Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 10
1.1. Структура клеточной стенки растения 10
1.2. Рост клеток растяжением. Теория «кислого роста» 11
1.3. Участие фитогормонов в регуляции клеточного растяжения 13
1.4. Транскрипционные факторы и белки с OSR-доменом, 17 участвующие в регуляции клеточного растяжения
1.5. Роль эндоглюканаз в регуляции клеточного растяжения 19
1.6. Участие ксилоглюканэндотрансгликозолаз / гидролаз в 21 регуляции клеточного растяжения
1.7. Гидроксильный радикал и его роль в клеточном растяжении 23
1.8. Роль экспансинов в обеспечении роста клеток растяжением 1.8.1. Характеристика структурных особенностей экспансинов 24
1.8.2. Эволюция экспансинов 27
1.8.3. Механизм действия экспансинов на клеточные стенки 29
1.8.4. Влияние экспансинов на размеры органов растений 31
1.8.5. Роль экспансинов в развитии клеток древесного волокна 35
1.8.6. Влияние экспансинов на адаптацию растений к абиотическим стрессам
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Объекты исследования 41
2.2. Выделение и очистка тотальной ДНК растений 41
2.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК 42
2.4. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами 44
2.5. Аналитический гель-электорофорез ДНК 45
2.6 Препаративный гель-электорофорез ДНК 45
2.7. Элюция ДНК из агарозных гелей
2.8. Полимеразная цепная реакция 47
2.9. Подготовка компетентных клеток Е. coli 50
2.10. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК 50
2.11. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным 51 методом
2.12. Подготовка электрокомпетентных клеток Е. coli и 52 Agrobacterium tumefaciens
2A3. Электропорация компетентных клеток Е. coli и Agrobacterium 53
tumefaciens
2.14. Агробактериальная трансформация листовых дисков табака 55
2.15. Выделение РНК и построение кДНК 57
2.16. Количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени 58
2.17. Стерилизация и выращивание семян трансгенных растений 58 табака на селективной среде
2.18. Морфологический анализ трансгенных растений 59
2.19. Экзогенная обработка растений табака фитогормонами 59
2.20. Определение плоидности трансгенных растений 60
2.21. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 60
2.22. Статистическая обработка полученных результатов 61
2.23. Реактивы и материалы 61
2.24. Составы использованных стандартных растворов 63
Глава 3. Результаты и обсуждение 64
3.1. Гены экспансинов табака (Nicotiana tabacum) 64
3.1.1. Родство генов экспансинов табака с экспансинами других 64 растений
3.1.2. Роль генов экспансинов NtEXPAl и ШЕХРА4 в регуляции 66 клеточного растяжения при росте органов табака
3.1.2.1. Влияние экзогенных фитогормонов на изменение уровня 68 транскрипции генов экспансинов табака
3.1.2.2. Влияние индуцибельной экспрессии гена ARGOS-LIKE на изменение уровня транскрипции экспансинов табака
3.1.2.3. Конститутивная экспрессия гена NtEXPAl 74
3.1.3. Конститутивная экспрессия гена ШЕХРА5 в трансгенных растениях табака
3.1.4. Конститутивная и индуцибельная экспрессия гена ШЕХРА6 88
3.1.4.1. Создание трансгенных растений табака, с повышенной экспрессией г&н&№ЕХРА6
3.2. Конститутивная экспрессия гена AtEXPAlO A. thaliana в трансгенных растениях табака
3.2.1. Амплификация и клонирование гена AtEXPAl0 101
3.2.2. Получение трансгенных растений табака с повышенной 103 экспрессией гена AtEXPAl 0
3.2.3. Морфологический анализ трансгенных растений табака с 107 повышенной экспрессией гена AtEXPAl 0
3.3. Клонирование и исследование генов экспансинов тополя 113
черного (Populus nigra L.)
