуляции транскрипции для двух субсайтов различна и зависит от того, насколько последовательность каждого из этих субсайтов близка к консенсусной. Так, проксимальные субсайты (положения от -46 пн до -38 пн; консенсус 5 -AAAAAARNR-3 ; R=A или G; Ы=любой нуклеотид) стимулировали транскрипцию более чем в 170 раз, в то время как дистальные субсайты (положения от -57 пн до -47 пн; консенсус 5 -AWWWWWTTTTT-3 ; W=A или Т) стимулировали транскрипцию в 16 раз.
Другие поверхности РНК-полимеразы, взаимодействующие с активаторами инициации транскрипции
Представленные выше результаты показывают, что в процессе инициации транскрипции домен aCTD и область 4 субъединицы a играют основную роль в обеспечении контакта РНК-полимеразы с промоторной областью ДНК. Активаторы, взаимодействующие с этими функциональными доменами РНК-полимеразы, стабилизируют эти контакты. В то же время известны случаи, когда белки активаторы обнаруживают способность взаимодействовать с другими участками поверхности молекулы РНК-полимеразы [80]. Например, белок активатор катаболитной репрессии CRP может контактировать с мишенью на амино-концевом домене а-субъединицы РНК-полимеразы (aNTD) в промоторах, у которых сайт связывания для белка CRP перекрывается с -35-областью [23, 140]. Белок DnaA может активировать промотор X PR путем контакта с р-субъединицей РНК-полимеразы [160], в то время как у однонитевого бактериофага N4 ДНК-связывающий белок активирует поздние промоторы N4, взаимодействуя с Р -субъединицей РНК-полимеразы [122].
У многих активатор-зависимых промоторов, сайт связывания белка-активатора перекрывается с -35-элементом промотора. Это означает, что рассмотренное нами выше прямое взаимодействие aCTD субъединицы РНК-полимеразы с этой областью промотора осуществляться не может (рис. 4а и 4с). Показано, что у большинства таких промоторов связывание этого домена РНК-полимеразы с промотором происходит в области UP-элемента (рис. 4d), что ограничивает перемещения aCTD по ДНК и стабилизирует конструкцию. Наиболее наглядным примером такого взаимодействия является регуляция экспрессии промоторов с участием белка FNR. Активная форма этого белка представляет собой димер, который участвует в регуляции экспрессии генов фумарат и нитрат редуктазы, а также активирует транскрипцию многих других промоторов, связываясь с сайтом ДНК, перекрывающимся с -35-областью. Первый активирующий участок расположен на той субъединице белка-димера FNR, которая взаимодействует с сайтом связывания, находящимся ближе к старту транскрипции, вступает в контакт с областью 4 субъединицы о70, в то время как второй участок молекулы, который является функциональным в дистально расположеной субъединице белка FNR, осуществляет контакт с aCTD [И, 23, 206, 207]. Таким образом, различные субъединицы белка-димера FNR оказываются вовлеченными во взаимодействие с разными участками РНК-полимеразы. Другим примером такой регуляции является_белок-активатор Мог бактериофага Ми, для которого необходим контакт с двумя субъединицами РНК-полимеразы: а70 (в области 4 субъединицы) и а (в районе aCTD) для активации транскрипции среднего промотора Ми [5]. Похожая ситуация наблюдается в случае
CRP-зависимых промоторов, у которых сайт связывания CRP перекрывается с -35-областыо [23, 140, 159]. Структурно-функциональный анализ этих промоторов показал, что белок CRP влияет на их транскрипцию посредством одновременного взаимодействия с N- и С-концевыми доменами а-субъединицы РНК-полимеразы, при этом активирующая область ближней (по отношению к РНК-полимеразе) субъединицы CRP-димера контактирует с ocNTD, а с активирующей областью дальней субъединицы CRP-димера взаимодействует С-концевой домен а-субъединицы. С помощью футпринт-экспериментов было установлено, что aCTD связывается с участком ДНК, расположенным перед сайтом связывания белка CRP [12]. Белки CRP, FNR и белок Мог бактериофага Ми являются, таким образом, представителями класса активаторов, способных удерживать РНК-полимеразу с помощью не менее двух независимых белок-белковых контактов. Для белка CRP были проведены эксперименты [140, 159] по изучению кинетики активации транскрипции, показавшие, что один CRP-RNAP контакт главным образом способствует укреплению РНК-полимеразы на промоторе и образованию закрытого комплекса, в то время как другой контакт влияет на процесс изомеризации, то есть перехода закрытого промоторного комплекса в открытый.
