Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Современные направления исследований генетики мультифакториальных заболеваний 10
1.2 Молекулярные основы этиологии и патогенеза хронического гломерулонефрита 15
1.3 Генетические исследования хронического гломерулонефрита 26
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 32
2.1 Характеристика обследованных групп 32
2.2 Клиническая характеристика больных 34
2.3 Молекулярно-генетические методы 39
2.4 Биометрические и генетико-статистические методы 45
ГЛАВА 3. Анализ роли полиморфизма генов TNFa-308, Lta-250, TNFRl И TGFpi-869 в возникновении и клиническом течении ХГН 49
3.1 Изучение ассоциаций полиморфных маркеров генов TNFa-308, Lta-250, TNFRl и TGF(31-869 с развитием хронического гломерулонефрита 49
3.2 Характеристика клинических особенностей дебюта ХГН в зависимости от полиморфных маркеров генов TNFa-308, Lta-250 , TNFRl HTGF(31-869 53
3.3 Исследование особенностей клинического течения ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов TNFa-308, Lta-250, TNFRl и TGFp 1-869 60
ГЛАВА 4. Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов TNFa-308, Lta -250, TNFRl и TGFpi-869 со скоростью прогрессирования ХГН з
4.1 .Распределение полиморфных маркеров генов TNFa-308, Lta-250, TNFRl и TGFp 1-869 у больных ХГН с ТХПН и их влияние на время развития ТХПН 77
4.2,Оценка почечной выживаемости в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов TNFa-308, Lta-250, TNFRl и TGFpi-869 89
ГЛАВА 5. Изучение ассоциации полиморфных маркеров генов TNFa-308, Lta-250, TNFRl И TGFpl-869 с эффективностью терапии хронического гломерулонефрите 98
5.1. Оценка эффективности терапии глюкокортикоидами в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов TNFa-308, Lta-250, TNFRl и TGFp 1-869 99
5.2. Оценка эффективности терапии цитостатиками в зависимости от генотипов полиморфных маркеров геновTNFa-308, Lta-250, TNFRl nTGFpi-869 101
5.3. Оценка эффективности сочетанной терапии в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов TNFa-308, Lta-250, TNFRl nTGFpi-869 104
5.4. Оценка эффективности терапии ингибиторами АПФ в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов TNFa-308, Lta-250, TNFRl и TGFpl-869 107
Обсуждение
Выводы 123
Практические рекомендации 125
Список литературы
- Молекулярные основы этиологии и патогенеза хронического гломерулонефрита
- Молекулярно-генетические методы
- Исследование особенностей клинического течения ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов TNFa-308, Lta-250, TNFRl и TGFp 1-869
- Оценка эффективности терапии цитостатиками в зависимости от генотипов полиморфных маркеров геновTNFa-308, Lta-250, TNFRl nTGFpi-869
Введение к работе
Актуальность проблемы В ряду паренхиматозных заболеваний почек гломерулонефрит занимает доминирующее место Среди нефрологических заболеваний хронический гломерулонефрит (ХГН) составляет более 35% [Ку-тырина, 2002, Syrjanen et al, 2002, Картамышева и др , 2003] Очевидно, что это самый частый вид патологического процесса, который является одной из распространенных причин хронической почечной недостаточности, для лечения которой необходимы гемодиализ и пересадка почки [Мухин и др , 2002, Nanta et al, 2003, Картамышева и др , 2003, Игнатова, 2004] Распространенность и заболеваемость терминальными стадиями хронической болезни почек неуклонно увеличивается в разных регионах мира [Nickolas et al, 2004] Если в США в конце XX века более 340 000 человек были включены в программы диализа или трансплантации почки, то уже к 2010 году ожидается значительное увеличение числа таких пациентов, которое может достигнуть 560 000 человек [Verhave et al, 2004]
По мнению Шулутко Б И (2002), гломерулонефрит это генетически обусловленное иммуноопосредованное воспаление с преимущественным поражением клубочков и вовлечением в патологический процесс всех почечных структур, клинически проявляющееся почечными и внепочечными симптомами Изучению генетических основ гломерулонефрита посвящено ряд работ [Patrakka et al, 2002, Goumenos et al, 2002, Кутырина, 2002, Nisko-las et al, 2004] Однако, следует отметить, что большинство исследований по выявлению генов предрасположенности к гломерулонефриту проведены за рубежом [Syrjanen et al, 2002, Nanta et al, 2003, Matsuzaki et al, 2004] В России генетические факторы развития ХГН изучались лишь в популяции г Москвы [Камышова, 2004, Калиев и др, 2004, Петросян, 2006, Шестаков, 2006, Шарнова, 2006]