3.3.1. Конститутивная экспрессия гена РпЕХРА 1 114
3.3.1.1. Амплификация и клонирование гена PnEXPAl 114
3.3.1.2. Получение трансгенных растений с конститутивной экспрессией гена PnEXPAl
3.3.1.3. Морфологический анализ трансгенных растений с конститутивной экспрессией гена PnEXPAl
3.3.2. Конститутивная экспрессия гена РпЕХРАЗ 125
3.3.2.1. Амплификация и клонирование гена РпЕХРАЗ 125
3.3.2.2. Получение трансгенных растений с конститутивной экспрессией гена РпЕХРАЗ
3.3.2.3. Морфологический анализ трансгенных растений с конститутивной экспрессией гена РпЕХРАЗ
Заключение 137
Выводы 139
Список литературы
- Участие фитогормонов в регуляции клеточного растяжения
- Выделение и очистка тотальной ДНК растений
- Статистическая обработка полученных результатов
- Конститутивная экспрессия гена ШЕХРА5 в трансгенных растениях табака
Участие фитогормонов в регуляции клеточного растяжения
Рост растяжением является уникальной особенностью растительных клеток. В данном процессе, который также называют «кислым ростом», ключевую роль играет ЕҐ-АТФаза плазмалеммы, которая, гидролизуя молекулу АТФ, переносит образовавшиеся ионы водорода через мембрану клетки (Опритов, 2000). При увеличении скорости выделения протонов в плазмалемму экстрагируется доля белков, участвующих в регуляции активности Н+-АТФазы. Одним из них является фузикокцин, содержание которого увеличивается в растягивающихся клетках (Месенко, 2003). Другой активатор протонной помпы - индолилуксусная кислота - стимулирует растяжение чувствительных к ауксину тканей в стеблях, черешках листьев, корнях (в низких концентрациях) и колеоптилях (Обручева, 2008). При воздействии ауксина на клеточные стенки начинается быстрое понижение рН среды, и ускорение роста происходит через 10-20 минут (Обручева, 2008). Низкий рН активизирует локализованные в апопласте специфичные гидролазы, которые расщепляют поперечные водородные связи между полимерами клеточной стенки, в частности, между микрофибриллами целлюлозы и прилежащим к ним гемицеллюлозным матриксом, что позволяет им скользить относительно друг друга. Расщепление этих связей ослабляет клеточную стенку, снижение прочности которой ведет к нарушению равновесия водного потенциала клетки, поглощению воды клеточной вакуолью и увеличению размеров клетки. Таким образом, ослабление связей между компонентами клеточной стенки ведет к увеличению размеров клетки.
В то же время имеется предположение о том, что первичное действие ауксинов обусловлено не закислением матрикса клеточной стенки, а их взаимодействием с рецепторами и образованием гормон-рецепторного комплекса, который проникая в ядро, влияет на активность генов, кодирующих ферменты, определяющих разрыхление клеточной стенки (Хаблак и др., 2013).
Прекращение растяжения клеток связано, во-первых, с ослаблением подкисления клеточных стенок, т.е. с остановкой «кислого роста». При прекращении растяжения аминоциклопропанкарбоновой кислотой происходит частичная инактивация Н+-АТФазы в плазматической мембране, что приводит к подщелачиванию оболочек. Существенные изменения происходят и в самих клеточных стенках: снижается степень разветвленности связующих гликанов, увеличивается количество поперечных водородных связей между ними и целлюлозой и диферулатных сшивок между молекулами связующих гликанов, а также снижается метоксилирование пектинов, в результате которого они превращаются в жесткий пектиновый гель, путем образования пектатов кальция. Одновременно происходит формирование вторичной клеточной стенки, что снижает способность клеток к растяжению (Обручева, 2008).
Фитогормоны имеют очень большое значение в регуляции ростовых процессов в растительном организме. Они влияют на рост и деление клеток, на процессы адаптации и старения, на транспорт веществ, дыхание, синтез нуклеиновых кислот и белков и многие другие процессы. Однако у каждой группы этих соединений имеются свои специфические особенности (Чайлахян, 1982).
