Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 10
1.1. Род Brassica как объект исследования 10
1.1.1. Систематика рода Brassica 11
1.1.2. Эволюция и геномные взаимосвязи видов Brassica 16
1.1.3. Селекция и регистрация культурных форм Brassica 19
1.1.3.1. Селекция хозяйственно-ценных признаков 19
1.1.3.2. Селекция культур Brassica, устойчивых к болезням и неблагоприятным условиям среды 23
1.1.3.3. Регистрация сортов 27
1.2. Молекулярные маркеры в генотипировании растений рода Brassica 28
1.2.1. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP-маркеры) 29
1.2.2. Произвольно амплифицируемые ДНК-маркеры (RAPD-маркеры) 30
1.2.3. Анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов
(AFLP-маркеры) 33
1.2.4.1 Іолиморфизм простых повторяющихся последовательностей
(SSR-маркеры) 35
1.2.5.1 Іолиморфизм межмикросателлитных последовательностей (ISSR-маркеры) 41
1.2.6. Полиморфизм селективно амплифицируемых микросателлитных локусов (SAMPL-маркеры) 42
1.2.7. Амнлифицируемые маркеры с известной нуклеотидной последовательностью (STS и SCAR-маркеры) 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы 45
2.1. Материалы и реактивы 45
2.2. Приборы и методы 49
2.3. Общие методики 50
2.3.1. Выращивание растений 50
2.3.2. Выделение геномной растительной ДНК СТАВ-методом 50
2.3.3. Выделение геномной растительной ДНК на силикагелевомсорбенте 51
2.3.4. Выделение плазмидной ДНК 52
2.3.5. Полимеразная цепная реакция 53
2.3.6. Электрофорез в агарозном геле 53
2.3.7. Электрофорез в полиакриламидном іеле 54
2.3.8. Визуализация ДНК в полиакриламидном геле с помощью нитрата серебра. 54
2.3.9. Анализ флуоресцентно-меченных ПЦР-фрагментов 55
2.3.10. Секвенирование ДНК-матриц по Сэнгеру 55
2.3.11. Приготовление маркера длины pUC18/MspI 56
2.3.12. Проведение ферментативных реакций 56
2.3.13. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК 57
2.3.14. Трансформация и анализ клонов 57
2.3.15. Анализ клонов с помощью ПЦР-амплификации 58
2.3.16. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей микросателлитных фрагментов 58
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 59
3.1. Исследование генетического разнообразия растений рода Brassica 63
3.1.1. Выбор праймеров для анализа полиморфизма микросателлитных локусов... 63
3.1.2. Микросателлитный анализ видов Brassica и родственных представителей семейства Brassicaceae 66
3.1.3. Оценка і енетического полиморфизма видов и разновидностей Brassica 82
3.2. Исследование интрогрессии генетического материала геномов А, В и С
Brassica в межвидовые и межродовые гибриды 90
3.3. Исследование природы полиморфизма микросателлитных локусов геномов А,
В и С Brassica 93
3.4. Создание SCAR-маркера для анализа интрогрессии В-генома Brassica 100
3.5. Практическое применение метода микросателлитного анализа в селекции... 104
3.5.1. Генотипирование близкородственных сортов рапса {В парт) 104
3.5.2. Исследование интрогрессии аллельных форм микросателлитных локусов листовых овощных сортов В гара в их гибриды 106
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 114
ВЫВОДЫ 115
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 118
ПРИЛОЖЕНИЕ 142
- Род Brassica как объект исследования
- Материалы и реактивы
- Исследование генетического разнообразия растений рода Brassica
Введение к работе
Семейство Brassicaceae (Капустные) насчитывает 350 родов и около 3500 видов Экономическую ценность семейства главным образом определяет род Brassica (Капуста). Естественный отбор в пределах рода Brassica привел к формированию большою морфологического разнообразия, на основе которого было создано многообразие выращиваемых по всему миру ценных масличных, овощных, пряных, кормовых и декоративных культур. Большинство культурных форм Brassica произошло от шести основных видов: В париь (масличный рапс, брюква), В гара (восточноазиатские капусты, сурепица, репа и турнепс), В. oleracea (кочанная, брюссельская и цветная капуста, брокколи, кольраби), В juncea (горчица сарептская) В carinata (юрчица эфиопская) и В nigra (горчица черная). Филоіенетические взаимосвязи между этими видами хорошо описаны моделью так называемого "U-треуголышка". Согласно этой модели в результате естественной гибридизации трех диплоидных видов В гара, В nigra, В oleracea, геномы которых условно обозначены как АА, ВВ и СС, возникли аллотетраплоидные формы В. juncea (ААВВ), В napus (ААСС), В carinata (ВВСС). Таким образом, род Brassica представляет собой удобную модель для исследования іенетического разнообразия и интрогрессии генетического материала в результате межвидовой и межродовой гибридизации.
