Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Введение 11
1.2. Строение и функции генов, принимающих участие в регуляции скорости развития растений арабидопсиса 15
1.2.1. Гены, управляющие формированием и поддержанием меристем 15
1.2.2. Строение и функции генов, принимающих участие в индукции цветения у арабидопсиса 22
1.3. Гомологи генов скорости развития у других растений 32
1.4. Гомологи генов, определяющих скорость развития у растений рода Brassica 36
1.5. Патенты, основанные на использовании генов, контролирующих скорость развития растения 41
1.6. Заключение и постановка задач диссертационной работы 43
2. Материалы и методы 45
2.1. Материалы 45
2.2. Методы 46
2.2.1. Выделение геномной ДНК из тканей растений 46
2.2.2. Амплификация фрагментов геномной ДНК 48
2.2.3. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК 48
2.2.4. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК 49
2.2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 50
2.2.6. Анализ полиморфизма длин рестриктных фрагментов ДНК (RFLP) 50
2.2.7. Идентификация и сравнительный анализ фрагментов генов 53
3. Результаты 55
3.1. Выбор праймеров для амплификации геномной ДНК 55
3.2. Выделение и идентификация гомологов генов скорости развития у Brassicaceae 56
3.3. Результаты RFLP анализа 65
4. Обсуждение 80
4.1. Первичное строение гомологов генов развития у растений Brassica 80
4.2. Полиморфизм гомологов генов развития по рестриктным сайтам 99
Заключение 112
Выводы 115
- Строение и функции генов, принимающих участие в регуляции скорости развития растений арабидопсиса
- Гомологи генов, определяющих скорость развития у растений рода Brassica
- Методы
- Выделение и идентификация гомологов генов скорости развития у Brassicaceae
Введение к работе
Общая характеристика работы. Развитие живого организма можно рассматривать как возникновение, усложнение или редукцию различных органов и тканей и изучать этот процесс как изменения во времени методами морфологии, биохимии или молекулярной генетики.
У высших животных подавляющее большинство органов, присущих взрослому организму, формируется на стадии эмбриогенеза. Органы взрослого растения формируются уже на стадии постэмбрионального развития, и источником этих органов служат апикальная меристема побега и корня. Способность меристем постоянно продуцировать новые органы в течение всей жизни растения позволяет растительному организму гибко изменять свое строение в зависимости от условий внешней среды. Благодаря тому, что меристемы являются источником всех органов взрослого растения и способны постоянно продуцировать эти органы, их роль в развитии растительного организма очень высока. Поэтому, говоря о развитии растений вообще и о скорости развития в частности, необходимо помнить, что все эти процессы напрямую связаны с состоянием и функциональной активностью меристем.
Апикальная меристема побега (shoot apical meristem, SAM) состоит из группы стволовых клеток, которые постоянно делятся и дают начало латеральным органам. Постоянная дифференцировка стволовых клеток и превращение их в клетки латеральных органов требуют непрерывного возобновления этих клеток путем деления. Поддержание баланса между клеточными делениями и клеточной дифференцировкой служит залогом правильного функционирования SAM. На стадии вегетативного развития растения SAM дает начало фитомерам, повторяющимся структурным единицам побега. Каждый фитомер состоит, как правило, из одних и тех же элементов: узла, к которому прикрепляется лист, междоузлия и придаточной почки у основания листа, однако размеры этих элементов могут значительно варьировать в зависимости от расположения фитомера на стебле. Временной интервал между формированием отдельных фитомеров, который называют пластохроном, часто используют как показатель скорости развития (Howell, 1998). Меристемы придаточных почек по своему строению сходны с апикальной меристемой и могут служить источником боковых побегов.
В определенный момент времени растение переходит от вегетативного к репродуктивному развитию, то есть начинает продуцировать генеративные органы. Этот переход также осуществляется на уровне SAM, которая дает начало флоральным меристемам (FM). Эти меристемы отличаются от SAM тем, что в них блокируется процесс возобновления недифференцированных стволовых клеток путем деления; конечного числа этих клеток в FM достаточно только для того, чтобы сформировать органы цветка, после чего она прекращает свое существование.
Таким образом, вегетативное и репродуктивное развитие растения связано с активностью недетерминированных и детерминированных меристем (SAM и FM), а продолжительность вегетативной фазы и время перехода к цветению определяют общую скорость развития.
Процессы, связанные со скоростью развития, регулируются на генетическом уровне (Лутова и др., 2000; Howell, 1998). Избирательное «включение» одних и «выключение» других генов в определенные моменты времени обеспечивает на стадии вегетативного развития постоянство структуры SAM, а при переходе к цветению активирует формирование и дифференциацию FM. Многие гены, принимающие участие в этих процессах, были идентифицированы у модельного растения Arabidopsis thaliana и еще нескольких видов растений (рис, кукуруза, томаты и т.п.). Однако у подавляющего большинства хозяйственно ценных растений процесс идентификации генов, определяющих скорость развития, и изучение их строения и конкретного места в процессах развития находится еще в самом начале.