Примером активатора, функционирующего путем воздействия на конформацию ДНК, может считаться белок MerR, отвечающий за устойчивость к ртути и локализованный в одном из локусов транспозона Тп501. Белок MerR связывается в виде димера со своей мишенью на промоторе, которая расположена между -35 и -10 элементами промотора тегР [190]. Связывание ионов ртути с белком MerR вызывает его конформационное изменение, которое приводит к некоторому раскручиванию ДНК в районе сайта связывания белка MerR (рис. 5а), что, в свою очередь, вызывает структурную перестройку -10 и -35 промоторных элементов, при которой РНК-полимераза может начать транскрипцию промотора тегР [4]. Исследования белка SoxR [73], который принадлежит к тому же классу активаторов, что и белок MerR, показали, что его действие на транскрипцию также связано конформационными изменениями структуры промотора. Следует отметить, что приведенные выше примеры действия белков-активаторов на конформацию промотора не исключают возможности их прямого взаимодействия РНК-полимеразой.
Репрессоры, влияющие на процесс освобождения промотора
Процесс освобождения или отделение РНК-полимеразы от промотора также подвержен генетической регуляции. После формирования инициирующего комплекса РНК-полимераза должна освободиться от контакта с промотором, а также от других белковых компонентов транскрипционного комплекса.
Так называемые "сильные" промоторы характеризуются не только высокой эффективностью связывания с РНК-полимеразой, но и способностью осуществлять быстрое высвобождение промотора от транскрипционного комплекса, то есть переход от стадии инициаци к стадии элонгации [94]. Однако большинство промоторов такой способностью не обладают. Действительно, РНК-полимераза, как правило, застревает в районе от +6 до +12 пн, когда ее связывание с консенсусными элементами промотора достаточно прочное [47]. Следовательно, на этом этапе может происходить регуляция активности промотора за счет вмешательства в процесс его освобождения, что, собственно, и реализуется на примере ряда бактериальных генов. Так, ранний вирусный промотор А2с фага 029 содержит сайт связывания для белка р4, расположенный в положении -71 пн относительно сайта начала транскрипции и взаимодействующий с ctCTD. Белок р4 может формировать с РНК-полимеразой комплекс, который способствует длительному удержанию РНК-полимеразы в районе промотора и препятствует переходу транскрипционного комплекса к стадии продуктивной элонгации, о чем свидетельствует синтез коротких абортивных транскриптов [127, 128]. Было показано, что взаимодействие белка р4 с РНК-полимеразой может играть не только репрессирующую, но и активирующую роль, в зависимости от характеристик промотора [126]. Если РНК-полимераза обладает низким сродством к промотору, как, например, в случае позднего промотора A3 фага 029, то описанный выше белок р4 выступает уже в роли активатора, помогающего холоферменту удержаться на промоторе. [120, 144].
Другим интересным примером служит белок H-NS и промотор гтВ Р1. В этом случае, белок H-NS связывается в районе, перекрывающемся с кор-промотором, и обусловливает изменение его конформации, но не ингибирует последующее связывание РНК-полимеразы. Эффективно сформировавшиеся открытые комплексы способны синтезировать транскрипты длиной в три нуклеотида, после чего процесс обрывается, не переходя на ступень элонгации. Полагают, что белок H-NS меняет конформацию открытого комплекса [174].
Еще одним примером может служить действие белка FIS, связывающегося в районе между -55 и -122 пн промотора gyrB, который осуществляет репрессию последнего путем подавления этапов транскрипции, которые следует за стадией плавления промотора, то есть модуляция экспрессии происходит либо на ранних стадиях элонгации, либо на этапе освобождения промотора [173].
Освобождение промотора может блокироваться репрессором, связывающимся с промотором ниже РНК-полимеразы. Когда сайт белка-репрессора Lad расположен в районе +13 или +15 пн относительно старта транскрипции, как в случае раннего промотора фага Т7, РНК-полимераза Т7 может связаться с промотором, но рост транскрипта будет блокирован в положениях +4 пн и +6 пн, соответственно [111]. Однако если сайт связывания Lad перемещается в положении +47 пн, то наблюдается существенное снижение репрессии, которое объясняется "сталкиванием" репрессора с промотора сформировавшимся стабильным элонгационным комплексом.