Согласно экспериментальным и клиническим данным, важную роль в развитии ХГН играют цитокины и факторы роста [Вашурина и др ,2002, Гейниц и др , 2004] В ряде работ показаны ассоциации полиморфных маркеров генов цитокинов и факторов роста с хроническим гломерулонефритом и факторами риска заболевания [Jiang et al, 2003, Nanta et al, 2003, Шестаков, 2006] Однако полученные результаты разными группами исследователей по этим взаимосвязям противоречивы и не дают однозначного ответа на вопрос о патогенетической роли отдельных полиморфизмов генов цитокинов В работах недостаточно изучены взаимосвязи полиморфных маркеров генов цитокинов с клиническими особенностями дебюта и течения хронического гломерулонефрита, характером его прогрессирования, эффективностью лечения
Клинико-генетические работы, посвященные молекулярно-генетическим аспектам ХГН, в России немногочисленны и затрагивают в основном спектр генов вазоактивных гормонов [Камышова, 2004, Калиев, 2004], интегральных мембранных белков и интерлейкинов [Шестаков, 2006] Исследования роли полиморфных маркеров генов факторов некроза опухоли,
их рецептора и трансформирующего фактора роста в отношении ХГН в нашей стране до сих пор не проведены
Цель и задачи исследования Изучить полиморфизм генов цитокинов и рассмотреть его влияние на клинические особенности течения и эффективность лечения хронического гломерулонефрита
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи
1 Изучить распределение полиморфизмов генов фактора некроза опухоли а (TNFa-308), лимфотоксина a (Lta-250), рецептора фактора некроза опухоли
1 типа (TNFR1-36), трансформирующего фактора роста (31 (TGFpi-869) у
больных ХГН и популяционной выборке
Проанализировать влияние генетических полиморфизмов на дебют ХГН
Рассмотреть взаимосвязи полиморфизмов генов цитокинов с особенностями клинического течения ХГН
Исследовать роль генетических маркеров в характере прогрессирования ХГН
Провести анализ генетических и средовых факторов, влияющих на почечную выживаемость
Оценить эффективность лечения ХГН в зависимости от изучаемых полиморфизмов генов
Научная новизна работы Впервые комплексно изучен полиморфизм генов фактора некроза опухоли a (TNFa-308), лимфотоксина a (Lta-250), рецептора фактора некроза опухоли (TNFR1-36), трансформирующего фактора роста pi (TGFp 1-869) у больных хроническим гломерулонефритом русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ Установлено их важное клиническое значение
Впервые показано, что аллели с провоспалительным и фибропластиче-ским эффектами генов TNFa-308, Lta-250, TNFR1-36 и TGFP 1-869 обусловливают более острый и тяжелый дебют ХГН и выраженные клинические проявления при течении заболевания
Впервые установлены генетические факторы риска (аллели с провос-палительными эффектами), которые определяют высокую скорость прогрессирования ХГН, приводя к раннему развитию терминальной хронической почечной недостаточности
Впервые выявлены взаимосвязи между полиморфизмом генов цитокинов и эффективностью лечения ХГН
Научно-практическое значение Полученные результаты позволяют рекомендовать в целях определения группы пациентов с неблагоприятным прогнозом течения хронического гломерулонефрита проведение молекулярно-генетических исследований в нефрологических стационарах для выявления носителей аллелей с провоспалительным и фибропластическим эффектами генов TNFa-308, Lta-250, TNFR1-36 и TGFpi-869
Выделены генетические факторы риска развития тяжелой артериальной гипертензии (аллель А гена TNFR1), гематурии (аллель 1 гена Lta), уме-
ренной протеинурии (аллель 2 гена TNFa и аллель 1 гена Lta) и выраженной протеинурии (аллель А гена TNFR1 и аллель С гена TGFpi)
Установлены неблагоприятные прогностические факторы, снижающие почечную выживаемость - аллель С гена TGFpi, комбинация аллеля 1 гена Lta и аллеля А гена TNFR1, наличие артериальной гипертензии в дебюте и течении заболевания При этом проведение терапии ингибиторами ангиотен-зин-конвертирующего фермента улучшает почечную выживаемость
Показана необходимость генетического тестирования больных ХГН по генам TNFa-308, Lta-250, TNFR1-36, TGFpi-869 с целью выбора эффективной стратегии терапии заболевания монотерапия глюкокортикоидами или цитостатиками при генотипах Lta*2/ Lta*2 и TNFR1*G/ TNFR1*G и соче-танная терапия при аллелях с провоспалительным и фибропластическим эффектами Положения, выносимые на защиту
Полиморфизм генов цитокинов ассоциирован с острым и тяжелым дебютом ХГН
Выраженные клинические проявления ХГН при его обострении взаимосвязаны с определенными генетическими маркерами
Скорость развития терминальной хронической почечной недостаточности на 5-21% определяется генетическими полиморфизмами TNFa-308, Lta-250, TNFR1-36
Полифакторность и разнонаправленность генетической и средовой детерминации почечной выживаемости
Стратегия терапии ХГН зависит от носительства определенных аллелей генов цитокинов
