Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ГРИБЫ РОДА TRICHODERMA - ПРОДУЦЕНТЫ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ РАСТЕНИЕВОДСТВА
1.1 Современные представления о классификации грибов рода Trichoderma
1.2 Биологические особенности грибов p.Trichoderma, обеспечивающие их активность в качестве биоконтрольных агентов
1.3 Взаимоотношения грибов p. Trichoderma с высшими растениями и почвенной микрофлорой
1.4 Биотехнологические проблемы создания препаратов на основе грибов p. Trichoderma для растениеводства
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 75
2.1 Штаммы микроорганизмов, питательные среды 75
1.1 Методы скрининга перспективных штаммов- продуцентов
1.2 Физиолого-биохимические и электронно-микроскопи- ческие исследования штамма Trichoderma asperellum
2.4 Микробиологические, микологические и химические методы анализа (почвенных образцов, семян)
2.5 Технология и рецептура экспериментальных образцов препаратов
2.6 Схемы вегетационных и полевых опытов с тест- культурами
2.7 Оценка действия микола на проростки пшеницы 93
2.8 Статистическая обработка данных 96
ГЛАВА 3. ВЫБОР И ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУЦЕНТА БИО ПРЕПАРАТА - ГИПЕРПАРАЗИТА ФИТОПАТОГЕН-НЫХ ГРИБОВ
3.1 Скрининг штаммов микромицетов, обладающих анти- грибной активностью
3.2 Физиолого-биохимические свойства активных штаммов p.Trichoderma
3.3 Фиторегуляторная активность штамма и обоснование оптимальных доз для защиты пшеницы от болезней
3.4 Первичная оценка биологической эффективности опытных образцов препарата
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ TRICHODERMAASPERELLUM, ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕЙ МАКСИМАЛЬНЫЙ ВЫХОД АКТИВНОЙ БИОМАССЫ ГРИБА
4.1 Разработка питательной среды, способствующей формированию разных микроморфологических форм T.asperellum (мицелий, хламидоспоры, фиалоконидии)
4.2 Оптимизация питательной среды (по источникам азота и углерода, отношению C:N и др.) и сроков культивирования, обеспечивающих максимальный выход биомассы
4.3 Изучение факторов, влияющих на формирование хла мидоспор и фиалоконидии при глубинном выращивании Т. asperellum
4.4 Факторы культивирования, влияющие на жизнеспособ-ность при хранении мицелия, конидий и хламидоспор гриба
4.5 Масштабирование процесса ферментации на ферментеpax емкостью 25, 60 и 100 дм3
4.6 Масштабирование процесса культивирования Т. Ill asperellum на базе Краснодарского экспериментального Центра биологической защиты растений по программе воспроизведения ОПР 00001927-15-140-2004
ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТОВАРНЫХ ФОРМ БИОПРЕПАРАТОВ, ПОЛУЧАЕМЫХ ГЛУБИННЫМ КУЛЬТИВИРОВАНИЕМ, ОБЕСЖЧИВАЮЩИХ СОХРАНЯЕМОСТЬ БИОМАССЫ АНТАГОНИСТА И ЕГО БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ
5.1 Выбор режимов концентрирования биомассы и метода ускоренного хранения экспериментальных образцов
5.2 Определение факторов, влияющих на сохранение биологической активности препаратов на основе грибного мицелия
5.3 Физико-химические свойства различных форм мицелиальных препаратов
5.4 Разработка товарной формы препарата для обработки 203 вегетирующих растений
5.5 Сохраняемость свойств биомассы в составе разработанной рецептуры при масштабировании процесса приготовления препаратов
ГЛАВА 6. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОБРАЗЦОВ МИКОЛА В ПОДАВЛЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БОЛЕЗНЕЙ ЗЕРНОВЫХ И ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР 6.1 Эффективность микола совместно с химическими фуницидами
6.2 Эффективность микола в подавлении фузариоза колоса шеницы
6.2.1 Тепличные эксперименты с яровой пшеницей 215
6.2.2 Эффективность биопрепаратов на посевах озимой пше- ницы в условиях Краснодарского края
6.3 Действие микола на комплекс возбудителей корневых гнилей пшеницы
6.4 Новое комбинированное биоудобрение, оценка его био логической и экологической эффективности