Исследование генетического разнообразия культурных и дикорастущих видов Brassica и родственных представителей семейства Brassicaceae представляет большое научное значение для выяснения филогенетических взаимосвязей и эволюции іеномов, уточнения границ таксонов и практическое значение для выявления потенциальных источников новых культур и доноров важных агрономических признаков, которые могут быть включены в различные селекционные программы.
Важной сферой описания и использования растительных генетических ресурсов является регистрация растительных форм. Новые сорта культурных растений должны пройти ряд тестов на отличимость, однородность и стабильность (DUS - Distinctness, Uniformity, Stability), которые составляют основу защиты интеллектуальной собственности селекционеров. Современная система диагностирования, основанная на ряде стандартизованных морфологических характеристик, требует длительных полевых испытаний. Кроме того, в связи с широким применением в селекции новейших биотехнологий растительные коллекции значительно пополнились іибридньїми сортами и генетически модифицированными формами, которые невозможно надежно различать и идентифицировать, используя ограниченное число морфологических характеристик. Для быстрого и надежного различения и идентификации растительных форм возникла необходимость анализа полиморфизма на генетическом уровне.
Наиболее перспективным подходом для исследования генетического полиморфизма представляется использование методов молекулярної о анализа, основанных на анализе полиморфизма ДНК (RFLP, RAPD, AFLP, SSR и т.п.), позволяющих получить индивидуальную характеристику отдельного генотипа - ДНК-профиль. Применение ДНК-технологий открывает новые возможности для эффективного решения различных задач современной селекции, таких как поддержание генетических коллекций, подбор родительских пар при скрещивании, составление родословных, контроль интрогрессии генетического материала, паспортизация и сертификация сортов, защита интеллектуальной собственности, картирование и клонирование генов хозяйственно ценных признаков, а также в исследовании организации и эволюции геномов, в мониторинге трансгенов.
Существующие методы анализа геномов отличаются по сложности, надежности и объему получаемой информации. Для надежного различения и идентификации
генотипов, исследования филоіенетических взаимосвязей и интрогрессии генетического материала, наиболее перспективным является метод анализа полиморфизма микросателлитов, позволяющий получать воспроизводимые, информативные профили известных фрагментов генома.
Целью данной диссертационной работы являлась разработка технологии іенотипирования культурных и дикорастущих форм Brassica на основе микросателлитного анализа.
Род Brassica как объект исследования
Систематика семейства Brassicaceae остается одной из наиболее спорных. Со времен Линнея она мноюкратно пересматривалась, однако многочисленные попытки не привели к созданию общепринятой системы.
В настоящее время семейство Brassicaceae насчитывает около 3500 видов и 350 родов, оріанизованньїх в 13-19 триб [Warwik, Sauder, 2005]. Одной из наиболее значимых и многообразных является триба Brassiceae включающая 50 родов и приблизительно 240 видов [Warwik, Sauder, 2005]. В пределах трибы на основе морфологических характеристик выделяют семь субтриб: Brassicinae, Cakilinae, Moricandiinae, Raphaninae, Savignyinae, Vellinae, и Zillinae. Род Brassica наряду с родами Coincya, Diplotaxis, Eruca, Erucastrum, Hirschfeldm, Sinapidendwn, Sinapis, и Trachystoma относят к субтрибе Brassicinae.