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на Годичной научной конференции сотрудников Белгородского госуниверситета (Белгород, 2005, 2006), Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифактори-альной патологии» (Курск, 2006), Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им Н И Вавилова РАН (Москва, 2006), Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные вопросы эволюционной, возрастной и экологической морфологии» (Белгород, 2006), И-й интернет-конференции морфологов «Морфогенез и регенерация» (Белгород, 2006), 71-й и 72-ой на->чных конференциях КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2006, 2007)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ Структура и объем диссертации Диссертация состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы, практические рекомендации и список литературы Материалы диссертации изложены на 148 страницах машинописного текста и содержат 31 таблицу и 29 рисунков Библиографический указатель содержит 221 наименование, из которых 118 иностранных
Клиническая характеристика исследованных больных
Группу исследования составили 370 человек 202 больных хроническим гломерулонефритом и 168 человек популяционного контроля В выборки больных и популяционного контроля включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Белгородской области и не имеющие родства между собой
Клинико-лабораторное обследование и формирование выборки больных проводилось на базе отделения нефрологии областной клинической больницы Среди 202 больных ХГН детально изучены клинические особенности хронического гломерулонефрита в дебюте и течении заболевания, оценен характер прогрессирования ХГН и эффективность его терапии
Всем больным ХГН и индивидуумам популяционного контроля проводилось типирование четырех молекулярно-генетических маркеров диал-лельные локусы генов фактора некроза опухоли a (TNFa-308), лимфотоксина a (Lta-250), рецептора фактора некроза опухоли 1 типа (TNFR1-36) и трансформирующего фактора роста pi (TGFp4-869) Генотипирование осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского факультета Белгородского государственного университета Молекулярно-генетнческне методы
Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 8-9 мл, взятая из локтевой вены пробанда Забор венозной крови производили в пробирки с консервантом, содержащим 0,5М раствор ЭДТА (рН=8 0)
Выделение геномной ДНК из периферической крови проведено методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew, 1984]
Анализ всех локусов осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК ПЦР проводилась на амплификаторе «Терцик-МС4» производства компании "ДНК-технология" с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы "Силекс-М" и олигонук-леотидных праймеров, синтезированных фирмой «Синтол»
Генотипирование ДНК-маркеров производилось методом анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома с использованием соответствующих ферментов рестрикции производства ООО "Сибэнзим" (Новосибирск)
Статистические методы
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6 0» Определение фенотипиче-ских и генных частот проводили стандартными методами [Животовский, 1983] Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использован критерий X2 [Вейр, 1995]
Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с предрасположенностью к хроническому гломерулонефриту, а также с качественными признаками, характеризующими его клинические особенности, оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2x2 с расчетом критерия %г с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI) [Schlesselman, 1982, Реброва, 2003] Взаимосвязи между количественными патогенетически значимыми признаками ХГН и полиморфизмами генов цитокинов изучали с помощью однофакгорного и двухфакторного дисперсионного анализа [Лакин, 1990] В данном иследова-нии в силу малочисленности групп гомозигот по редким аллелям их объединяли с гетерозиготами Анализ ассоциаций почечной выживаемости с полиморфными генетическими маркерами проведен методом множительных оценок Кагшан-Майера [Камышова, 2003] Влияние генетических и средовых факторов на почечную выживаемость изучали с применением регрессионной модели Кокса [Бикбов, 2004]
Молекулярные основы этиологии и патогенеза хронического гломерулонефрита
За последнее десятилетие сделан значимый шаг в изучении и понимании патогенеза хронического гломерулонефрита (ХГН). Этиопатогенез ХГН достаточно сложный, механизмы его формирования разнообразны и представляют определенный интерес для изучения среди исследователей [Couser et al, 1998; Аткинс, 2000; Шилов, 2000; Segerer et al, 2000].
