Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Часть 1.1. Свойства водных эмульсий фосфолипидов в отсутствие и присутствии различных биологически активных соединений 10
1.11. Свойства индивидуальных фосфолипидов и их смесей в водной фазе 10
1.1.2.Структурная организация и лилидный состав биомембран 26
1.1.3.Современные представления о механизмах взаимодействия мембран и белков разных типов (мембранные, периферические белки, немембранные водорастворимые белки) 43
1.1.4. Интерфазный катализ 54
Часть 1.2. Липосомальные формы противотуберкулезных препаратов для лечения туберкулеза легких 57
1.2/.. Строение и свойства М. tuberculosis микобактерии и
начальные этапы взаимодействия с макрофагами 58
1.2.2. Схема терапии туберкулеза легких и описание свойств
препаратов - производных рифамицина (рифампицина и
рифабутина) 74
1.2.3. Липосомы с противотуберкулезными препаратами для
лечения заболеваний легких
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 2. Свойства модельных и биологических мембран, модифицированных фосфолипазами разных типов:
Часть 2.1. Оптимизация условий гидролиза фосфолипидов в составе агрегатов различного строения фосфолипазами 102.
2.1.1. Гидролиз ФХ в присутствии дезоксихолата под действием фосфолипазы С 102
Часть 2. Белок-липидные комплексы 174
4.2.1. Оптимизация условий их получения и анализ состава 174
4.2.2. Характеристики полученных комлексов 179
4.2.3. Структурная организация фосфолипидов в белок-липидных комплексах 187
4.2.4. Взаимодействие немембранных водорастворимых белков с фосфолипидами цвиттер-ионами 190
4.2.5. Активность белков в составе белок-липидных комплексов 207
Часть 4.3.Комплексы фосфолипидов с бактериоцинами и их антимикробная активность 220
ГЛАВА 5 Взаимодействие антибиотиков рифамицинового ряда с модельными
мембранами ; получение липосомальных форм рифампицина и рифабутина.
Часть 5.1. Физико-химические характеристики рифампицина и рифабутина в зависимости отрН среды (растворимость, рКа) 226
5.1.1.Растворимость антибиотиков в зависимости от рН среды 228
5.1.2. Определение рКа антибиотиков 229
Часть 5.2. Связывание антибиотиков рифамицинового ряда с модельными мембранами 242
5.2.1 Методы получения липосомальной формы рифампицина и рифабутина 242
5.2.2.Оптимизация условий включения ПТП в липосомы 244
5.2.3..Влияние ионной силы на включение антибиотиков в пипосомы 253
5.2.4. Влияние природы буфера с различной ионной силой на включение антибиотиков в липосомы при рН=6,0 256
5.2.5. Влияние рН среды на включение антибиотиков в липосомы из ФХ 258
Часть 5.3. Исследование механизма взаимодействия антибиотиков с модельными мембранами с помощью коэффициента распределения октанол/вода и липосомы/вода 259
5.3.1.Определение коэффициента распределения антибиотиков методом разделения фаз. 263
5.3.2., Определение К<1 антибиотиков в системе 4
Часть 4.2. Белок-липидные комплексы 174
4.2.1. Оптимизация условий их получения и анализ состава 174
4.2.2. Характеристики полученных комлексов 179
4.2.3. Структурная организация фосфолипидов в белок-липидных комплексах 187
4.2.4. Взаимодействие немембранных водорастворимых белков с фосфолипидами цвиттер-ионами 190
4.2.5. Активность белков в составе белок-липидных комплексов 207
Часть 4.3.Комплексы фосфолипидов с бактериоцинами и их антимикробная активность 220
ГЛАВА 5 Взаимодействие антибиотиков рифамицинового ряда с модельными мембранами ; получение липосомальных форм рифампицина и рифабутина.
Часть 5.1. Физико-химические характеристики рифампицина и рифабутина в зависимости отрН среды (растворимость, рКа) 226
5.1.1.Растворимость антибиотиков в зависимости от рН среды 228
5.1.2. Определение рКа антибиотиков 229
Часть 5.2. Связывание антибиотиков рифамицинового ряда с модельными мембранами 242
5.2.1 Методы получения липосомальной формы рифампицина и рифабутина 242
5.2.2.Оптимизация условий включения ПТП в липосомы 244
5.2.3..Влияние ионной силы на включение антибиотиков в пипосомы 253
5.2.4. Влияние природы буфера с различной ионной силой на включение антибиотиков в липосомы при рН=6,0 256
5.2.5. Влияние рН среды на включение антибиотиков в липосомы из ФХ 258
Часть 5.3. Исследование механизма взаимодействия антибиотиков с модельными мембранами с помощью коэффициента распределения октанол/вода и липосомы/вода 259
5.3.1.Определение коэффициента распределения антибиотиков методом разделения фаз. 263
5.3.2., Определение К<1 антибиотиков в системе 4
5.3.2.. Определение Kd антибиотиков в системе липосомы/ вода методом флуоресценции. 267
5.3.3..Коэффициент распределения Kd антибиотиков в системе октанол/вода. 278
Часть 5..4. Стабильность рифампицина в водной фазе и в составе липосом. Антимикробная активность препаратов 284
5.4.1. Получение стандартов-индивидуальных продуктов деструкции и окисления рифампицина 284
5.4.2. Анализ продуктов деструкции и окисления водного и липосомального препаратов РФ при хранении при 25 С 288
5.4.3. Продукты деструкции рифампицина в составе липосомальной формы при хранении при 4С. 290
5.4.4. Лиофилизированный липосомальный препарат 292
5.4.5. Бактериостатическая активность липосомальной формы рифампицина при различных сроках хранения 295
ГЛАВА 6. Эффективность действия «ПУСТЫХ» ЛИПОСОМ И липосомальных форм противотуберкулезных препаратов в отношении микобактерий 297
Часть 6.1. Взаимодействие «пустых» липосом с М. tuberculosis и М. avium в
среде инкубации и инфицированных макрофагах мышей 298
Часть 6.2. Взаимодействие «пустых» липосом с М. smegmatis 309
Часть 6.3. Эффективность действия рифампицина в растворе и в составе
липосом в отношении М. tuberculosis H37Rv и М. smegmatis 319
Часть 6.4. Исследование эффективности действия рифампицина в
растворе и в составе липосом на модели экспериментального туберкулеза у
мышей 320
ГЛАВА 7. Материалы и методы исследований 334
Часть 7.1. Используемые в работе реактивы 334
Часть 7.2. Методы исследования 337
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 345
ВЫВОДЫ 346
ГЛАВА 8. Список литературы 348
- Свойства индивидуальных фосфолипидов и их смесей в водной фазе
- Оптимизация условий гидролиза фосфолипидов в составе агрегатов различного строения фосфолипазами
- Физико-химические характеристики рифампицина и рифабутина в зависимости отрН среды (растворимость, рКа)
Введение к работе
В настоящее время с лечением туберкулеза во всем мире сложилась
столь неблагополучная ситуация, что Всемирная Организация
Здравоохранения объявила в 2003г туберкулез глобальной угрозой жизни
человека. Невысокая эффективность лечения туберкулеза обусловлена
многими причинами, в том числе токсичностью многих
противотуберкулезных препаратов (ПТП). Особенно выражены токсические эффекты у препарата первого ряда - рифампицина, которые вынуждают больных отказываться от его приема.
Для решения проблемы лечения туберкулеза необходимы новые подходы, которые должны включать как поиск новых препаратов, так и разработку новых менее токсичных лекарственных форм ранее применяемых ПТП.
В связи с тем, что микобактерия туберкулеза {Mycobacterium tuberculosis (М.tuberculosis)), вызывающая это заболевание, размножается в основном внутри клеток легочной ткани (макрофагов), представлялось целесообразным использовать такие лекарственные формы, которые были бы способны направленно транспортировать ПТП внутрь этих клеток. Эта задача может быть решена с помощью липосом, которые, как известно, фагоцитируются макрофагами.
Наряду с этим представляется необходимым поиск новых препаратов, обладающих антибактериальной активностью, но нетоксичных для человека. В качестве примера можно привести белки, секретируемые непатогенными бактериями (бактериоцины). Однако эти водорастворимые белки не проникают через мембрану макрофагов и для их внутриклеточной доставки можно использовать липосомы.