Ауксины участвуют в регуляции деления и роста клеток, дифференцировки корней, а также многих других процессов роста и развития растений. Рецептор ауксина TIR1 обеспечивает разрушение Aux/IAA белков-репрессоров ауксин-зависимых генов в убиквитин-протеасомной системе, и таким путем включает генетическую программу ответа клетки на ауксин (Кунаева, 2006). Также он индуцирует экспрессию ряда генов, которые принимают участие в регуляции клеточного растяжения, например гена ARGOS-LIKEA. thaliana (Ни et al, 2006).
Этилен вовлечен в регуляцию таких физиологических процессов, как прорастание семян, рост клеток растяжением, развитие корневых волосков, формирование генеративных органов. В A. thaliana идентифицировано пять рецепторов этилена (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2, EIN4), локализованные в эндоплазматическом ретикулуме и служащие негативными регуляторами этиленового сигналинга (Шакирова, 2010). Этилен синтезируется в клетках плода и регулирует работу многих генов, направленных на его созревание и размягчение. Одним из таких хорошо изученных генов является ген экспансина горной папайи {Vasconcellea pubescens L.) VpEXPA2. Экзогенный этилен увеличивал экспрессию данного гена в плодах горной папайи, в то время как 1-метилциклопропен, ингибитор этилена, подавлял его экспрессию (Gaete-Eastman et al, 2009).
Цитокининам отводится исключительно широкий спектр регуляторных действий, который включает регуляцию роста, дифференциацию листьев и корней, образование сосудистой системы, фотосинтез, старение, а также адаптацию растений к разнообразным стрессовым факторам (Шакирова, 2010). Цитокинины стимулируют переход клеток корня от деления к растяжению. Однако трансгенные растения, экспрессирующие цитокининоксидазу, и мутантные растения, дефицитные по цитокининам, имеют усиленный рост и ветвление корней, что говорит о негативной роли цитокининов в корнеобразовании. При изучении в культуре клеток сои в экспансивной фазе роста влияния цитокининов на экспрессию экспансинов наблюдалось накопление определенной формы белка экспансина Сіті. В стационарной фазе роста его уровень снижался, что не связано с общим снижением внеклеточных белков и свидетельствует о существовании Ciml-специфичных протеаз (Downes et al., 1998).
Выделение и очистка тотальной ДНК растений
ДНК из листьев табака, тополя и арабидопсиса выделяли фенольно-детергентным методом (Graham, 1978) с некоторыми модификациями. Растительный материал растирали в ступке с жидким азотом до порошкообразного состояния, не допуская его размораживания. Затем его переносили в колбу, добавляли 5 объемов (по отношению к исходной навеске растительного материала) экстрагента, содержащего 100 мМ трис-HCl рН 8,0, 20 мМ ЭДТА, 1%-ный ДДС натрия, и, слегка помешивая, прогревали на водяной бане при 60С в течение 10 мин. Охладив суспензию до комнатной температуры, добавляли 5 М NaC104 до конечной концентрации 1 М. Экстракцию ДНК, с ее одновременной депротеинизацией, осуществляли, встряхивая гомогенат с равным объемом (по отношению ко всему объему гомогената) смеси 80% свежеперегнанного фенола (доведенного до рН 8,0 или с помощью многократных насыщающих встряхиваний с трис-HCl, рН 8,0 или путем добавления 5 М NaOH из расчета 1,5 мл щелочи на 100 мл фенола), хлороформа и изоамилового спирта (взятых в соотношении 25:24:1) в течение 30 мин. Смесь расслаивали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин в микроцентрифуге MiniSpin Plus (Ependorf). Верхний водно-солевой слой, содержащий нуклеиновые кислоты, отбирали пипеткой с широким оплавленным кончиком и повторно депротеинизировали хлороформом (здесь и далее при упоминании использовании хлороформа имеется ввиду его смесь с изоамиловым спиртом в соотношении 24:1) в течение 20 мин. Затем смесь центрифугировали и ДНК осаждали, перенося водно-солевую фазу в пробирки с двумя объемами охлажденного 96%-ного этанола. Спиртовой осадок ДНК собирали центрифугированием, промывали 70%-ным этанолом для удаления следов фенола, подсушивали и растворяли в минимальном объеме (50 мкл) деионизированной воды mQ.