Патогенез гломерулонефрита условно может быть разделен на две стадии: иммунную и воспалительную [Mozes et al, 1999; Nguyen et al., 1999; Тареева, 2000]. Первая стадия включает различные звенья иммунного ответа на чужеродные или собствнные антигены (АГ) и заканчивается образованием иммунных комплексов (ИК), нефритогенных лимфоцитов или аутоантител [Matsumoto et al., 1995; Maksic et al., 1996; Klein et al., 2000; Аткинс, 2000; ]. Вторая стадия подразумевает почечное воспаление, которое запускается и пролонгируется данными иммунными агентами [Аткинс, 2000, Богомазов и др., 1997]. Она включает активацию собственных клеток, миграцию моноцитов, лимфоцитов, нейтрофилов в гломерулу и интерстиций, а также высвобождение медиаторов тканевого повреждения [Батурина, 2002; Корякова, 2005]. Согласно современным представлениям, в ответ на повреждение клетки вырабатывают комплекс вазоактивных, про- и противовоспалительных, просклеротических медиаторов - цитокинов, которые играют важную роль в патогенезе иммунного воспаления [Назаров и др., 1995; Maksic et al., 1998; Насонов и др., 2001; Корякова, 2005]. Регуляция межклеточных взаимодействий, контроль над правильностью и адекватностью биохимических реакций, происходящих при этом, осуществляется генами, кодирующими синтез цитокинов и их рецепторов [Matsuda et al., 1996; Nguyen et al., 1999; Ha et al., 2001, Jiang et al., 2003]. Нарушение их нормальной экспрессии запускает неконтролируемое развитие лейкоцитарной инфильтрации, клеточной пролиферации и аккумуляции экстрацеллюляр-ного матрикса (ЭЦМ) в гломеруле и интерстиции с формированием, в итоге, гломерулярного и интерстициального склероза, определяющего про-грессирование гломерулонефрита [Okuda et al., 1999; Ozen et al., 1999, Томилина и др., 2004; Корякова, 2005].
Схематично патогенез гломерулонефрита может быть представлен следующим образом (рис. 2)
Первичными иммунными механизмами при развитии гломерулонефрита являются или локальное (in situ) взаимодействие антител с антигенами внутри клубочков, или связывание антител с растворимыми антигенами в циркуляции и последующим отложением иммунных комплексов (ИК) на гломерулярной базальной мембране (ГБМ) [Соловьев, 1998; Паунова, 1999; Шилов и др., 2000].
Иммунные комплексы, депонируясь в гломеруле, приводят к развитию воспалительных реакций. Происходит выделение большого количества цитокинов и ростовых факторов, инфильтрация клубочка лимфоцитами и моноцитами и пролиферация резидентных гломерулярных клеток, что отражает воспалительные изменения, происходящие в клубочке при ХГН [Соловьев, 1998; Baricos et al, 1999; Тареева и др., 2000; Шилов, 2000]. Среди клеточных медиаторов иммунного повреждения основная роль при 17 надлежит нейтрофилам и тромбоцитам [Кетлинский и др., 1996; Картамы-шева и др., 2002; Корякова, 2005]. Количество внутриклубочковых ней-трофилов лейкоцитарной инфильтрации зависит от концентрации факторов некроза опухоли a (TNFa) и 6 (Lta), которые индуцируют респираторный взрыв нейтрофильных гранулоцитов.