Так называемые А-повторы, представляющие собой А/Т богатые последовательности ДНК, расположенные перед промотором, могут оказывать как позитивное, так и негативное влияние на процесс активации транскрипции [48]. Существуют экспериментальные данные, указывающие на роль этих повторов в формировании изгибов ДНК в промоторной области, которые приводят к его конформационным изменениям. Вместе с тем, отмечается, что содержащие А-повторы последовательности ДНК имеют определенное сходство с UP-элементами, которые, как отмечалось выше, играют важную роль в связывании aCTD с промотором [60, 166]. Предполагается, что репрессия посредством А-повторов, основанная на взаимодействии с карбокси-концевым доменом a-субъединицы РНК-полимеразы, приводит к стабилизации последней на промоторе и мешает освобождению промотора [35].
В 1961 году Жакобом и Моно была предложена теория оперона, постулирующая, что процесс регуляции транскрипции зависит от белков-репрессоров [82]. Концепция негативного контроля экспрессии генов с участием белков-репрессоров на протяжении многих лет считалась универсальной. Позднее было доказано, что большое количество бактериальных и эукариотических генов подвержено позитивной регуляции, то есть для их экспрессии необходимы белки-активаторы. Более того, при детальном изучении регуляции транскрипции с использованием различных модельных систем Е. coli выяснилось, что репрессоры могут играть роль активаторов и, наоборот, некоторые активаторы могут выступать в качестве репрессоров транскрипции. Примером такой амбивалентности действия регуляторных белков может служить репрессор сі фага лямбда, который негативно контролирует транскрипцию генов PR и его, но активирует экспрессию гена PRM [155]. Противоположная ситуация наблюдается в случае белка CRP (САР), который первоначально был открыт как активатор /ac-оперона и других катаболитчувствительных генов, а затем было показано, что на других оперонах он может функционировать в качестве белка-репрессора. Примером может служить регуляция промотора proPl, с которым белок CRP связывается в районе -34,5 пн. Выяснилось, что в отличие от большинства классических CRP-зависимых промоторов, proPl репрессируется в присутствии цАМФ, однако уровень репрессии снижается на стадии ранней логарифмической фазы, то есть в условиях, когда концентрация цАМФ в клетке снижается [210].
Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей фермента уридинфосфорилазы из гамма-протеобактерий Е. coli, S. typhimurium, Y. pseudotuberculosis и V. cholerae
Сравнительный анализ является одним из мощных инструментов исследования биологических объектов, с помощью которого можно сделать важные заключения о принадлежности организма к тому или иному таксону, фермента - к классу, аминокислоты - к группе и т. п.
В данной работе был использован упомянутый выше метод для анализа аминокислотных последовательностей (рис. 14). Выяснилось, что УФ-азы из S. typhimurium LT-2 и Yersinia pseudotuberculosis имеют значительную гомологию с УФ-азой из Е. coli К-12, процент идентичных аминокислотных остатков составляет 97 и 92, соответственно, для УФ-азы из Vibrio cholerae этот показатель несколько ниже (75%). Указанные различия согласуются с таксономическим положением данных видов, первые три из которых принадлежат к семейству Enter obacteriaceae, а последний к Vibrionaceae. Замены, обнаруженные в аминокислотных последовательностях данных белков, носят не только синонимический характер.
Обращают на себя внимание несинонимические замены (рис. 14), имеющие одни и те же координаты во всех трех белках РгобІАІа, Leul26Met и Glul35Ala (в случае УФ-азы из S. typhimurium LT-2), Asp29Gln, РгобІАІа, Leul26Met и Glul35Ser (в случае УФ-азы Yersinia pseudotuberculosis) и Asp29Ala,Pro61Ser и Leul26Met (в случае УФ-азы из Vibrio cholerae). Несмотря на определенное количество несинонимических замен в аминокислотной последовательности УФ-аз, было показано, что удельная активность белков достаточно высока и сопоставима с таковой для УФ-азы из Е. coli (табл. 7).