Классификацию субтрибы Brassicinae на родовом и видовом уровнях значительно усложняет неопределенный статус многих таксонов. Schul/ (1936) выделил в субтрибе Brassicinae 11 родов и 90 видов, однако Gomez-Campo (1980) определил 9 родов и 100 видов. Такое расхождение обусловлено большим морфологическим разнообразием среди различных таксонов капустных.
В последнее время в систематике капустных появилась тенденция сокращения некоторых дополнительных родов и придание ранга подвидов некоюрым видам [Gomez-Campo, 1980, 1999]. Существующие границы субтриб и родов, основанные на нескольких морфологических особенностях плодов и семян, считаются МНОІИМИ систематиками в значительной степени искусственными и вызывают большие разногласия, поскольку довольно часто встречается явление межродовой гибридизации [Warwick, Black, 1993]. Чтобы решить эти таксономические проблемы были предприняты попытки морфологических, цитогенетических и биохимических исследований [Harberd, 1976, Mizushima, 1950, Pradhan et al, 1992]. Однако данных, позволяющих четко разделять рода, получено не было.
Благодаря большому разнообразию форм систематика рода Brassica является наиболее сложной. Жуковский насчитывал более ста дикорастущих и культурных видов Brassica [Жуковский, 1971]. В результате всестороннего исследования систематики мировой флоры [Warwik et al., 2000] было выявлено существование множества синонимов почти у всех видов рода Brassica и родственных представителей Brassicinae, поскольку в последние 240 лет систематики ссылались на одни и те же виды под разными названиями. В настоящее время в ранге вида Brassica принято 38 таксонов [Warwick et al., 2000, GRIN (http.7/www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/index.pl)] (Табл. 1). Большое количество таксонов нуждается в уточнении.
Многие виды Brassica отличаются большим внутривидовым разнообразием фенотипов и имеют сложную внутривидовую структуру (Габл. 1). Таксономическое положение многих растительных форм многократно пересматривалось. Так, например, блаюдаря значительным морфологическим различиям растительные формы вида В гара и нередко выделяли в отдельные виды: В narinosa, В nipposinica, В pekinemis, В parachinemis, В perviridis [Артемьева и Фарбер, 1999]. Советский ботаник Лизгунова Т.В. различала самостоятельные виды капусты: кочанная (В capitata), савойская (В. sabauda), брюссельская (В gemmifera), кольраби (В gongylodes) и цветная (В botrytis) [Жуковский, 1971]. В систематике подвидов и разновидностей Brassica в настоящее время также встречаются некоторые разночтения, требующие дополнительного уточнения.
Материалы и реактивы
Расі игольный материал: был получен из коллекций Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова, Всероссийскою НИИ кормов им. В.Р. Вильямса, Всероссийскою НИПТИ рапса и Centre for Genetic Resources (CGN), Нидерланды (Табл 7). Олигонуклеотиды, используемые в работе, были синтезированы А.В. Кузубовым и Я.И. Алексеевым (ЗАО «Синтол», Россия) на авюматическом ДНК-синтезаторе ASM 102U (Новосибирск, Россия).
В работе использовали ферменты: ДНК-полимеразу ThermoStar, обеспечивающую «горячий старт» при проведении ПЦР, производство ВНИИСБ (лаб. Молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций, зав. лаб. Лунин В.Г.), термосеквепазу фирмы Amersham Biosciences (США), Т4 ДНК-лигазу фирмы Promega (США); эндонуклеазы рестрикции Msp I, EcoRl и соответствующие буферные растворы фирмы MBI Fermentas (Литва).
Реактивы: дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) фирмы Медиген (Россия), хлорид магния, агароза-LowEEO, формальдегид, Ы,Ы -метилснбисакриламид, акриламид, персульфат аммония, Ы,Ы,Ы Ы -тетраметилэтилендиамин (ІКМЕД), їлицерин, тритон Х-100, минеральное масло, краситель бромистый этидий, красители -маркеры бромфеноловый синий (ВРВ) и ксиленцианол (ХС), лизоцим, трис-(гидроксимегил)-аминометан, додецилсульфат натрия (ДСП), ацетаг калия, этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), мочевина, бромид цетилтриметиламмония (СТАВ), Р-меркаптоэтанол, формамид, 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-0-галактозид (X-gal), и юпропилтио-р-О-галактозид (ИПТГ) фирмы Sigma, (США), дрожжевой экстракт, бакто-триптон, бакто-агар фирмы Difco (США).