Медиаторы воспаления не только привлекают нейтрофильные гра-нулоциты (НГ) в пораженную ткань, но также влияют на длительность жизни НГ в инфильтрируемой ткани. Известно, что TNFa, Lta, IL-10 стимулируют апоптоз НГ [Klein et аі., 2000].
TNFa стимулирует адгезию моноцитов и лимфоцитов к мезангиаль-ным клеткам (МК), индуцируя экспрессию ICAM-1 [Noronha et al., 1995]. Takemura и соавт. (1994) установили связь интенсивного цитоплазматиче-ского окрашивания TNFa, IL-1, IL-6 с инфильтрирующими гломерулу моноцитами/макрофагами при мезангиокапиллярном (МКГН) и мезангио-пролиферативном (Ml 11 Н) гломерулонефритах.
Одним из условий развития ответа клеток на действие цитокинов является их соединение с высокоаффинными мембранными рецепторами, которые экспрессируются при активации клеток и обеспечивают передачу сигналов внутрь клетки [Пальцев и др., 1994; Кетлинский и др., 1995; 1994; Ярилин, 1997].
После образования комплекса цитокин-рецептор тирозинкиназы последовательно активируют фосфолипазу С, протеинкиназы и цитозольные субъединицы NFAT, NF-kp\ связывающие свои ядерные части и запускающие пролиферацию клеток, цитокиновый синтез [Пальцев и др., 1994, Noronha et al., 1995; Rovin et al., 1995].
Молекулярно-генетические методы
Полиморфизм рецептора фактора некроза опухоли 1 типа HTNFRl). Ген TNFR1 расположен на хромосоме 6р55. Его продукт - рецептор фактора некроза опухоли 1 типа ответственен за острый воспалительный ответ и найден в большинстве типов клеток. Фактор некроза опухоли, соединяясь со своими рецепторами, образует димер, обусловливающий конформационные изменения этого рецепторного домена и инициацию определенного клеточного сигнала.
Анализ полиморфизма гена TNFR1 в области 1 экзона проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (табл. 2) по методике указанной в работе [Hulkkonen, 2002]. Реакция проводилась в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (рН=8,8), 1,25мМ MgCl2, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95С) выполняли 30 циклов амплификации по схеме: денатурация - 1 мин. при 95С; отжиг праймеров - 1 мин. при 60С; элонгация - 1 мин при 72С. Затем пробы выдерживали 5 мин при 72С и охлаждали. После ПДРФ-анализа продукты рестрикции анализировали в 2%-ном агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, в течение 30 минут при 160V. В качестве электрофорезного буфера использовали ІхТАЕ (трис-ацетатный буфер). Затем пробы идентифицировали в проходящем УФ-свете. Фрагменты длиной 183 п.н. соответствовали аллелю А гена TNFR1, 108 и 75 п.н. - аллелю G, фрагменты длиной 183, 108 и 75 п.н. наблюдались у гете розигот AG (рис. 5)
Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции гена TNFR1: 1, 3, 6, 12 - гомозиготы GG; 2, 4, 8, 11, 14 - гетерозиготы AG; 7, 9-Ю, 13 - гомозигота АА
Полиморфизм гена лимфотоксина a (Lt а). Ген Lta локализуется на 6 хромосоме в регионе р21.33. Ген лимфотоксина имеет сходную с геном фактора некроза опухоли экзон-интронную структуру. Степень аминокислотной гомологиии Lta и TNFa составляет около 30%, причем области выраженной гомологии локализуются в консервативных участках молекулы.
Анализ полиморфизма гена Lta в 1 интроне проводили методом по-лимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (табл. 2) по методике указанной в работе [Quasney М., at al., 2001]. Реакция проводилась в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (рН=8,8), 1,25мМ MgCl2, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (4 мин при 94С) выполняли 35 циклов амплификации по схеме: денатурация - 30 сек. при 94С; отжиг праймеров - 30 сек. при 68С; элонгация - 42 сек. при 74С. Затем пробы выдерживали 10 мин при 72С и охлаждали. После ПДРФ-анализа продукты рестрикции анализировали в 2%-ном агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, в течение 30 минут при 150V. В качестве электрофорезного буфера использовали ІхТАЕ (трис-ацетатный буфер). Затем пробы идентифицировали в проходящем УФ-свете. Фрагменты длиной 782 п.н. соответствовали аллелю Lt 2/Lt 2 гена Lta, 586 и 196 п.н. - аллелю Lt l/Lt l, фрагменты длиной 782, 586 и 196 п.н. наблюдались у гетерозигот Lt 1/Lt 2 (рис.6).
Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции гена Lta: 1, 4, 9-11 - гомозиготы Lt 2/Lt 2; 2 - гомозигота Lt 1 /Lt 1; 3, 5-8 - гетерозиготи Lt 1/Lt 2
Полиморфизм гена трансформирующего фактора роста pi (TGFpi). Ген TGFpi картирован на хромосоме 14q24.
Анализ полиморфизма гена TGF(31 проводили методом полимераз-ной цепной реакции синтеза ДНК с использованием стандартных олиго-нуклеотидных праймеров (табл. 2) по методике указанной в работе [Sugi-uraetal., 2002].
Реакция проводилась в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (рН=8,8), 1,25мМ MgCl2, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (10 мин при 96С) выполняли 35 циклов амплификации по схеме: денатурация - 75 сек. при 96С; отжиг праймеров - 75 сек. при 62С; элонгация - 75 сек. при 73С. Затем пробы выдерживали 5 мин при 73С и охлаждали. После ПДРФ-анализа продукты рестрикции разделяли в 6%-ном полиакриламидном геле (исходное соотношение акриламида и метиленбисакриламида 29:1) в течение 1,5 часов при 250V. В качестве электрофорезного буфера использовали ІхТВЕ (трис-боратный буфер). По окончании электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия (0,1мкг/мл) в течение 30 минут и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете.
Исследование особенностей клинического течения ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов TNFa-308, Lta-250, TNFRl и TGFp 1-869
С целью количественной оценки совместного действия аллелей на уровень протеинурии использован коэффициент детерминации (h ), показывающий какая доля изменчивости показателя (уровень протеинурии) обусловлена генотипами рассматриваемых генов. Коэффициент детерминации варьировал от 14,09% до 30,13%. Обращает на себя внимание наибольшее влияние комбинации генов трансформирующего фактора роста pi (TGFp 1-869) и рецептора фактора некроза опухоли (TNFR1) на уровень протеинурии - 30,13% (р 0,001).
Таким образом, можно заключить, что наличие у больных ХГН провоспалительных аллелей генов TNFa-308, Lta-250, TNFR1 и фибро-пластического аллеля гена TGFp 1 -869 ассоциировано с развитием умеренной или выраженной протеинурии. При комбинации в генотипе этих аллелей их влияние на уровень протеинурии возрастает с 6,31% (для одного гена рецептора фактора некроза опухоли - табл. 11) до 30,13% (при сочетании генов трансформирующего фактора роста pi и рецептора фактора некроза опухоли - табл. 13). Провоспалительные аллели генов фактора некроза опухоли а и лимфотоксина а ассоциированы с развитием умеренной протеинурии, а провоспалительный аллель гена рецептора фактора некроза опухоли и фибропластический аллель гена трансформирующего фактора роста 31 - с выраженной протеинурией. Следует отметить, что эти данные хорошо согласуются с ранее полученными нами в этом разделе работы результатами о значимом влиянии этих генов на дебют ХГН нефротическим синдромом, характеризующимся выраженной протеинурией (ген TNFR1) и смешанной формой , для которой также характерна выраженная протеину-рия (гены TNFa-308, TGFp 1-869, сочетание провоспалительных и фибро-пластического аллелей всех четырех изученных генов).
Выявлено достоверное увеличение частоты провоспалительных ал-леля Lta l и генотипа Ltal/Latl гена лимфотоксина a (Lta-250) у больных ХГН, имеющих гематурию (46,00% и 17,14%, соответственно) по сравнению как с контрольной группой (30,95% и 8,93%, соответственно, р 0,05), так и с больными ХГН без гематурии (13,64% и 0,00%, соответственно, р 0,001) (табл.14).
Итак, нами установлено, что рассмотренные полиморфные маркеры генов цитокинов играют важное значение в формировании особенностей клинического проявления хронического гломерулонефрита. Они ассоциированы с определенными клиническими вариантами (смешанная и нефро-тическая формы) и морфологическими формами ХГН (фокально-сегментарный гломерулосклероз, мезангиопролиферативный гломерулонефрит), наличием гематурии, тяжелой артериальной гипертензии, умеренной и выраженной протеинурии в течении заболевания.