Одним из положительных свойств липосом в качестве
транспортирующей системы является фармакологическая активность самих фосфолипидов, из которых сформированы липосомы. Известны несколько препаратов на основе фосфолипидов для лечения гепатита, цирроза, токсических поражений печени: «Эссенциале» (Германия), отечественный препарат «Фосфоглиф», препарат «Липин» (Украина) и др. В литературе имеются отдельные сообщения о противовоспалительном и
антиэксудативном действии фосфолипидов. Перечисленные выше данные позволяют прогнозировать значительные преимущества липосомальных форм ПТП по сравнению с таблетированными, в связи с чем разработка таких форм представляется весьма актуальной. Она позволит увеличить растворимость ПТП, усилить их проникновение в макрофаги и возможно, окажет дополнительные эффекты, например, снизит токсичность или увеличит время пребывания препарата в организме.
Наряду с этим следует учесть, что в легких человека и животных липосомы, содержащие ПТП, целенаправленно взаимодействуют как с инфицированными макрофагами, так и с микобактериями. Известно, что клеточная стенка последних содержит различные фосфолипазы, в том числе фосфолипазу С и фосфолипазу А2. В связи с этим с целью прогнозирования возможных механизмов деградации компонентов липосом при. их введении в организм представлялось необходимым оценить свойства липосом после их обработки различными фосфолипазами.
Основной целью работы являлась разработка научных основ создания липосомальных форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений как способа оптимизации их свойств для повышения эффективности фармакологического действия. Другой целью была оценка антибактериальной активности липосомальной формы рифампицина в отношении клеток М. tuberculosis in vitro и in vivo.
Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи, которые разделялись на три группы:
1.1. Изучить закономерности гидролиза фосфолипидов в различных
агрегационных состояниях фосфолипазой С.
1.2. Исследовать слияние и проницаемость для ионов кальция липосом из
смесей фосфолипидов при инкубации их с фосфолипазами С разной
специфичности.
Те же процессы изучить на изолированных нервных окончаниях (синаптосомах).
Оценить эффективность действия липосом, содержащих продукт гидролиза фосфолипидов - 1,2-диацилглицерин (ДАГ) - на функциональное состояние фагоцитов человека и рану кожи экспериментальных животных.
2.1. Получить комплексы белковых ингибиторов трипсина (основного
панкреатического ингибитора протеаз и соевого ингибитора типа Баумана -
Бирк) и оценить их ингибирующую активность в составе комплексов.
2.2. Получить белок-липидные комплексы с бактериоцинами и исследовать
их антимикробную активность in vitro и in vivo в отношении m.tuber.
3.1. Изучить физико-химических свойства антибиотиков рифамицинового
ряда в зависимости от рн среды; оптимизировать условия получения их
липосомальных форм.
3.2. Исследовать стабильность липосом с рифампицином при хранении.
3.3. Исследовать антибактериальное действие липосом с рифампицином
in vitro и in vivo в отношении М.tuberculosis.
Свойства индивидуальных фосфолипидов и их смесей в водной
В данной работе в качестве объектов исследования использовались агрегаты фосфолипидов в водной фазе в присутствии и отсутствие детергентов, немембранные водорастворимые белки типа сериновых протеаз и их белковые ингибиторы, синаптические мембраны, отдельные клетки (макрофаги), ткань легкого морской свинки и микобактерии туберкулеза. Основной задачей литературного обзора явилось освещение современных представлений о фосфолипидах как о самоорганизующихся системах, которые являются основной структурной единицей биологических мембран, а также краткая характеристика других обьектов исследования.
Типы агрегатов фосфолипидов в водной фазе и в присутствии других амфифильных соединений.
В связи с тем, что фосфолипиды при диспергировании в водной фазе образуют агрегаты, различные по структуре и размерам, кратко остановимся на терминологии для их описания, предложенной Папаханджополусом [1]. а также на их взаимодействии с детергентом дезоксихолатом.
Фосфолипиды представляют собой амфифильные соединения, в молекуле которых присутствует полярная часть - замещенный остаток фосфорной кислоты и гидрофобная часть - два остатка жирных кислот. На рис.1-1 приведены структурные формулы фосфолипидов, наиболее часто используемых в данных исследованиях.