Бактериальные штаммы и питательные среды: в работе был использован лабораторный штамм Е coli DH5a. Для выращивания бактерий использовали среду LB {Luria-Bertam). 1 л среды содержал 10 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г хлорида натрия (рН 7,5). Для приготовления агаризованных сред непосредственно перед автоклавированием добавляли бакто-агар (15 г/л). Плазмидный вектор: для клонирования продуктов полимеразной цепной реакции использовали pGEM Easy вектор фирмы Promega (США).
Используемые кислоты, щелочи, соли и органические растворители представляют собой коммерческие реактивы отечественного производства квалификации «хч», дополнительно очищенные по стандаргным методикам.
Исследование генетического разнообразия растений рода Brassica
Первоначальный этап работы заключался в подборе праймеров к фрагментам іенома, содержащим микросателлиты. При выборе оптимальных пар праймеров для исследования полиморфизма микросателлитов растений Brassica мы использовали праймеры к известным микросателлитным локусам, опубликованные Kresovich и соавт. (1995), Szewc-McFadden и соавт. (1996), Suwabe и соавт. (2002), Lowe и соавт. (2004). Выбор праймеров определялся двумя основными критериями:
длиной амплифицируемых микросателлитных фрагментов;
количеством выявляемых аллелей.
Различие длин аллелей микросателлитної о локуса, птвным образом, определяется числом повторяющихся единиц, представляющих собой ди-, три-, тетра-, цента- и гексануклеотиды. Для надежного различения ПЦР-фрагментов, отличающихся на несколько нуклеотидов, с помощью электрофореза высокого разрешения в полиакриламидном геле, их длина не должна быть слишком большой (желательно не более 300 нуклеотидов). Важным критерием при выборе праймеров также является количество выявляемых ими аллелей, определяющее полиморфизм микросателлитного локуса. Для генотипирования видов и разновидностей Brassica на основании литературных данных были выбраны праймеры, позволяющие детектировать более трех аллелей.
При выборе праймеров особый интерес представляли сведения о том, в каких іеномах Brassica данные локусы были впервые обнаружены. Для исследования межвидового и внутривидового полиморфизма Brassica были выбраны пары праймеров, к микросателлитным локусам, выявленным в іеномах В гара (АА), В nigra (ВВ), В oleracea (СС) и В парт (ААСС).
На основе перечисленных критериев и І 459 пар праймеров для исследования полиморфизма микросателлитпых локусов Вгачжа были отобраны 40 пар праймеров (I абл. 9). Следует отметить, что выбранные для работы нраймеры были взяты из разных источников и отличаются разным информационным обеспечением. Праймеры Lowe и соавт. тестировались на четырех представителях треуюльника U: В oleracea, В napus, В гара и В nigra Suwabe и соавт. исследовали полиморфизм микросателлитных фрагментов на представителях В гара, а также показали возможность использования этих праймеров для других видов Brassica, входящих в треугольник U. Kresovich и соавт. исследовали свои праймеры только на В oleracea, В парт и В гара. Предложенные этими авторами праймеры использовались также в друїих независимых исследованиях [Allender et al, 2003], однако их результаты не всегда согласуются.
Представленные в Табл. 9 пары праймеров предварительно тестировались на представителях трех видов Brassica: В napus (іеномьі А и С), В гара (іеном А) и В juncea (геномы А и В) на наличие/отсутствие ПЦР-продуктов. Было обнаружено, что некоторые пары праймеров (NalO-ВЮ, Ш-В01, OI11-G11, Ra2-G09, BRMS-027 и BRMS-029) (Габл. 9) дают широкий спектр неспецифичных продуктов в диапазоне от 100 до 500 п. н. независимо от условий амплификации. Поэтому в дальнейших исследованиях данные нраймеры не использовались.
Похожие диссертации на Технология генотипирования культурных и дикорастущих форм Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов
