Введение к работе
Актуальность проблемы. Расширение генетического базиса методами селекции на уровне соматических и репродуктивных клеток с включением измененных вариантов, а также константных форм, полученных с помощью гаплоидных технологий в схему традиционной селекции, может обеспечить значительный успех в селекции яровой мягкой пшеницы. Комплексное применение отбора клеточных популяций в селективных условиях и методов гаплоидии повышает эффективность получения растений устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам (В.С. Шевелуха и др., 2008). Кроме того, ускоренное размножение дигаплоидных линий и их включение в различные схемы скрещиваний в настоящее время дает практические результаты.
Яровая мягкая пшеница — важнейшая зерновая культура для хлебных районов Северного Казахстана, урожайность которой в Казахстане за последние 10 лет не превышает 1 тонну с гектара, что значительно ниже средних мировых показателей. Это обусловлено почвенно-климатическими условиями Казахстана, сокращением водообеспеченности, засухой, появлением опасных возбудителей болезней, которые являются сдерживающими факторами повышения продуктивности пшеницы. В последние годы распространение болезней зерновых культур наносит значительный ущерб продуктивности и качеству зерна. В рамках сотрудничества Международного центра СИММИТ и сельскохозяйственных НИУ обследованы в северных регионах Казахстана поля озимой и яровой мягкой пшеницы и ячменя, в результате чего установлено, что распространение особо опасных возбудителей болезней выглядит следующим образом: Tan spot - 10-36%, Septoria nodorum - 3-21%, Bipolaris sorokiniana - 5-9%, Septoria tritici - 7% (Duveiller, 2007). В регионе массовое заболевание септориозом посевов яровой мягкой пшеницы наблюдается в середине и в конце июля из-за заражения пикноспорами, заселяющих пожнивные остатки (Койшибаев, 2006).
Комплексное применение скрининга клеточных популяций в условиях селекции in vitro повышает эффективность отбора яровой мягкой пшеницы к биотическому стрессу.
Исходя из выше изложенного, работа по усовершенствованию схемы селекции пшеницы в условиях in vitro, включающей все звенья отбора клеток под действием различных селективных агентов является актуальной.
Цель и задачи исследования. Цель исследований — создание технологической цепи, включающей традиционные методы селекции и биотехнологические методы, путем усовершенствования эффективности гаплоидных технологий при отборе яровой мягкой пшеницы на устойчивость к водному дефициту и к фитопатогенному грибу Septoria nodorum Вerk.
Задачи исследований:
создать экспериментальную систему повышения эффективности пыльцевого эмбриогенеза и выяснить роль гормональных предобработок растений-доноров в индукции спорофитного пути развития микроспор яровой мягкой пшеницы;
провести селекцию на уровне гамет и гаметоклональных вариантов на толерантность к абиотическим факторам окружающей среды (водный стресс);
выявить лучшие формы селективного агента для проведения селекции in vitro к грибному патогену Septoria nodorum Вerk. Провести отбор эмбриоидов и размножить полученные линии, устойчивые к экзометаболитам гриба S. nodorum;
создать новые перспективные формы и линии яровой мягкой пшеницы с ценными хозяйственно-биологическими признаками на основе сочетания традиционных и биотехнологических методов с последующим включением их в селекционные программы для облегчения и ускорения селекционного процесса и расширения генетического базиса селекции пшеницы;
изучить возможность использования белковых и молекулярных маркеров для отбора перспективных форм яровой пшеницы в ранних поколениях.
Научная новизна работы. Разработана технология, сочетающая традиционные и биотехнологические подходы, обеспечивающие расширение генетического базиса селекции яровой мягкой пшеницы.
Создана экспериментальная система повышения эффективности пыльцевого эмбриогенеза и выявлена роль гормональных предобработок растений-доноров в индукции спорофитного пути развития микроспор яровой мягкой пшеницы. Установлено, что гормоны ауксинового типа действия – ИУК, 2,4-D при обработке растений-доноров, с учетом содержания эндогенного ИУК, стимулируют процесс андрогенеза in vitro. Выявлено, что при предобработке ИУК срезанных растений, эмбриоиды индуцируются из поздних стадий развития микроспор, возможно из пыльцевого зерна. Кроме того, установлено, что предобработка срезанных растений аконитовой кислотой приводит к 100% выживанию индуцированных эмбриоидов и формированию из них растений-регенерантов.
Впервые показана возможность разработки новой модификации технологии гаметной селекции, основанной на использовании активно растущего мужского гаметофита для повышения эффективности получения спорофитной генерации. Такой подход позволил получить новые линии яровой мягкой пшеницы, устойчивые к засухе.
Константные формы, а также гаметоклональные варианты включены в программу селекции пшеницы на устойчивость к водному дефициту. Линии-регенеранты превысили стандарт (сорт Акмола 2) по продуктивности и проявили устойчивость к засухе и к полеганию. Полученные линии, в сравнении со стандартом, отличались по своим анатомо-морфологическим признакам и по архитектонике.
Впервые для селекции клеточных колоний пшеницы in vitro, устойчивых к экзометаболитам гриба Septoria nodorum Вerk, одновременно применен отбор на уровне репродуктивных и соматических клеток при поверхностном и глубинном выращивании каллусных культур.
Выявлены гибридные комбинации с большим содержанием МДГ-ГОАТ (малатдегидрогеназа-глутамат-оксалоацетат аминотрансфераза) по сравнению с родительскими формами. Малатдегидрогеназный комплекс позволяет отобрать ценные линии на устойчивость к засухе в ранних поколениях.