Большинство методов идентификации новых генов у этих растений основаны на том, что многие гены очень медленно изменяются в процессе эволюции. Такой консерватизм структуры позволяет использовать уже исследованные у других растений гены для анализа геномных библиотек или искать сходные нуклеотидные последовательности в генетических базах данных и судить о функции генов по аналогии с уже изученными генами. Такой подход получил название концепции генов-кандидатов (Хавкин, 1998). Эта концепция широко применяется и для идентификации генов развития. Однако сложность состоит в том, что фенотипические проявления скорости развития складываются в результате сложных взаимодействия многих генов друг с другом и факторами внешней среды и являются, как правило, количественными признаками. Генов-кандидатов на ключевую роль в формировании такого признака может быть несколько, и для того чтобы определить вклад конкретного гена в формирование количественного признака в определенных условиях роста растения необходимо соотнести фенотипический полиморфизм по этому признаку с полиморфизмом геномной организации. Результатом такого соотнесения является обнаружение в геноме локусов количественных признаков (quantitative trait loci, QTL). Эти локусы картируют, соответствующие QTL фрагменты генома клонируют и секвенируют, и в полученных последовательностях идентифицируют гены-кандидаты. Решающим фактором успеха такой стратегии является наличие как можно более насыщенных генетических карт, поэтому использование фрагментов предполагаемых генов-кандидатов в качестве ДНК маркеров позволяет наиболее точно картировать QTL, а в случае высокой степени косегрегации такого ДНК маркера с QTL доказать роль этого гена в формировании признака без клонирования и секвенирования.
Генетические и молекулярно-генетические исследования скорости развития культурных растений очень важны для практической селекции, поскольку с этими генами связан такой важный агрономический признак, как ранне/позднеспелость.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выделение и сравнительный анализ фрагментов генома растений семейства Brassicaceae, гомологичных важнейшим генам, определяющим скорость развития у A. thaliana, и использование полученных фрагментов для изучения полиморфизма этих генов у широкого круга хозяйственно ценных форм рода Brassica, чтобы установить связь структурного полиморфизма генов с фенотипическим полиморфизмом форм Brassica по признакам скорости развития. В процессе работы предстояло решить следующие задачи:
, 1. выбрать гены-кандидаты, гомологичные генам, определяющим скорость развития у A. thaliana, получить эти гомологи путем прямой амплификации геномной ДНК растений Brassica методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами и клонировать полученные фрагменты генома;
2. идентифицировать эти фрагменты генома как гомологи генов развития A. thaliana путем анализа их нуклеотидных и производных аминокислотных последовательностей;
3. сравнить полученные гомологи с уже известными генами развития цветковых растений путем компьютерного анализа с использованием генетических баз данных;
4. изучить возможность использовать полученные гомологи генов развития в качестве гибридизационных зондов в RFLP анализе;
5. провести RFLP анализ разнообразия генов развития у хозяйственно ценных форм растений рода Brassica.
# 6. сопоставить полиморфизм генов развития с фенотипическими проявлениями скорости развития исследуемых форм Brassica.
Научная новизна. Из растений Brassica и Camelina клонированы и охарактеризованы 13 новых гомологов генов развития A. thaliana, которые принадлежат к четырем структурным классам генов. Получены новые данные о структурном полиморфизме этих генов у растений Brassicaceae, в частности, ранее отсутствовавшие сведения о строении интронов Brassicaceae за пределами A. thaliana. Для гомологов генов CONSTANS, FLOWERING LOCUS С и LEAFY показана связь структурного полиморфизма этих генов со временем перехода растений к цветению
Практическая значимость. Доказана пригодность полученных гомологов генов развития как гибридизационных зондов для RFLP анализа в функциональных и систематических исследованиях растений рода Brassica. Показана принципиальная возможность создания на основе полученных гомологов ДНК маркеров признака ранне/позднеспелости сельскохозяйственных растений.
Строение и функции генов, принимающих участие в регуляции скорости развития растений арабидопсиса
Гены, принимающие участие в подержании SAM. CZ располагается на самой верхушке SAM (рис. 1) и образована небольшой популяцией медленно делящихся плюрипотентных стволовых клеток (Meyerowitz, 1997; Fletcher, 2002; Lenhard and Laux, 2003). Стволовые клетки CZ окружены более часто делящимися клетками, которые формируют PZ. Клетки этой зоны дают начало латеральным органам, возникающим по краям меристемы, и число этих клеток постоянно пополняется за счет клеток центральной зоны. Под клетками центральной зоны расположена группа крупных вакуолизированных клеток RZ, из этих клеток образуются внутренние ткани меристемы и сердцевина растущего стебля. Клетки CZ в зависимости от типа деления также организованы в различные клеточные слои. В соответствии с этим выделяют два слоя: тунику и корпус (Meyerowitz, 1997; Waites and Simon, 2000; Fletcher, 2002). У арабидопсиса туника состоит из наружного эпидермального слоя L1 и субэпидермального слоя L2. Оба эти слоя являются моноклеточными и клетки в них делятся в антиклинальном направлении, что позволяет слоям L1 и L2 оставаться клонально различными. Корпус, называемый также L3 слоем, образован группой делящихся в разных направлениях клеток, расположенной под туникой (рис. 1). Клетки разных слоев меристемы дают начало разным тканям латеральных органов: L1- эпидермису, L2 — мезофиллу, L3 - сосудистым пучкам. Несмотря на то, что клетки различных слоев SAM имеют разный тип деления, их судьба зависит не от происхождения, а от положения этих клеток в меристеме (Meyerowitz, 1997; Doonan, 2000; Fletcher, 2002). Иными словами, существует система взаимодействий между клетками внутри слоя и между различными слоями, и эти взаимодействия определяют тип каждой отдельной клетки и тип ее развития. Чтобы выполнять свои функции, меристема должна постоянно поддерживать динамическое равновесие между скоростью деления недетерминированных клеток в CZ и скоростью детерминации и перехода этих клеток в PZ, где они становятся на путь дифференцировки.
К настоящему времени идентифицирован генетический механизм, при помощи которого достигается поддержание такого равновесия. Ключевыми компонентами этого механизма является система генов CLVl- CLV3 и WUS. Белки CLV являются компонентами одной сигнальной цепи. Мутации генов CLV приводят к накоплению большого числа недифференцированных клеток в центральной части SAM и FM (Clark et al., 1993; Clark et al., 1997; Kayes and Clark, 1998; DeYoung and Clark, 2001). Ген CLVl кодирует белок цитоплазматической мембраны, который состоит из внеклеточного домена, содержащего богатые лейцином повторы (LRR), трансмембранного домена и функционального киназного домена, расположенного в цитоплазме (Clark et al., 1997; Stone et al., 1998). Ген CLV2 кодирует рецепторный белок, сходный по своему строению с белком CLV1, который отличается от него отсутствием киназного домена. (DeYoung and Clark, 2001). Активированный рецепторный комплекс белков CLV1 и CLV2 включает в себя и другие регуляторные и сигнальные белки, которые связываются с киназным доменом рецептора CLV1 через фосфорилированные аминокислотные остатки, которые выступают в роли сайтов связывания для этих эффекторных молекул (Fletcher, 2002). Рецепторный комплекс активируется при взаимодействии с лигандом, которым служит продукт гена CLV3. Сигнал от активированного рецепторного комплекса передается через МАР-киназный каскад в ядро, где его мишенью служит ген WUS. Такой механизм передачи сигнала через МАР-киназный каскад является универсальным в растительном организме: подобные каскады контролируют многочисленные процессы, связанные с проведением сигналов возникающих в результате биотических и абиотических стрессов и трансдукцией гормональных сигналов (Холл и др., 2002). Ген WUS кодирует белок, принадлежащий к семейству транскрипционных факторов с гомеодоменом (Laux et al., 1996). В SAM зоны экспрессии WUS и CLVI перекрываются (рис. 4а). У растений, мутантных по гену clv3, зона экспрессии гена WUS существенно расширяется (рис. 4с), а трансгенные растения, постоянно экспрессирующие CLV3, имеют фенотип, сходный с фенотипом растений мутантных по гену wus, кроме того, экспрессия гена WUS у этих растений не обнаружена (рис. 4b) (Fletcher, 2002; Sharma and Fletcher, 2002). Таким образом, комплекс белков CLV1-CLV3 служит для проведения сигнала, который ограничивает размер популяции клеток, экспрессирующих ген WUS и тем самым регулирует способность этого гена стимулировать активность стволовых клеток в CZ SAM. Исследования последних лет показали, что активность гена WUS необходима и достаточна для определения судьбы недифференцированных клеток. Проростки растений, у которых экспрессия гена WUS под контролем промотора гена ANT осуществляется в клетках PZ, не способны продуцировать латеральные органы (Schoof et al., 2000). Апикальная меристема таких растений состоит исключительно из недифференцированных клеток, а экспрессия гена CLV3, которая у растений дикого типа сосредоточена в CZ у трансгенных растений pANTv.WUSобнаружена в PZ. Взаимодействие между генами CLV1-CLV3 и WUS обеспечивает поддержание постоянного клеточного баланса в апикальной меристеме. Белок-лиганд CLV3 продуцируется стволовыми клетками CZ и связывается с рецепторным комплексом CLV1-CLV2 в нижележащих клеточных слоях и активирует этот комплекс. Через активированный комплекс CLV1-CLV3 проходит сигнал, который подавляет экспрессию гена WUS и ограничивает ее небольшим доменом. Экспрессия гена WUS стимулирует экспрессию гена CLV3 в стволовых клетках SAM, и тем самым замыкает петлю обратной связи этого контура. Гены, принимающие участие в инициации и регуляции FM. Детерминированные FM формируются по краям SAM или меристемы соцветия, которая также является недетерминированной структурой. Флоральный морфогенез развертывается по программе кадастровой регуляции, которая учитывает положение клеток в меристеме и число клеток, выбравших ту или иную судьбу - (Хавкин, 1998; Ежова и Склярова, 2001). Для поддержания FM растением используется тот же набор генов, что и для поддержания SAM.
Однако два типа меристем существенно различаются. Одним из этих различий является пространственная организация органов, возникающих из этих меристем. Органы, формируемые SAM, расположены по спирали, в то время как органы, продуцируемые FM (чашелистики, лепестки, тычинки и пестики), располагаются в виде концентрических окружностей. Другое существенное различие между двумя типами меристемам заключается в том, что SAM является недетерминированной, а развитие FM носит детерминированный характер. Таким образом, неиссякающий пул стволовых клеток у SAM оказывается транзиентным в случае FM. Соответственно, в FM должны действовать механизмы, позволяющие преодолеть механизмы постоянного поддержания группы недифференцированных стволовых клеток в CZ SAM, с тем, чтобы в центре цветка мог сформироваться пестик. Для этого растение использует специальный набор генов, получивших название генов идентичности флоральной меристемы. К их числу относят гены API, CAL и LFY. Другая группа генов, в которой основным является ген TFL1, служит для предотвращения преждевременного формирования флоральной меристемы (Liljegren et al., 1999; Sharma and Fletcher, 2002; Fletcher, 2002) (рис. 5). Одна из функций гена идентичности флоральной меристемы LFY заключается в активации экспрессии гена AGAMOUS (AG) (Fletcher, 2002; Sharma and Fletcher, 2002). Ген AG экспрессируется в тех клетках флоральной меристемы, которые в будущем дают начало тычинкам и пестикам (Fletcher, 2002; Sharma and Fletcher, 2002). Этот ген кодирует транскрипционный фактор, содержащий MADS-box домен, и его мутации вызывают появление цветков, у которых вместо тычинок формируются лепестки, а на месте пестиков образуется новый цветок. Недавние исследования показали, что кроме активации экспрессии гена AG, гены API и LFY выполняют также роль репрессоров TFL1 и еще одного MADS-box гена - AGL24, ответственного за формирование меристемы соцветия (рис. 5). Без такого подавления постоянная экспрессия гена AGL24 приводит к обратному превращению флоральной меристемы в меристему соцветия. Такая функция гена AGL24 и роль генов API и LFY в подавлении его экспрессии были установлены путем анализа трансгенных растений, постоянно экспрессирующих ген AGL24, а также путем гормонально индуцируемой экспрессии генов API и LFYB растениях, несущих мутации по этим генам (Michaels et al., 2003; Yu et al., 2004).
Гомологи генов, определяющих скорость развития у растений рода Brassica
Анализ геномов диплоидных видов Brassica (В. гараь В. nigra и В. oleracea) показал, что они, по всей видимости, происходят от общего гексаплоидного предка, который в свою очередь произошел от диплоидного предка, общего для Brassica и Arabidopsis (рис. 13). На этот факт указывает наличие значительного числа триплицированных участков генома арабидопсиса в геномах этих видов Brassica. Так, сравнительное картирование геномов арабидопсиса и В. nigra выявило несколько протяженных сегментов, общих для обоих видов, представленных в трех копиях на разных хромосомах в геноме В. nigra, но одной копией в геноме арабидопсиса (Lagercrantz, 1998). Между собой геномы трех диплоидых видов В. nigra, В. oleracea и В. гара также обнаруживают значительную колинеарность и имеют небольшое число перестроек, разрывающих эту колинеарность (Gale and Devos, 1998), что связано с необходимостью распределения генетического материала по разному числу хромосом: 8, 9 и 10 для В. nigra, В. oleracea и В. гара, соответственно. На цитогенетическом уровне у В. nigra, В. oleracea и В. гара было идентифицировано шесть типов хромосом, различающихся по длине и симметрии плеч. Было установлено, что каждый из трех видов имеет все шесть хромосомных типов, но хромосомы некоторых типов являются дуплицированными или триплицированными, что связано с различным числом хромосом у этих видов (Lukens et al., 2004). С учетом отмеченных различий, геномы видов В. гара, В. nigra и В. oleracea для удобства принято обозначать соответственно как А, В и С. Виды В. гара, В. nigra и В. oleracea послужили основой для образования, в результате следующего цикла полиплоидизации, эволюционно более молодых видов В. парт, B.juncea и В. carinata (U, 1935). Геномы этих видов содержат, таким образом, геномы родительских форм: В. napus - AACC, В. juncea — AABB, B. carinata - BBCC, а соответствующий гаплоидный набор хромосом (п) составляет для них п=19, 18и17 (рис. 14). Колинеарность геномов Brassica между собой и по сравнению с арабидопсисом, а также наличие рядов плоидности и большое разнообразие жизненных форм делают этот объект интересным для изучения его методами молекулярной генетики и сравнительной геномики. В тоже время, подавляющее большинство растений рода Brassica является важными сельскохозяйственными культурами, и поэтому идентфикация генов, управляющих процессами развития, является важным и в практическом отношении, так как со скоростью развития связаны важные агрономические признаки, например ранне/позднеспелость. Сложность селекции на этот признак связана с тем, что он является количественным и, как большинство таких признаков, формируется в результате сложного взаимодействия различных генетических факторов с факторами внешней среды. Тем не менее, существует возможность вычленить влияние генетической составляющей на количественный признак.