Плазмидную ДНК из бактерий выделяли методом мягкого лизиса (Clewel et al., 1969) с некоторыми модификациями. Колонией Е. coli, несущей ту или иную плазмиду, засевали 100 мл среды Лурия - Бертани (LB), содержащей селективный антибиотик и 12,5 мкг/мл тетрациклина для штамма Е. coli XL 1-Blue, несущего на эписоме транспозон ТпЮ, определяющий устойчивость к данному антибиотику), и выращивали при 37С на орбитальном шейкере ES-20 (Biosan, Латвия) в течение ночи. Часть полученной ночной культуры переносили, обеспечив ее 100-кратное разбавление, в колбу со свежеприготовленной средой LB, содержащей необходимые антибиотики. Наращивание продолжали до достижения оптической плотности, соответствующей концентрации 2 - 3-х 10 клеток/мл (обычно 14-16 час).
Затем бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин в центрифуге Eppendorf. Осадок суспендировали в 8 мл 10%-ной сахарозы. После добавления 2 мл свежеприготовленного раствора лизоцима (10 мг/мл в 0,25 М трис-HCl, рН7,8) выдерживали 10 мин при 0С и добавляли 2 мл 0,5 М ЭДТА и продолжали инкубацию еще в течение 5 мин при прежних условиях. Лизис проводили с помощью смеси детергентов бридж / 58-дезоксихолат натрия (конечные концентрации 1% и 0,4%, соответственно). Осторожно перемешивали в течение 5 мин пока раствор не становился вязким и прозрачным. Полученный лизат осветляли в ультрацентрифуге Optima L-90K (Beckman Coulter, Inc. США) в течение 45 мин при 29000 об/мин. Осторожно сливали супернатант, не допуская перетекания вместе с ним иногда образующегося вязкого придонного слоя, содержащего хромосомную ДНК, и добавляли к нему 1/5 объема 5 М NaCl и 1/4 объема 50%-го полиэтиленгликоля 6000. При 0С в холодильнике в течение нескольких часов формировался осадок плазмидной ДНК, содержащий загрязняющее количество РНК, белка, полисахаров.
ДНК осаждали в центрифуге Eppendorf при 3000 об/мин в течение 10 мин. После растворения осадка віх ТЕ перед этапом депротеинизации проводили удаление остаточного полиэтиленгликоля встряхиванием с хлороформом и расслаиванием в центрифуге Eppendorf при 2500 об/мин в течение 5 мин. Депротеинизацию проводили встряхиванием с равным объемом смеси хлороформа и 80%-ого свежеперегнанного фенола (рН 8,0), взятых в соотношении 1:1 в течение 10 мин. Затем проводили центрифугирование в центрифуге Eppendorf при 2500 об/мин в течение 20 мин. Верхний водно-солевой слой, содержащий ДНК, отсасывали и подвергали повторной депротеинизации по той же схеме. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока не исчезала интерфаза, состоящая из денатурированного белка. Затем супернатант встряхивали с равным объемом хлороформа с последующим центрифугированием и осаждали ДНК двумя объемами этанола. Спиртовой осадок ДНК промывали 70%-ным этанолом для удаления следов фенола и хлороформа и растворяли в соответствующем объеме деионизированной воды mQ.