С помощью RAPD-метода выявлены изменения в геноме потомства растений-регенерантов пшеницы, полученных в результате применения гаплоидных технологий. Определены генетические расстояния между дигаплоидной линией и исходным сортом, а также гаметоклональными вариантами, отражающие степень различия их геномов.
Практическая значимость работы. Отобранные в культуре пыльников яровой мягкой пшеницы линии переданы селекционным учреждениям, расположенным в различных регионах Казахстана (НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева, Карабалыкская СХОС, Актюбинский селекционный центр) для селекционной оценки и включения в гибридизацию. Перспективные линии будут переданы на ГСИ.
Разработанная нами технология получения перспективных форм и линий яровой мягкой пшеницы на основе сочетания традиционных и биотехнологических методов селекции, может быть применена и к другим злаковым культурам.
Полученные результаты используются в учебном процессе при чтении лекций и проведения лабораторно-практических занятий по курсу «Биотехнология растений» и «Биотехнология сельскохозяйственных культур» в Казахском агротехническом университете им. С. Сейфуллина. Основные результаты исследований по гаметоклональной селекции растений вошли в учебник «сімдік биотехнологиясы» (С.С. Беккужина, 2009), рекомендованный Министерством образования и науки РК для преподавания в биологических и агрономических факультетах ВУЗов.
В результате исследований разработан способ получения гаплоидных растений пшеницы с повышенным регенерационным потенциалом, на который получен инновационный патент (2007/0161.1.).
Основные положения, выносимые на защиту:
- Разработана экспериментальная система, способствующая повышению компетенции микроспор для эффективного использования гаплоидной технологии по расширению генетической основы яровой мягкой пшеницы. Баланс фитогормонов является одним из ключевых механизмов переключения микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития. У растений-доноров с высоким эндогенным содержанием индолилуксусной кислоты при их дополнительной обработке экзогенной ИУК повышается эффективность пыльцевого эмбриогенеза.
- Создана схема селекции на уровне репродуктивных и соматических клеток, позволяющая отбирать клеточные линии, устойчивые к засухе используя АБК, как фактор, моделирующий водный дефицит. Для получения форм устойчивых к S. nodorum Вerk. в качестве селективного агента целесообразно использовать водную форму фильтрата фитопатогенного гриба S. nodorum Вerk.
- Создана технология, сочетающая традиционные методы селекции и методы биотехнологии для ускорения селекции яровой мягкой пшеницы по отбору ценных признаков на продуктивность и стрессоустойчивость. Включение потомства растений-регенерантов в схемы классической селекции выявило преимущества комплексного использования этих методов по выявлению линий, обладающих хозяйственно-ценными признаками.
- Белковые и молекулярные маркеры позволяют отбирать перспективные формы яровой мягкой пшеницы в ранних поколениях.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и представлены на различных международных, республиканских конференциях, симпозиумах и совещаниях, в том числе на Международном симпозиуме «Устойчивость растений к биотическим и абиотическим факторам» (Берлин, 2009); Международном микологическом форуме (Москва, 2009, 2010); Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2009); Международной научной конференции «Актуальные вопросы биологии в Байкальском регионе» (Иркутск, 2009); IX Конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Москва, 2008); Международной конференции, посвященной 40-летию ГосНИИгенетика (Москва, 2008); Российской конференции «Генетика микроорганизмов», посвященной 100-летию со дня рождения С.А. Алиханяна (Москва-Пущино-на-Оке, 2006); Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию РГП «НПЦ ЗХ им. А.И.Бараева» (Шортанды, 2006); Международной конференции, посвященной 50-летию КазАТУ им. С. Сейфуллина (Астана, 2007); Международной конференции «Развитие ключевых направлений сельскохозяйственных наук в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы» (Астана, 2004);на Координационном совещании по Государственной программе 042 (Шортанды, 2001-2005).
Связь работы с крупными научными программами. Теоретические и экспериментальные исследования по диссертационной работе тесно связаны с выполнением Республиканских научных программ Министерства сельского хозяйства и Министерства образования и науки по проектам:
- «Расширение генетического базиса яровой мягкой пшеницы с помощью DH-метода»;
-«Усовершенствование методов селекции пшеницы на уровне клеток, выяснение механизмов, обеспечивающих устойчивость к биотическим факторам в морфогенетическом цикле «клетка-растение-клетка».
Публикации Основные положения диссертации изложены в 55 печатных работах, включая научные статьи, тезисы докладов, учебник, учебное пособие, методические рекомендации, инновационный патент.
Личный вклад автора. Экспериментальные результаты получены автором лично и совместно с коллегами из Института биологии и биотехнологии, центра биотехнологии Республики Казахстан, Института Молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина, Института проблем биологической безопасности, НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева, РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, Карабалыкской СХОС. Авторство указано в списке опубликованных работ, приведенных в диссертации и в автореферате.
Формулировка идей, планирование экспериментов, обработка первичных данных, их статистико-математический анализ и теоретическое обобщение результатов выполнены диссертантом. Диссертационная работа полностью написана лично автором.
Обоснованность и достоверность научных положений и выводов обеспечивается анализом обширного экспериментального материала, полученного в течение 17 лет, с использованием общепринятых и современных методик, а также разработанных нами методик и статистической обработкой результатов исследований с оценкой их точности и достоверности.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и 3 глав: обзора литературы, объектов и методов исследований, результатов и их обсуждения (7 разделов), а также выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит 46 таблиц, 72 рисунка. Список литературы включает источников.