Сделать это возможно путем картирования и исследования природы, так называемых локусов количественных признаков (quantitative trait loci, QTL) -участков, содержащих один или несколько генов, которые оказывают влияние на количественный признак. Чтобы идентифицировать эти локусы и определить их положение в геноме, необходимо наличие как можно более подробной генетической карты данного вида, по возможности покрывающей весь геном и картирующей популяции, происходящей от контрастных по интересующему признаку родителей. Для видов рода Brassica оба эти условия выполнены, и к настоящему времени у растений этих видов идентифицировано много локусов количественного признака число дней до зацветания. Так, Osborn et al. (1997) идентифицировали два QTL - VFR1 и VFR2, контролирующих переход к цветению под действием яровизации в сегрегирующих популяциях, В. гара и В. napus, а также не чувствительные к яровизации QTL: FRl, FR2 и FR3. Bouhon et al. (1998) на картирующей популяции В. oleracea, происходящей от различных по скорости развития родительских форм, обнаружили шесть QTL, косегрегирующих со временем перехода к цветению. В дополнение к QTL, обнаруженным другими исследователями на В. гара и В. oleracea, Axelsson et al. (2001) идентифицировали с помощью картирующей популяции В. juncea три QTL: J2, J3 и Л 8 и показали их гомологию с QTL В. гара, В. oleracea и В. nigra. Изучение генов, стоящих за этими QTL и управляющих процессами развития, позволяет создавать на их основе ДНК маркеры и ускорять селекционный процесс. Тем не менее, гены развития у Brassica изучены недостаточно. Наибольший прогресс достигнут в изучении структуры и функции гомологов двух генов арабидопсиса: FLC и СО. Так, структурные гомологи гена FLC были идентифицированы у В. napus, В. гара и В. oleracea (Tadege et al., 2001; Schranz et al., 2002; Lin et al., 2005). Всего было выделено пять качественно различных структурных гомологов, которые были обозначены FLC1 — FLC 5 по степени убывания гомологии с геном-прототипом. Клоны BnFLCl - BnFLC5 были использованы для трансформации растений раннецветущего экотипа арабидопсиса Ler, и каждый из этих генов вызывал у этих растений значительную задержку в цветении, что подтвердило функциональную активность этих гомологов (Tadege et al., 2001). Schranz et al. (2002) амплифицировали и клонировали четыре структурных гомолога гена FLC из геномной ДНК растений В. гара - BrFLCl — BrFLC3, BrFLC5, и три гомолога из геномной ДНК растений В. oleracea — BoFLCl, BoFLC3 и BoFLC5 - и сопоставили полученные из В. гара фрагменты с ранее идентифицированными у В. гара и В. napus QTL для признака «время до зацветания». В результате оказалось, что различные локусы гена FLC у Brassica соответствуют разным QTL: BrFLCl - VFR2, BrFLC2 - FR1 и BrFLCS - FR2. Эти результаты еще раз, но независимым методом, подтвердили функциональную активность полученных гомологов. У В. oleracea также идентифицировали два гомолога гена FLC -BoFLC3-2 и BoFLC4-l. Было показано, что снижение уровня их экспрессии после холодового воздействия происходило в листьях взрослых растений, но не в семенах, как у арабидопсиса. Эти наблюдения лишний раз свидетельствуют о различных функциях, которые могут выполнять гомологичные гены у разных организмов (Lin et al., 2005).
Четыре гомолога гена СО арабидопсиса: BnCOal, BnCObl, ВпСОаЯ и ВпСОЬЯ были идентифицированы при скрининге геномных библиотек двух дигаплоидных линий В. napus N-0-1 (яровая форма) и N-0-9 (озимая форма); была установлена их локализация на хромосомах 10 (СОа) и 19 (СОЬ). По своей доменной структуре эти гены были сходны с геном СО арабидопсиса и обладали высокой гомологией между собой и с прототипом. Было показано, что все четыре гена экспрессируются в В. napus, а трансформация позднецветущих растений арабидопсиса, несущих мутацию по гену СО (со-2) геном BnCOal восстанавливает нормальный фенотип у трансформантов (Robert et al., 1998). Ген СО является членом большого семейства COL генов (Robson et al., 2001). Гомологи этого гена были идентифицированы у В. napus (Robert et al., 1998). Кроме того, проводя скрининг геномных библиотек клоном кДНК гена СО арабидопсиса, Lagercrantz and Axelsson (2000) идентифицировали два гомолога гена СО у В. nigra {ВпіСОа и BniCOb) и гомологи двух других представителей этого семейства генов: BniCOLl и BniCOL2. Все четыре идентифицированных гомолога экспрессировались у В. nigra. Таким образом, из всех генов, определяющих скорость развития у арабидопсиса, у растений рода Brassica подробнее всего изучены два - FLC и СО. Показана мультилокусная природа этих генов, вызванная полиплоидизацией, имевшей место в ходе эволюции этого рода. Продемонстрирована роль генов FLC и СО в процессах индукции цветения, аналогичная той роли, которую эти гены играют у арабидопсиса. Однако, учитывая сложное строение геномов Brassica и их происхождение, нельзя с уверенностью сказать, что полученные данные являются исчерпывающими; кроме того, остается еще много растений этого рода, не охваченных исследованиями. Не исследованым у Brassica также остается и структурно-функциональный полиморфизм многих других генов, определяющих у арабидопсиса процессы, связанные со скоростью развития. Все это оставляет широкое поле для дальнейших исследований, а, учитывая то, что многие растения рода Brassica являются хозяйственно ценными, полученные в ходе этих исследований данные могут оказаться полезными для практики сельского хозяйства. Об этом, в частности, свидетельствует краткий обзор патентной литературы, посвященной генам, контролирующим скорость развития растения. 1.5.
Методы
Геномную ДНК выделяли из листьев 15-дневных проростков по протоколу, основанному на методе Saghai-Maroof (Saghai-Maroof et al., 1984). 2 г сырой растительной ткани растирали в ступке с жидким азотом, порошок переносили в 15 мл полипропиленовые пробирки и добавляли 8 мл СТАВ буфера, содержащего 0.1 М Трис-HCl, рН 7.5; 0.7 М NaCl; 0.01 М ЭДТА, рН 8.0; 0.14 М Р-меркаптоэтанола; 1% цетилтриметиламмонийбромид (СТАВ). Полученный гомогенат инкубировали при 65С в течение 60-90 мин при периодическом перемешивании. Затем к гомогенату, охлажденному до комнатной температуры, добавляли 4 мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), перемешивали переворачиванием в течение 5 мин и центрифугировали при 4500 оборотах в минуту в течение 15 мин. После центрифугирования верхнюю водную фазу переносили в другую пробирку и прибавляли 10 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и инкубировали в течение 1 часа при 37С. Далее прибавляли 6 мл изопропанола, предварительно охлажденного при —20С, осторожно перемешивали и инкубировали в течение ночи при 4С. Затем центрифугировали 15 мин при 4000 об./мин. Осадок ДНК промывали в 80% этаноле, подсушивали на воздухе и растворяли в 500 мкл стерильной воды в течение ночи при комнатной температуре. Раствор ДНК переносили в 1.5 мл пробирки и прибавляли равный объем фенола, насыщенного трис-HCl буфером до рН 8.0, перемешивали до образования однородной смеси и центрифугировали при 8000 оборотах в минуту в центрифуге Eppendorf 5415С (Германия) в течение 3-5 мин. Верхнюю водную фазу переносили в другие пробирки, прибавляли равный объем смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) и центрифугировали. Надосадочную жидкость снова отбирали и прибавляли к ней 1/10 объема З М раствора ацетата натрия и 2.5 объема 96% этанола, инкубировали в течение ночи на -20 С и осаждали центрифугированием при 8000 тыс. об/мин. Осадок ДНК подсушивали на воздухе и растворяли в 200-500 мкл стерильной воды в течение ночи. Определение концентрации ДНК. Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре LKB (ULTROSPEC II) (США). 10 мкл образца ДНК разводили в 990 мкл стерильной Н20 и измеряли оптическую плотность (OD) при 260 нм. Расчет концентрации производили при помощи программы, которая находится на сайте http://molbiol.edu.ru/scripts/01_03.html.