На поверхности вода-воздух фосфолипиды образуют монослой. В водной фазе короткоцепочечные (до 10 атомов С) фосфолипиды образуют мицеллы, а фосфолипиды с большим числом атомов углерода в цепи мультиламеллярные везикулы. Точнее сказать, длинноцепочечные фосфолипиды в водной фазе также могут образовывать мицеллы, но в очень низких концентрациях. Для дипальмитоиллецитина критическая концентрация мицеллообразования равна 4,6 10 10 моль.л _1 [2]. Рассматривая образование мицелл как обратимую химическую реакцию :
N.B==M где В и М - обозначения молекулы амфифила и мицеллы из него, а N - число агрегации, можно применить к нему условие равновесия, полученное Гиббсом для обратимой химической реакции агрегации: N м і = \jH
где р , и pN - химические потенциалы вещества в мономерном и агрегированном состоянии. Тогда изменение свободной энергии Гиббса при агрегации может быть выражено формулой: AGN = -RT In ККМ
где ККМ- критическая концентрация мицеллообразования. Подставив в это уравнение ККМ для дипальмитоилфосфатидилхолина, получим, что стандартная энергия Гиббса мицеллообразования составит 53 кДж моль"
При дальнейшем повышении концентрации фосфолипидов они преобразуются в мультиламеллярные везикулы, представляющие собой систему из нескольких протяженных бислоев, разделенных водным пространством. Различными методами удается «разбить» большие мультиламеллярные везикулы на более мелкие частицы - небольшие замкнутые пузырьки, мембрана которых состоит из одного бислоя, а внутри пузырьков содержится водная фаза.
В настоящее время пользуются следующей классификацией везикул по размерам: (мкм): 0,1-100- мультиламеллярные везикулы (МЛВ, MLV); 0,02-0,1-малые однослойные везикулы (МОВ) или (SUV); 0,1-1,0 большие однослойные везикулы (БОВ) или (LUV) [1]. И МЛВ и однослойные везикулы (ОВ) широко используется как модель биологической мембраны, и у каждой из них есть свои преимущества и недостатки. МЛВ; размер которых превышает 1 мкм; имеют малую кривизну поверхности так же, как и биологическая мембрана, поэтому распределение разных типов фосфолипидов между слоями более или менее однородно. Однако система МЛВ довольно гетерогенна по размерам. Что касается ОВ, то с помощью различных методов можно получить гомогенную систему с везикулами заданных размеров, стабильную в течение длительного времени. Однако ОВ имеют большую степень коивизны, неравномерное распределение фосфолипидов разных классов между внешним и внутренним слоем, в которых молекулы фосфолипидов обладают большей подвижностью, чем в МЛВ.
Самопроизвольно образуются только МЛВ, для получения остальных нужно внешнее воздействие. Наибольших энергетических затрат требует получение МОВ [3]. Увеличение энергии Гиббса при уменьшении размеров везикул вызвано резким увеличением поверхности раздела, в результате чего однослойные везикулы оказываются термодинамически неустойчивыми системами. Со временем они сливаются, вновь образуя мультиламеллярные структуры.
Оптимизация условий гидролиза фосфолипидов в составе агрегатов различного строения фосфолипазами
Предварительные исследования показали, что фосфолипаза С из Вас. cereus гидролизует фосфолипиды только в составе агрегатов малых размеров, т.е. ОБВ и не гидролизует их в составе МЛВ. Поэтому далее использовали два типа агрегатов; смешанные мицеллы фосфолипида с детергентом и ОБВ. В связи с тем, что измельчение агрегатов фосфолипидов под действием детергентов зависит от молярного соотношения детергент, на первом этапе работы изучили фазовую диаграмму этой системы.
Размеры и строение агрегатов фосфолипидов при разных соотношения детергент/ФХ
Структурная организация агрегатов ФХ в присутствии различных концентраций дезоксихолата (ДОХ) изучалась методом 31Р-ЯМР-спектроскопии. Известно, что 31Р-ЯМР-спектр МЛВ из ФХ имеет асимметричную форму с анизотропией химического сдвига 50 м.д. При добавлении к дисперсии фосфолилида даже незначительных количеств детергента (молярное соотношение ДОХ/ФХ = 0,4) в спектре появляется изотропный сигнал, интенсивность которого растет по мере увеличения содержания ДОХ в системе. При достижении соотношения детергент/ФХ = 2 в спектре наблюдается один изотропный сигнал, свидетельствующий о полном переходе ФХ в смешанные детергент-фосфолипидные мицеллы. Появление в спектре изотропного сигнала при малых соотношениях ДОХ/ФХ можно объяснить образованием смешанных мицелл в процессе солюбилизации наружного слоя фосфолипидов ламеллярных агрегатов, при этом в растворе могут сосуществовать смешанные детергент-фосфолипидные мицеллы и ламеллярные агрегаты фосфолипида.