Таким образом, представленные в данной главе результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что полиморфизмы генов фактора некроза опухоли a (TNFa-308), лимфотоксина a (Lta-250), рецептора фактора некроза опухоли (TNFR1) и трансформирующего фактора роста pi (TGFp 1-869) не ассоциированы с развитием ХГН, но оказывают существенное влияние на клинические особенности заболевания как в дебюте, так и в течении хронического гломерулонефрита. Таблица 14 Сравнительный анализ частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов TNFa-308, Lta-250, TNFR1 и TGFpl-869 у больных ХГН в зависимости от наличия гематурии (%)
Провоспалительные аллели генов TNFa-308, Lta-250, TNFR1 и фиб-ропластический аллель гена TGFpl-869 обусловливают более острое и тяжелое начало ХГН и определяют более выраженные клинические проявле 75 ния заболевания при его течении. При сочетании в генотипе этих аллелей их эффекты усиливаются.
Показано, что у больных ХГН с провоспалительными и фибропла-стическим аллелями изучаемых генов заболевание чаще манифестирует остронефритическим синдромом и его сочетанием с нефротическим синдромом. Наличие в генотипе комбинации из этих аллелей приводит к острому и тяжелому дебюту ХГН у более 50% больных, что в 2,5 раза чаще, чем при их отсутствии. Провоспалительные аллель А и генотип А А гена рецептора фактора некроза опухоли являются факторами риска развития тяжелой артериальной гипертензии и нарушения функции почек в дебюте заболевания.
Установлено, что у носителей провоспалительных аллелей генов TNFa-308, Lta-250, TNFR1 и фибропластического аллеля гена TGFpl-869 наблюдаются более выраженные клинические проявления хронического гломерулонефрита при его обострении (персистирующая протеинурия нефротического уровня, артериальная гипертензия). Сочетание в генотипе этих аллелей приводит к проявлению ХГН смешанной формой в 1,5 раза чаще, чем при их отсутствии. Провоспалительный аллель гена рецептора фактора некроза опухоли является фактором риска развития тяжелой артериальной гипертензии, гена лимфотоксина a - гематурии, гена фактора некроза опухоли а и гена лимфотоксина a - умеренной протеинурии, а гена рецептора фактора некроза опухоли и фибропластический аллель гена трансформирующего фактора роста pi - выраженной протеинурии. При комбинации в генотипе данных аллелей их влияние на уровень протеинурии возрастает с 6,31% (для одного гена рецептора фактора некроза опухоли) до 30,13% (при сочетании генов рецептора фактора некроза опухоли и трансформирующего фактора роста pi). Провоспалительные аллели гена фактора некроза опухоли a (TNFa-308), рецептора фактора некроза опухоли (TNFR1) и фибропластический аллель гена трансформирующего фактора роста pi (TGFP1-869) ассоциированы с развитием фокально 76 сегментарного гломерулосклероза, а провоспалительныи генотип гена TNFa-308 связан с формированием мезангиопролиферативного гломеру-лонефрита. Частота обострения заболевания и возраст его дебюта не связаны с полиморфизмом изученных генов.
Оценка эффективности терапии цитостатиками в зависимости от генотипов полиморфных маркеров геновTNFa-308, Lta-250, TNFRl nTGFpi-869
В данной главе представлены результаты исследования влияния полиморфизма генов фактора некроза опухоли a (TNFa-308), лимфотоксина a (Lta-250), рецептора фактора некроза опухоли (TNFR1) и трансформирующего фактора роста 31 (TGFp 1-869) на эффективность лечения больных хроническим гломерулонефритом.
Изучение ассоциации полиморфных маркеров генов TNFa-308, Lta-250, TNFR1 и TGFJ31-869 с эффективностью терапии проводилось у 169 больных ХГН. Среди них было 79 мужчин и 90 женщин. Средний возраст больных составил 36,2±8,9 лет, давность заболевания - 7,4±5,6 лет. При проведении данного исследования гомозиготы по провоспалительным и фибро-пластическому аллелям объединялись в одну группу с гетерозиготами.