Качество выделения и чистоту ДНК определяли по отношению OD26o/OD280-Оптимальное отношение должно равняться 1.8 - 2.0. Отношение меньшее 1.8 свидетельствует о том, что препарат недостаточно хорошо очищен от белков и других UV поглощающих компонентов. Отношение больше 2.0 свидетельствует о наличии хлороформа или фенола. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в термоциклере Терцик ("ДНК-технологии", Россия). Реакционная смесь объёмом 25 мкл содержала: 50 нг геномной ДНК, 0.2 мкл Taq ДНК-полимеразы (5 ед./мкл) ("Fermentas", Литва), 10 мкл ПЦР буфер ("Fermentas"), 2.5 мкл 25 мМ MgCl2, по 2.5 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов и 10 пМ каждого из двух олигонуклеотидов. Протокол амплификации включал: 1 цикл продолжительностью 4 мин денатурации при 94С, 30 циклов по 45 сек при 94С для денатурации цепей ДНК, 45 сек при 50-68С (температуру отжига для каждой конкретной пары праймеров рассчитывали при помощи программы Oligo) для отжига праймеров с матрицей и 1 мин 20 сек при 72С для синтеза комплементарных цепей ДНК, и завершающего синтеза в течение 4 мин при 72С. Опыты по амплификации повторяли не менее трех раз. Для контроля специфичности получаемых продуктов в каждом эксперименте ставили реакции содержащие только один из двух праймеров. Конструирование специфичных олигонуклеотидных праймеров для проведения ПЦР. Для конструирования олигонуклеотидных праймеров использовали консенсусные последовательности нуклеотидов, полученные в результате выравнивания наиболее консервативных областей генов растений, а также литературные данные. 2.2.3. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК Для разделения продуктов амплификации использовали электрофорез в 1 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия; для этого в гели объёмом 50 мл добавляли 3 мкл раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Визуализацию продуктов амплификации осуществляли при помощи трансиллюминатора УВТ1, оборудованного видеосистемой для регистрации гелей «гель-1-биоком» (ООО «Компания Биоком», Россия). Длину амплифицированных фрагментов ДНК определяли с помощью маркера Gene Ruler lkb DNA Ladder ("Fermentas"). Элюцию фрагментов ДНК из агарозного геля проводили с помощью набора Diatom DNA elution ("Биоком", Россия) согласно протоколу фирмы производителя. Специфические фрагменты ДНК клонировали в составе pGEM вектора согласно инструкции фирмы-производителя ("Promega", США). Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli штамм DH5a. Трансформация клеток E.coli. Для трансформации клеток лабораторных штаммов E.coli DH5a использовали метод Hanahan (Sambrook and Russel, 2001 (стр. 1.105-1.110)). Эффективность трансформации составляла 10 - 5x10 трансформантов на 1 мкг суперскрученной ДІЖ плазмидыриС19. При клонировании фрагментов ДНК в плазмидных векторах для поиска рекомбинантов использовали методы селекции на средах с антибиотиками и метод скрининга рекомбинантов - бело-голубую селекцию с IPTG и X-gal по протоколу фирмы-производителя («Promega», США).
Выделение и очистка плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК выделяли из штамма E.coli DH5cc методом щелочного лизиса. 0.1 л среды LB (1% бакто-триптона, 0.5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl) заражали трансформированными клетками, несущими целевую плазмиду, и инкубировали 14-18 часов на 37С при интенсивном покачивании. Клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл буфера (25 мМ трис-HCl рН 8, 10 мМ ЭДТА). Добавляли 10 мл раствора, содержащего 0.2 HNaOH, 1% SDS. Инкубировали 10 минут на льду. Добавляли 5 мл 5М ацетата калия, инкубировали 10 минут на льду, центрифугировали 20 минут при 20 тыс.об./мин. К супернатанту добавляли 0.6 объема изопропанола и после 15 минут инкубации при комнатной температуре осаждали ДНК центрифугированием в течение 20 минут при 10 тыс. об/мин.