Известно, что УФ-аза из Е. coli представляет собой шестисубъединичный белок с молекулярной массой мономера равной 27,5 кДа [220]. Результат разделения белков клеточных лизатов, полученный с помощью электрофореза в SDS-ПААГ, говорит о том, что молекулярная масса мономера белков УФ-аз из S. typhimurium LT-2, Yersinia pseudotuberculosis и Vibrio cholerae сопоставима с таковой для УФ-азы из Е. coli (рис. 15), незначительные различия в подвижности, вероятно, объясняются обнаруженными аминокислотными заменами.
В 1995 году опубликованы данные изучения атомной структуры УФ-азы Е. coli методом рентгеноструктурного анализа, которые позволили определить пространственное строение ее молекулы с разрешением 2,5 A (Rf = 18,6%) в кристаллическом состоянии [228]. Показано, что каждая пара субъединиц образует димер. Область взаимодействия субъединиц в димере сформирована остатками Arg48-Glu49, Gly68-Ile69, Glyl 18-А1а123, Aspl60yrl63 (рис. 14).
При внимательном изучении аминокислотных последовательностей УФ-аз. полученных нами и взятых из банка данных NCBI (рис. 14), бросается в глаза, что все они содержат аналогичные, строго консервативные участки аминокислотной последовательности в указанных выше районах, что может являться косвенным доказательством одинакового строения изучаемых белков.
Мономер УФ-азы из Е. coli является ооф-белком и содержит два смешанных Р-листа, шесть а-спиралей и две короткие Зю-спирали [131]. Общее содержание ос-спиральных участков в белке составляет приблизительно 30%, Р-лент - 35%. Из десяти остатков пролина, один (Рго229) находится в г/г/с-конформации, а остальные -в /яранс-конформации. Все семь остатков гистидина расположены на поверхности субъединицы. Внутренняя часть молекулы выстлана гидрофобными остатками. У исследуемых нами УФ-аз наблюдаются определенные отличия в содержании в составе белковой молекулы вышеупомянутых аминокислотных остатков. Так, в положении 61 пролин заменен несинонимическими аминокислотами (см. выше), а у УФ-азы из Vibrio cholerae он появляется в положении 132 (рис. 14). Что же касается остатков гистидина, то у УФ-аз из S. typhimurium LT-2 (Hisl79Arg) и Vibrio cholerae (Hisl79Arg, His240Arg) они синонимически заменены на аргинин.
Локализованный внутри молекулы положительно заряженный остаток аргинина Arg91, по мнению авторов работы [228], играет решающую роль в связывании одного из субстратов - фосфата. С этим мнением хорошо согласуются результаты сайт-направленного мутагенеза, описанные в работе [229]. Так, при синонимической замене Arg91Lys мутация сохраняла положительный заряд, но удаляла гуанидиновую группу аргинина, способную создавать разветвленные водородные и ионные связи. Потеря мутантом с синонимической заменой Arg91Lys ферментативной активности свидетельствовала о функциональной важности остатка Arg91. Принимая во внимание представленные литературные данные, а также полученные в данной работе результаты (табл. 7, рис. 14 и 15), и изучив все представленные в базе данных NCBI аминокислотные последовательности, можно констатировать, что независимо от таксономической принадлежности, УФ-азы содержат в положении 91 аргинин, играющий важную роль в функционировании фермента.
Вследствие того, что рентгеноструктурный анализ был выполнен в отсутствие субстратов, нельзя точно определить какие именно аминокислотные остатки принимают участие в связывании фосфата, какие входят в активный центр фермента. Однако существует ряд косвенных доказательств, указывающих на существование вырожденной петли Россмана (участок Рго61-Рго72), в состав которой входят консервативные остатки серина, ответственные за связывание фосфат-иона [229]. Авторы статьи [229] приводят доказательства того, что в связывании фосфат-иона принимают участие кроме Arg91 еще четыре аминокислотных остатка Asp27, Ser66, Ser73nSerl99.
В то же время, следует отметить, что обнаруженная нами высокая ферментативная активность УФ-азы из Vibrio cholerae противоречит данным статьи [220] о важности остатка Cysl36 с точки зрения стабильности фермента, которые показали, что его замена на несинонимический остаток серина приводит к полной деградации фермента протеиназами. В аминокислотной последовательности УФ-азы из Vibrio cholerae на месте 136 находится несинонимический цистеину остаток валина (рис. 14), при этом никакой деградации белка не обнаружено (рис. 15), более того, как уже говорилось, УФ-аза из Vibrio cholerae обладает достаточно высокой ферментативной активность (табл. 7).