ГЛАВА 7. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ МИКОЛА НА РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ ПОЧВЫ СЕВЕРОКАВКАЗСКОГО РЕГИОНА
7.1 Зависимость рострегулирующего эффекта биопрепарата от типа почвы и ее увлажения
7.2 Динамика биоразнообразия микроскопических грибов в присутствии T.asperellum
ІЗ Влияние препарата на численность микробобиоты в по- левых экспериментах
ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ 282
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 284
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 288
ПРИЛОЖЕНИЯ 1-7 337
Введение к работе
Одним из перспективных продуцентов биопрепаратов являются почвенные грибы рода Trichoderma Pers.: Fr. Они способны подавлять развитие широкого спектра фитопатогенных грибов, синтезировать активные метаболиты, в качестве препаратов для растениеводства, медицины и ветеринарии (Backman, Rod-riges-Kabana, 1975; Harman et al,, 1981, Гаузе и др., 1983; Великанов, Сидорова, 1988; Егоров и др., 1999). Грибы рода Trichoderma обладают рострегулирую-щей активностью, способствуют увеличению поглощения растением микро- и макроэлементов, стимулируют развитие на корнях растений азотфиксирующих бактерий (Harman, 2004). Эти уникальные свойства грибов рода Trichoderma обусловили внимание к ним, как к продуцентам биопрепаратов для растениеводства. Исходя из биологических особенностей гриба, первые препараты для коммерческого использования готовили на твердом носителе - торфе, соломе, зерне, либо выращивали гриб на поверхности жидкой питательной среды (Ту-лемисова, 1990; Твердюков и др., 1993; Тюльпанова и др. 1997, Новикова, 2005). Предложены также способы, совмещающие поверхностное и погруженное культивирование (Громовых, 2002). Однако такие способы производства малотехнологичны, трудоемки, имеется опасность аллергизации для работающего персонала.
Попытки создания препаратов на основе биомассы гриба, полученной при глубинном (погруженном) культивировании, способных к длительному хранению до последнего времени не имели успеха. В качестве препарата практически повсеместно используется культуральная жидкость (Tabachnik, 1989; Apsite et al, 1989; San Martin et al., 1997). Запатентована только одна жидкая форма биофунгицида на основе мицелия грибов (Третьяков и др., 1995). Такой препарат сохранял активность до трех месяцев при температуре не выше +10°С, что явно недостаточно для успешного коммерческого применения. Проблема разработки методологических подходов к процессам глубинного культивирования мицелиальных грибов и создания рецептуры препаратов для обеспечения ста бильности и эффективности биомассы в процессе хранения и применения требовала серьезного научного исследования, которое проведено нами в период с 1991 по 2005 год.
Цель работы.
Выбор и изучение штамма микромицета, обладающего высокой специфической активностью в отношении фитопатогенных грибов, и создание на его основе промышленного биопрепарата.
Задачи исследований.
1. Провести скрининг коллекции штаммов микромицетов различного происхождения на наборе тест-культур фитопатогенных грибов с целью выбора штамма, обладающего наибольшей антагонистической активностью к широкому кругу фитопатогенов.
2. Изучить биохимические, физиологические и технологические особенности штамма, особенности конидиогенеза при глубинном культивировании для обоснования оптимальной технологии производства.
3. Разработать технологию глубинного культивирования и товарную форму препарата на основе выбранного штамма.
4. Провести испытания экспериментальных образцов и опытных партий препарата против болезней растений на естественном и искусственном инфекционном фонах.
5. Изучить экологические аспекты применения нового препарата: совместимость с фунгицидами, влияние на биоразнообразие микромицетов при предпосевной обработке семян пшеницы, зависимость эффективности препарата от типа почвы и ее увлажненности.
Научная новизна и теоретическая значимость.
Впервые достигнут успех в создании технологии глубинного культивирования мицелиальных грибов, позволяющий получать их биомассу в виде мицелия, хламидоспор и фиалоконидий на уровне коммерческой формы препарата.
Реализована инновационная методология ступенчатого скрининга перспективных штаммов-продуцентов антигрибных биопрепаратов с учетом физиоло гических особенностей микромицетов в условиях глубинного культивирования, требований к длительному хранению биопрепарата и особенностей технологий применения.
Практическая значимость работы.
Созданы новые, экологичные средства защиты растений и агрохимикаты: антигрибной биопрепарат микол (на основе гриба Т.asperellum Samuels, Lieck-felt et Nirenberg - Патент России, N 2170511, 2001) в двух товарных формах -для предпосевной обработки семян и для обработки растений, а также комбинированное удобрение (на основе биогумуса и Т. asperellum - Патент России N 97122342/13, 1997), обладающее почвоудобрительным, ростстимулирующим и фунгицидным действием.
Разработана нормативно-техническая документация для производства Микола (опытно-промышленный регламент, технические условия, инструкция по применению), получены санитарно-гигиенические заключения на штамм-продуцент и его товарную форму. Проведена оценка российского рынка антигрибных биопрепаратов, показана перспективность коммерческого использования микола в технологиях растениеводства.
Полевые испытания экспериментальных образцов и опытных партий в хозяйствах Краснодарского Края, Вологодской, Ленинградской, Тамбовской, Пензенской, Новгородской областях, в Крыму и Белоруссии показали высокую рострегулирующую и фунгицидную активность нового препарата.
Основные положения, выносимые на защиту.
V. Научно-обоснованная методология получения биопрепаратов на основе биомассы мицелиальных грибов, нарабатываемых при глубинном культивировании, сохраняющих биологическую активность в течение заданных сроков хранения, обеспечивающих их коммерческую значимость и возможность круглогодичной реализации.
2. Алгоритм управления условиями культивирования мицелиальных грибов для оптимального получения биомассы необходимого состава (мицелия, хла-мидоспор или фиалоконидий).
3. Две новые рецептурные формы препарата на основе биомассы гриба T.asperellum: микол С - для предпосевной обработки семян и микол В - для обработки растений, полученные глубинным культивированием и сохраняющие биологическую активность в течение шести месяцев.
4. Методология комплексной оценки фитокомпетентности биопрепаратов с учетом не только их антигрибной, но и фиторегуляторной активности для обоснования оптимальных дозы применения препаратов.
Апробация работы.
Результаты работы доложены на Всесоюзной конференции «Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений» (Велегож, 1989); Международной научно-практической конференции «Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней» (Одесса, Украина, 1994); XIII и XIV Международных Конгрессах по защите растений (Гаага, Нидерланды, 1995; Иерусалим, Израиль, 1999); Конференции «Биотех-95» (Днепропетровск, Украина, 1995); 1-й Всероссийской конференции токсикологов «Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии» (С.-Петербург, 1995); Первом и Втором Всероссийских съездах по защите растений (С.-Петербург, 1995, 2005); Симпозиуме «Экологические проблемы защиты растений современного сельского хозяйства» (Словакия, 1995); Рабочей встрече «Ростстимулирующие Rhizobacteria. Состояние и перспективы» (Саппоро, Япония, 1997); 32 Ежегодной встрече Общества Беспозвоночных (Ирвин, Калифорния, США, 1999); Юбилейной научной конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии» (Оболенск, 1999); Юбилейной научной конференции «Современные исследования в биологической защите растений» (Харбин, Китай, 2000); Международных научно-практических конференциях «Биологизация защиты растений: состояние и перспективы» (Краснодар, 2000, 2004); 1-ом съезде микологов России (Москва, 2002); 2-ой, 3-ей и 4-ой Международных Конференциях «Биотехнология и бизнес» (Москва, 2002, 2003, 2004); I и II Международных Конгрессах «Биотехнология-состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003); Международ ном Симпозиуме «Интегрированные системы защиты садов и виноградников (Венгрия, 2002); 1-ой Международной конференции «Дождевые черви и плодородие почв» (Владимир, 2002); 8-м Международном Конгрессе по фитопатологии (Крайсчерч, Новая Зеландия, 2003); Международном совещании «Современные проблемы биологической защиты леса и сельскохозяйственных культур» (Звенигород, 2003); Международной конференции по интеграции науки и технологии в сельское хозяйство (Бангкок, 2004); Восьмой Международной рабочей встрече по Trichoderma и Gliocladium (Ханжоу, Китай, 2004); 2-ом Международном Симпозиуме по фузариозу колоса (Орландо, Флорида, 2004); Третьем съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2005).