При анализе рекомбинантных клонов для определения размера вставки применяли быстрый метод щелочного лизиса бактериальных колоний (Sambrook, 1989). Для этого стерильной петлей переносили бактериальные колонии в микроцентрифужные пробирки и тщательно суспендировали в 100 мкл раствора I, содержащего 50 мМ трис-HCl (рН 7,8) и 20 мМ ЭДТА. Затем добавляли 200 мкл раствора II, содержащего 1%-ный раствор ДДС натрия и 0,2 М NaOH. После осторожного перемешивания через 5 мин добавляли 150 мкл 5 М ацетата калия (рН 5,0). Тщательно перемешав, выдерживали при 0С в течение 10 мин и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин. Осторожно отбирали осветленную жидкость, не захватывая осадок и липидный слой, и осаждали ДНК двумя объемами этанола при - 20С. После растворения сформировавшегося и собранного в микроцентрифуге осадка в минимальном объеме mQ-воды препараты ДНК были готовы для их непосредственного анализа агарозным гель-электрофорезом и при необходимости для расщепления соответствующими рестрикционными эндонуклеазами.
Статистическая обработка полученных результатов
В результате полученных данных можно сделать вывод о том, что БАП и НУК оказывают положительное влияние на уровень транскрипции генов экспансинов NtEXPAl и ШЕХРА4. В то же время воздействие экзогенными гиббереллинами не изменяет уровень содержания мРНК данных генов. Брассиностероиды способны по-разному влиять на транскрипцию генов NtEXPAl и ШЕХРА4. В третьем листе под влиянием 24-эпибрассинолида наблюдалось уменьшение содержания мРНК гена NtEXPAl и повышение уровня транскириптов гена ШЕХРА4. Похожие результаты были получены при исследовании воздействия брассиностероидов на гены экспансинов нута (Sanchez et al., 2004). Экзогенные брассиностероиды индуцировали транскрипцию генов СаЕХРА2 и СаЕХРА4 и, практически, не оказывали влияния на гены CaEXPAl и СаЕХРАЗ. В связи с этим авторы предполагают, что экспансины связаны с брассиностероид-индуцированным растяжением клеток (Sanchez et al, 2004).
Влияние индуцибельной экспрессии гена ARGOS-ЫКЕ на изменение уровня транскрипции экспансинов табака
Ранее у A. thaliana был выделен и изучен ген ARGOS-LIKE, продукт которого эффективно регулирует клеточное растяжение (Ни et al., 2006). Поэтому нам было интересно посмотреть, как повышенная экспрессия данного гена способна влиять на активность транскрипции генов NtEXPAl и ШЕХРА4. В связи с этим, нами были созданы трансгенные растения табака, с индуцибельной экспрессией гена ARGOS-LIKE под контролем XVE-эстрадиол-индуцибельной системы вектора pER8 (рис. 6, 7) (Zuo et al., 2000). Экзогенный эстрадиол запускал экспрессию гена ARGOS-LIKE и, соотвественно, способствовал увеличению размеров клеток и вегетативных органов трансгенных растений табака.
Схема вектора pER8. PGlO-90 промотор, XVE - эстрадиол-индуцибельный активатор, HPT - ген устойчивости к гигромицину, Pnos -нопалин-синтазный промотор, Tnos - нопалин-синтазный терминатор, MCS - полилинкер. M 01 ARC0S-L1KE 1
Схема клонирования гена ARGOS-LIKE в плазмиду pER8. Используя ОТ-ПЦР в реальном времени, мы определили уровень содержания мРНК генов NtEXPAl и ШЕХРА4 в данных растениях. Было установлено, что в четвертом от верхушки побега листе уровень транскрипции TGH& NtEXPAl повышался в 1,7 раза, аг&на№ЕХРА4, наоборот, снижался в 1,2 раза под влиянием индуцибельной экспрессии гена ARGOS-LIKE (рис. 8).
Полученные нами данные говорят о том, что гены экспансинов и белков с OSR-доменом взаимосвязаны в системе клеточной сигнализации. Из литературных данных следовало, что повышенный уровень экспрессии гена ARGOS-LIKE может способствовать стимуляции транскрипции генов экспансинов (Ни et al., 2006). Однако вопреки ожиданиям, ARGOS-LIKE увеличивал уровень транскрипции одного экспансина и уменьшал его у другого экспансина. Это говорит о существовании более сложных взаимоотношений между экспансинами и белками с OSR-доменом в системе клеточной сигнализации. Таким образом, два исследованных нами гена экспансина имеют, скорее всего, разные по строению промоторы и могут выполнять различные функции при регуляции роста органов табака.