Осадок промывали 70% этанолом и растворяли в 500 мкл ТЕ буфера. Раствор ДІЖ переносили в 1.5 мл пробирки. Добавляли равный объем 5М ацетата аммония и инкубировали 20 мин. при комнатной температуре и центрифугировали 10 мин, супернатант отбирали в другие пробирки и добавляли 5 мкл РНКазы А инкубировали 1 час на 37С. затем приливали равный объем хлороформа тщательно перемешивали и центрифугировали на максимальных оборотах. Отбирали верхнюю водную фазу в другую пробирку и добавляли 2 объема 96% этанола, инкубировали 30 мин. на -20С. Затем центрифугировали на максимальных оборотах, осадок промывали 70% этанолом, высушивали на воздухе и растворяли 200 мкл стерильно НгО. 2.2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК Нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК, клонированных в составе pGEM, определяли ферментативным методом с использованием дидезокси терминаторов (Sanger et al., 1977) на автоматическом анализаторе ABI 310 Prism ("Perkin-Elmer", США), согласно инструкции фирмы производителя. 2.2.6. Анализ полиморфизма длин рестриктных фрагментов ДНК (RFLP) Рестрикция геномной ДНК. Составляли реакционную смесь, содержащую в 50 мкл рестрикционного буфера 5 мкл, фермента (10 ед./мкл.) 2 мкл, ДНК 10-15 мкг, воды до объема 50 мкл. Реакционную смесь тщательно перемешивали и инкубировали 5-6 часов при 37С. Останавливали реакцию добавлением 5М NaCl до конечной концентрации 0.25 М, затем добавляли 2.5 объема 96% этанола, хорошо перемешивали, и инкубировали при -20С в течение ночи или на -80С 2-3 часа. Фрагменты ДНК осаждали центрифугированием при максимальных оборотах 10 мин. Осадок промывали 70% этанолом, высушивали на воздухе при комнатной температуре и растворяли в 20 мкл стерильной воды в течение ночи. Добавляли 5 мкл красителя бромфенолового синего, перемешивали и вносили в 0.8 % агарозный гель. Образцы разделяли электрофорезом в течение 15-18 часов при 25 тА. Перенос фрагментов ДНК на нейлоновую мембрану.
Выделение и идентификация гомологов генов скорости развития у Brassicaceae
Полужирным шрифтом выделены гомологи, полученные впервые для семейства Brassicaceae за пределами арабидопсиса. Гомологи гена SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1 (SOC1). Для того чтобы амплифицировать К-box последовательность гомологов гена SOC1 у растений рода Brass ica мы использовали праймеры AF и AR, распознающие консервативные участки нуклеотидной последовательности в III и VI экзонах этого гена. В результате с образцами геномной ДНК сарептской горчицы В. juncea L. Czern (номера К4588 и К4594 по каталогу ВИР) были получены фрагменты размером приблизительно 500 п.н., что соответствует расстоянию между положениями праймеров в исходной последовательности гена SOC1 (рис. 16В). Амплифицированные фрагменты были клонированы и отсеквенированы. Сведения о размерах полученных фрагментов, гомологии с прототипом и номера регистрации представлены в таблице 4. По своей экзонно-интронной структуре данные последовательности сходны с прототипом (табл. 5). Длины экзонов оказались в высокой степени консервативны, а длины интронов вариабельны. Экзоны обнаружили консерватизм не только по » длине, но и по нуклеотиднои последовательности. Различия в кодирующей части между фрагментами 5/AY507668 и BjAY507 669 связаны с пятью нуклеотидными заменами, четыре из которых являются синонимическими, причем четыре замены из пяти, включая несинонимическую замену, находятся в четвертом экзоне, одна в третьем, а экзоны пять и шесть оказались идентичными. Таким образом, наиболее вариабельным является четвертый экзон. По производной аминокислотной последовательности полученные фрагменты сходны на 98%. Ш Интроны обладают значительно большим полиморфизмом. Гомология между третьим интроном арабидопсиса и соответствующими нитронами у В. juncea составила для 5/AY507668 52%, а для /AY507669 62%. Сходство третьего интрона у двух образцов В. juncea составило 75%. Интроны четыре и пять у В. juncea оказались идентичны, а их гомология с арабидопсисом составила 54% и 51% соответственно. При выравнивании нуклеотидных последовательностей пятого интрона был обнаружен консервативный участок TCTTGTGCTTGCTTTTT, обладающей 100% гомологией с участком #1 в регионе промотора гена Pkhdl мыши, что позволяет сделать предположение о функциональной роли этого участка в регуляции генной экспрессии. Гомолог гена SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP). С праймерами BF и BR мы получили фрагмент генома рыжика Camelina sativa (номер 4144 по каталогу ВИР) размером около 500 п.н. (рис. 16Е). Амплифицированный фрагмент был клонирован, секвенирован и помещен в Генбанк под номером AY177710 (табл. 4).