Распределение клинических вариантов ХГН было следующим: латентный тип диагностирован у 64 пациентов (40,0%), гематурический тип - у 9 (5,6%), нефротический тип - у 48 (30,0%), гипертонический тип - у 24 (15,0%) и смешанный тип - у 15 (9,4%) больных.
Нарушение функции почек на момент начала терапии наблюдалось у 11 пациентов (уровень креатинина находился в пределах 0,14-0,43 ММоль/л). Синдром АГ выявлен у 109 больных (68,1%) больных. ПУ нефротического уровня отмечалась у 37 больных.
Проведено изучение эффективности терапии глюкокортикоидами (п=42), цитостатиками (п=28), глюкокортикоидами и цитостатиками (соче-танная терапия, п=36). Оценка результатов терапии ингибиторами АПФ проведена в трех группах больных. В первую группу были включены больные ХГН (п=77), получавшие монотерапию ингибиторами АПФ, во вторую группу вошло 28 пациентов, которым проводилось лечение глюкокортикоидами и ингибиторами АПФ, в третью - 29 больных, которые наряду с сочетанной терапией получали ингибиторы АПФ. Эффективность терапии у пациентов, получавших цитостатики и ингибиторы АПФ не изучалась в связи с небольшой численность выборки (п=5).
При исследовании ответа на терапию глюкокортикоидами установлено, что среди больных ХГН с невоспалительными аллелем Lta 2 (генотип Lta2/Lat2) гена лимфотоксина a (Lta-250) и аллелем TNFR1 G гена рецептора фактора некроза опухоли (TNFR1) (генотип TNFR1 G / TNFRl G ) доля пациентов со стероидочувствительным нефротическим синдромом достоверно выше по сравнению с индивидуумами с провоспалительными аллелями этих генов: по гену лимфотоксина a - 73,1% и 50,0%, соответственно, (р 0,01), по гену рецептора фактора некроза опухоли - 90,0% и 53,1%, соответственно (р 0,001) (табл.24). По другим анализируемым генам (фактор некроза опухоли а и трансформирующий фактор роста pi) значимых различий в проценте стероидочувствительных пациентов среди больных с провос 100 палительными и невоспалительными генотипами не установлено (табл.24). При сочетании в генотипе невоспалительных аллелей генов лимфотоксина а и рецептора фактора некроза опухоли удельный вес стероидочувствительных пациентов составляет 88,2%, что практически в 3 раза больше аналогичного показателя для больных с провоспалительными аллелями этих генов - 33,3% (р 0,001)(рис. 27).
Таким образом, у больных ХГН с провоспалительными аллелями генов лимфотоксина а и рецептора фактора некроза опухоли терапия глюкокорти-коидами мало эффективна (стероидочувствительными являются лишь 10-30% этих пациентов), тогда как при невоспалительных аллелях данных генов эффективность гормональной терапии максимальна - стероидочувствитель-ный нефротический синдром наблюдается у 73-90% больных.
Далее мы изучили эффективность терапии цитостатиками в зависимости от полиморфизма рассматриваемых генов. Результаты исследования показали, что у носителей невоспалительного генотипа гена лимфотоксина a (Lta-250) (генотип Lta2/Lat2) доля пациентов, у которых терапия цитостатиками эффективна достоверно выше по сравнению с индивидуумами с провоспалительными генотипами данного гена (генотипы Ltal/Latl, Ltal/Lat2) 102 66,7% и 50%, соответственно (р 0,05) (табл.25). Аналогичные данные получены и по гену рецептора фактора некроза опухоли (TNFR1). У носителей невоспалительного генотипа GG по этому гену процент индивидуумов, у которых терапия цитостатиками эффективна, в 2 раза превышает соответствующий показатель у пациентов с провоспалительными генотипами - 80% и 40% (р 0,001) (табл.25). У больных ХГН с комбинацией в генотипе невоспалительных аллелей генов лимфотоксина а и рецептора фактора некроза опухоли эффективность терапии возрастает - положительный ответ на терапию наблюдается у 85,0% больных. При сочетании в генотипе провоспалитель-ных аллелей этих генов эффект от терапии цитостатиками отмечается лишь у 50% пациентов (р 0,01) (рис. 28).