Для доказательства влияния исследуемых экспансинов на рост клеток растяжением нами были созданы трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией гена NtEXPAl под контролем промотора вируса мозаики георгина.
Для морфо физиологического анализа трансгенных по гену NtEXPAl растений табака были отобраны линии под номерами 1, 6, 7, 8, 11, 13, 15 и 20 с подтвержденным повышенным уровнем экспрессии целевого гена. Удлинение листьев было характерно для линий 1,7, 15 и 20 (рис. 9а), причем степень увеличения длины листьев достигала 30% по сравнению с контролем для линии 7 (рис. 9а). По площади листьев также многие трансгенные растения характеризовались увеличением, в среднем, от 7% у линии 13 до 51% у линии 7 (рис. 96). Достоверное увеличение длины стебля было зафиксировано для линий 1, 7 и 11 (Рис. 9в). Причем длина стебля трансгенных растений была более чем на 23% выше стебля контро лных растений (для линии 7). Конститутивная экспрессия гена NtEXPAl не способствовала увеличению размеров цветков (рис. 9г). Наоборот, для линий 1 и 8, где была высокая активность транскрипции этого гена, зафиксировано достоверное уменьшение длины венчика цветков. По размерам семенных коробочек контрольные и опытные растения не различались.
Для выяснения доли морфологических изменений в тканях листа в увеличении размеров листьев были проведены измерения площади клеток эпидермиса листьев контрольных и трансгенных растений (рис. 9д). Было показано, что у растений линий 1, 7, 11, 15 и 20 размер клеток эпидермиса листьев по сравнению с контролем повышен (рис. 9д). Увеличение размеров клеток положительно коррелировало с изменением в размерах листьев. В связи с этим можно предположить, что основной причиной такого явления была стимуляция роста клеток растяжением продуктом гена NtEXPAl. Площадь клеток эпидермиса цветков у опытных растений также возрастала по сравнению с контролем (рис. 9е), однако соответствующего увеличения размеров цветков не происходило, что предполает наличие в растениях компесаторных механизмов, препятствующих изменениям размера цветка.
Конститутивная экспрессия гена ШЕХРА5 в трансгенных растениях табака
Как было установлено ранее, повышенная экспрессия экспансинов чаще всего способствует увеличению размеров органов (Cho, Cosgrove, 2000, Gray-Mitsumune et al., 2008), однако имеются данные и о негативном влиянии экспансинов на рост растений (Гао и др., 2010). Часть полученных нами трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией гена ШЕХРА6 характеризовались увеличением, прежде всего, размеров листьев и стебля, что еще раз подтверждает участие продукта данного гена в регуляции роста побега и косвенно доказывает функциональную полноценность белка МЕХРА6. Конститутивная экспрессия гена ШЕХРА6 негативно сказывалась лишь на росте цветков, а размеры листьев и стебля у одной части линий при этом увеличивались, а у другой части линий оставались неизменными. При этом основной причиной увеличения размеров органов у опытных растений было изменение размеров отдельных клеток. Все эти данные хорошо соотносятся с нашими результатами по морфологическому анализу трансгенных растений, конститутивно экспрессирующих ген NtEXPAl. В то же время при индуцибельной экспрессии исследуемого гена, в первую очередь, увеличивалась высота стебля, а не размеры листьев, что сближает гены ШЕХРА5 и ШЕХРАб по механизму действия между собой. Пролонгирования роста листьев трансгенных растений при обработке их эстрадиолом не происходило, что, скорее всего, связано с уменьшенной восприимчивостью клеточных стенок к избытку экспансина у прекративших рост листьев. В отличие от генов NtEXPAl и ШЕХРА5 сверхэкспрессия гена ШЕХРАб довольно часто способствовала уменьшению размеров органов, что может быть связано с излишней дезорганизацией микрофибрилл целлюлозы, которая может снижать рост органов (Гао и др., 2010), причем этим же может объясняться низкий уровень экспрессии данного экспансина даже в молодых органах. Судя по всему, ген ШЕХРАб, в отличие от некоторых других экспансинов табака, едва ли может быть использован для создания трансгенных растений с увеличенными размерами органов, так как его сверхэкспрессия довольно часто, вопреки ожиданиям, способствует уменьшению размеров листьев, стебля и цветков.