Результаты сравнения клонированного фрагмента с геном-прототипом показали, что его экзонно-интронная структура сходна со структурой соответствующего участка гена SVP арабидопсиса (табл. 6). При этом длина экзонов оказалась консервативной, а длины интронов сильно различались, что повлияло на различия в общей длине между полученным фрагментом и прототипом-521 и 556 п.н. соответственно. По нуклеотидной последовательности экзоны также оказались весьма консервативны, а интроны полиморфны. Общее число нуклеотидных замен в экзонах составило 15-7 синонимических и 8 несинонимических, из них 9 приходилось на четвертый экзон, включая 3 несинонимические замены, 4 на пятый, из которых 3 были несинонимическими, и 2 несинонимические замены находились в шестом. Последовательности третьих экзонов оказались идентичны. Таким образом, нуклеотидный полиморфизм четвертого и пятого интронов оказался примерно одинаков - 0.90 и 0.95 замен на 10 нуклеотидов, однако, с учетом несинонимических замен, пятый экзон оказывается существенно более полиморфным - он имеет 0.7 несинонимических замен на 10 нуклеотидов, против 0.3 таких замен в четвертом экзоне. Гомология интронов составила для третьего 52%, для четвертого 71% и для пятого 69%. Гомологи гена LEAFY (LFY). Используя праймеры DF и DR на наиболее консервативные участки третьего экзона, мы амплифицировали его последовательность у двух растений сарептской горчицы В. juncea L. Czern (номера К4588 и К4594 по каталогу ВИР). Результаты амплификации представлены на рисунке (рис. 16Ж). Амплифицированные фрагменты были специфичны и имели ожидаемый размер около 300 п.н.. Клонирование, секвенирование и сравнение полученных сиквенсов с прототипом и гомологами гена LFY из других растений, показали, что полученные клоны являются гомологами гена LFYy B.juncea. (табл. 4) Между собой полученные фрагменты гомологичны на 92% по нуклеотидной последовательности и на 94% по производной аминокислотной последовательности. Различия между фрагментами AY472113 и AY472112 связаны с 24 нуклеотидными заменами, из которых 18 являются синонимическими, а 6 несинонимическими. Гомологи гена CONSTANS-LIKE 1 (СОЫ). При помощи праймеров EF и ER, узнающих в генах семейства CONSTANS консенсусные последовательности, которые кодируют домены цинкового пальца и ССТ-домен, мы провели ПЦР амплификацию геномной ДНК двух форм растений В. rapa - Pachuca и Tsoi-sim (номера К350 и 548557 по каталогу ВИР). Результаты амплификации представлены на рис. 16Г. Полученные фрагменты длиной около 700 п.н. были клонированы и отсеквенированы. Сравнение нуклеотидные последовательности этих фрагментов с генами семейства CONSTANS арабидопсиса показало, что они наиболее гомологичны гену СОЫ (табл. 4), в то время как их гомология с генами СО и COL2 арабидопсиса ограничивалась участками, кодирующими консервативные домены цинковых пальцев на 5 -конце и ССТ-домен на 3 -конце; степень гомологии этих участков составила 80-88%. Сравнение гомологов СОЫ из разных форм В. rapa Pachuca и Tsoi-sim показало, что их нуклеотидные и производные аминокислотные последовательности были сходны на 97 и 98%. Два гомолога различаются по 15 нуклеотидам в положениях 12, 51, 52, 90, 155, 159, 280, 555, 558, 559, 570, 584, 591, 592 и 645, однако только четыре замены в положениях 155, 280, 559 и 584 были несинонимическими. Четыре замены приходятся на участок, кодирующий домен цинкового пальца, одна - на участок, кодирующий ССТ- домен, остальные десять замен находятся в центральной (вариабельной) части гена, при этом на этот участок гена приходятся все несинонимичные замены. В производной аминокислотной последовательности двух гомологов СОЫ участок, соответствующий домену цинкового пальца, содержит характерную для В-box домена белка CONSTANS последовательность СХ8СХ7СХ2СХ4НХ8Н (рис. 17). Гомологи гена FLOWERING LOCUS С (FLC). Используя праймеры CF и CR, распознающие высококонсервативные последовательности во 2 и 7 экзонах гена FLC арабидопсиса, мы амплифицировали два фрагмента генома растений В. junceae (номера 557588 и К4594 по каталогу ВИР) размером около 1500 п.н. (рис. 16А).
Амплифицированные фрагменты были затем клонированы и секвенированы, нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов были сопоставлены с геном-прототипом (табл. 4). Границы между экзонами и нитронами были определены путем сравнения экзонных последовательностей гена FLC арабидопсиса с полученными нами последовательностями, а также путем проверки наличия консервативных сайтов сплайсинга на 5 - и 3 -концах интронов. В результате было установлено, что по своей экзонно-интронной структуре полученные фрагменты в целом соответствуют гену-прототипу FLC арабидопсиса (табл. 7). Отличия гомологов из В. junceae от гена-прототипа связаны с длиной интронов (табл. 7) и заменами во всех шести экзонах: 54 замены в гомологе AY266265 и 49 замен в гомологе AY268931, в обоих случаях 16 замен были синонимическими. Между собой два гомолога из В. junceae различаются по общей длине, главным образом, за счет интронов 2 и 6; в кодирующей части два гомолога различаются на 24 нуклеотида, причем шесть замен являются синонимическими. Распределение замен по экзонам приведено в таблице 8, число несинонимических замен указано в скобках. Гомологи гена CLAVATA1 (CLV1). Используя пары праймеров FF-FR и GF-GR, мы получили четыре фрагмента генома культурных растений семейства Brassicaceae, гомологичных гену CLV1 арабидопсиса: три частичных гомолога из рапса (номер К5065 по каталогу ВИР), сурепицы (номер К299 по каталогу ВИР) и рыжика (номер К4144 по каталогу ВИР) (зарегистрированы в Генбанке под номерами AY13 0760, AY130759 и AF467952 соответственно (табл. 4)) и полноразмерный гомолог из рапса (номер 0137787 по каталогу ВИР) (№ AY283519 (табл. 4)). Результаты амплификации представлены на рис. 16Б, Д. Анализ первичной структуры этих фрагментов показал, что в ней отсутствуют нонсенс-кодоны и выделенные последовательности могут быть транслированы с помощью стандартного генетического кода.