Изменение структуры агрегатов в системе ДОХ-ФХ-вода можно представить в виде соответствующей диаграммы, фрагмент которой приведен на рис.2 -1. Условия проведения исследования методом 31Р-ЯМР обозначены точками под номерами I-VI: при этом I - область существования ламеллярных структур, VI -область существования смешанных мицелл, а точки II-V - область сосуществования смешанных мицелл и ламеллярных агрегатов ФХ.
class3 Взаимодействие антибиотиков рифамицинового ряда с модельными
мембранами ; получение липосомальных форм рифампицина и рифабутина. class3
Физико-химические характеристики рифампицина и рифабутина в зависимости отрН среды (растворимость, рКа)
В предыдущей части изучалось взаимодействие высокомолекулярных соединений (белков) с модельными мембранами в различных агрегационных состояниях (МЛВ и ОБВ). Причем в одном случае (ингибиторы протеаз) взаимодействие не приводило к изменению фосфолипидного состава агрегатов, в то время как в другом (фосфолипазы) в процессе взаимодействия образовывались продукты метаболизма, изменяющие свойства мембран.
Данная часть данной работы посвящена изучению взаимодействия низкомолекулярных соединений- антибиотиков рифамицинового ряда рифампицина и рифабутина с модельными мембранами в тех же агрегационных состояниях (МЛВ и ОБВ). Как упоминалось в во 2-о й части литобзора, эти антибиотики эффективно подавляют жизнеспособность возбудителя туберкулеза M.tuber, В связи с этим планировалось в первую очередь изучить механизм взаимодействия обоих антибиотиков, которые в дальнейшем будут обозначаться как противотуберкулезные препараты (ПТП), с модельными мембранами при двух значениях рН: физиологическом (7,4) и слабокислом-6,4. Выбор этих значений рН обусловлен следующими соображениями. При попадании в организм человека M.tuber вызывает специфическое воспаление. Известно, что для начальной стадии воспалительного процесса характерно понижение рН межклеточной среды с 7,4 до 6,0 и ниже. Таким образом, сопоставление взаимодействия антибиотика с модельными мембранами пои этих значениях рН моделирует его поведение в очаге воспаления и в здоровой ткани. Кроме того, напомним, что микобактерии, проникшие в макрофаг, располагаются в фагосоме, рН которой меняется от 6,5 до 5,5.
Другой задачей на данном этапе работы явилась разработка стабильной липосомальной формы обоих антибиотиков на основе полученных результатов и оценка ее эффективности в отношении M.tuber, а также других видов микобактерии in vitro и in vivo.
Рифампицин применяется как противотуберкулезный препарат более тридцати лет, и накоплен значительный материал о его действии и свойствах. Напротив, рифабутин введен в медицинскую практику сравнительно недавно и о его физико-химических свойствах (растворимости, константах ионизации и коэффициенте распределения) в литературе представлена очень скудная информация [377]. К сожалению, практически нет данных о свойствах рифабутина при различных рН среды. Это важно с той точки зрения, что как уже отмечалось выше, воспалительный процесс, который присутствует при развитии туберкулеза, приводит к понижению рН ткани
В связи с этим целью работы на данном этапе явилось изучение влияния рН среды на различные физико-химические свойства антибиотиков и на их взаимодействие с модельными мембранами. Для количественной оценки такого взаимодействия ПТП планировалось определить коэффициент распределения этих соединений в системах липосомы/вода и октанол/вода.
Рифампицин и рифабутин являются полусинтетическими антибиотиками, производными рифамицина SV. Рифампицин представляет собой 3-(4 -метил-1 -пиперазинил-иминометил)-рифамицин SV, а рифабутин -4-дезоксо-3,4 - [2-спиро [ІЧ-изобутил-4-пиперидил] 2,5-дигидро-1Н-имидазол] - рифамицин S (С4є-H62-N4-O11) [1]. Их химические формулы приведены в литобзоре, а спектры поглощения нарис.5-1.
Похожие диссертации на Принципы создания новых форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений солюбилизацией липосомами