Влияние экзогенных фитогормонов на уровень транскрипции гена ШЕХРАб показало, что ауксины и цитокинины обладали только стимулирующим эффектом, что соответствует литературным данным, относящимся к другим экспансинам (Jung et al., 2010). Цитокинины, как и в нашем предыдущем исследовании генов NtEXPAl и ШЕХРА4 в меньшей степени влияли на транскрипцию экспансинов, чем ауксины, причем уже в третьем листе, эта группа фитогормонов переставала влиять на транскрипцию гена ШЕХРАб. Брассиностероиды повышали уровень транскрипции данного гена во втором и третьем от верхушки побега листе. Интересно отметить, что в листьях более старшего возраста, чем третий от верхушки побега лист, обработка экзогенными фитогормонами не изменяла уровень транскрипции гена МЕХРАб.
Дальнейшая наша работа была связана с исследованием экспрессии экспансинов в гетерологичных условиях. В первую очередь, нами была поставлена задача по клонированию гена экспансина AtEXPAlO A. thaliana, повышенная экспрессия которого, по литературным данным, способствовала увеличению размеров органов (Cho et al., 2000). Планировалось получить трансгенные растения табака, с повышенной экспрессией гена AtEXPAlO, с целью выяснения эффективности экспрессии данного экспансина в гетерологичных условиях.
Для подбора праймеров и амплификации гена AtEXPAlO A. thaliana была использована нуклеотидная последовательность под номером NM102440.3 из GenBank. Из тотальной ДНК A. thaliana при помощи соответствующих праймеров AtEXPAF и AtEXPAR (табл. 1) амплифицировали полноразмерную копию гена AtEXPAlO размером около 1000 п.н. (рис. 28).
Целевой ампликон был клонирован в векторе pKRX, а затем секвенирован. Анализ нуклеотидных последовательностей показал, что выделенная нами копия гена полностью совпадает с теоретически ожидаемой последовательностью и не содержит нуклеотидных замен.
При создании генно-инженерных конструкций использовали вектор pCambia 1301. Для поиска целевого клона использовали пару праймеров 35SCambF и 1301R, которые при амплификации давали специфический ПЦР-продукт размером 918 п.н. Ген AtEXPAlO был выщеплен из вектора pKRX по сайту BsePI и обработан Т4-ДНК-полимеразой для формирования «тупых» концов. Модифицированный вектор pCambia 1301 был расщеплен по сайту рестрикции Smal. После проведенных процедур в этом векторе осуществили ненаправленное клонирование гена AtEXPAlO (рис. 11). Поиск клонов со смысловой ориентацией целевых генов осуществляли при помощи комбинации праймеров 35SCambF, 1301R, AtEXPAF и AtEXPAR (табл. 1). Целевые генно-инженерные конструкции давали специфичные ампликоны при ПЦР только в случае сочетания пар праймеров 35SCambF/AtEXPAR и 35SCambF/1301R, а при сочетании пар 35SCambF/AtEXPAF амплификация проходила только в случае антисмысловой ориентации целевых генов. Кроме этого, для проверки полученных генно-инженерных конструкций использовали рестрикционный анализ и секвенирование. После полной проверки, полученные генно-инженерные конструкции были внедрены в клетки A. tumefaciens. Скрининг целевых клонов в агробактериях осуществляли при помощи ПЦР-анализа с праймерами AtEXPAF/AtEXPAR. Агробактериальные клоны, содержащие вектор pCambia 1301 с геном AtEXPAlO в сенс-ориентации, были использованы для экспериментов по трансформации листовых дисков табака.