Публикация результатов исследования.
Основные материалы диссертации опубликованы в журналах «Микология и Фитопатология», «Агрохимия», «Прикладная биохимия и микробиология», в «Российском химическом журнале», «Агро XXI», «Биотехнология», материалах российских и международных конгрессов, симпозиумах и рабочих встреч. По теме диссертации опубликовано 63 печатных работы, 10 из которых в рецензируемых изданиях (3 в печати). Получено 3 авторских свидетельства на изобретения и 3 патента РФ. За разработку и организацию промышленного производства реагентов для синтеза генетических структур в 1987 году присуждена Премия Совета министров СССР.
Структура и объем диссертации.
Работа изложена на 370 страницах, содержит 87 рисунков и 106 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав экспериментального материала, содержащих описание материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 618 работ отечественных и зарубежных авторов, а также 7 приложений.
Место проведения работы.
Основная часть НИР выполнена в отделе разработки микробиологических средств защиты растений Государственного Научного Центра прикладной микробиологии (ГНЦ ПМ, п.Оболенск, Московской обл.). Экспериментальные результаты получены автором лично, а также совместно с коллегами из ГНЦ ПМ и других институтов. Соискателю принадлежит разработка программы исследования, схемы основных экспериментов, теоретическое обобщение полученных результатов.
Благодарности.
Автор выражает искреннюю благодарность академику РАСХН Левитину М.М. за внимание и ценные рекомендации при обобщении основных результатов работы. Глубокую признательность коллегам и сотрудникам ГНЦ ПМ, принимавшим участие в работе: к.х.н. С.К. Жиглецовой, к.м.н. В.В. Дербышеву, Н.И. Косаревой, Е.В. Быстровой, СП. Красновой, к.б.н. Н.И. Киселевой, С.Г. Бесаевой, В.А. к.б.н. Говоруновой, А.В. Стартову. Моя искренняя благодарность к.б.н. А.В. Александровой (кафедра микологии и альгологии МГУ) за высокопрофессиональные консультации и неоценимую помощь в таксономических исследованиях.
Сотрудникам ВНИИ БЗР и КНИИХС им. Лукьяненко (г. Краснодар) за проведение полевых испытаний опытных образцов и партий препарата микол. Сотрудникам ВНИИ садоводства им. И.В.Мичурина, испытавшим микол против болезней садовой земляники, заведующей биолабораторией Вологодской СТАЗР Н.Н. Труканавичене за многолетнее плодотворное сотрудничество по испытанию препарата на ячмене и льне, к.б.н. Ю.И. Гниненко (Московский государственный университет леса) за оценку фунгицидной и ростстимулирую-щей активности препарата на хвойных породах в лабораторных и вегетационных опытах.
Особая благодарность В.А. Ярошенко (ГУ «Краснодарский экспериментальный центр биологической защиты растений») и его сотрудникам в течение многих лет проводивших испытания препарата в хозяйствах Краснодарского края, а также участвовавших в масштабировании технологии производства препарата. Профессорам Боровику Р.В. (НИЦ ТБП, г. Серпухов) и Волкову В.Я. (ГНЦ ПМ, п.Оболенск) благодарна за творческий импульс, способствовавший начать и завершить многолетнее исследование.
Моих зарубежных коллег проф. К. Сойтонга (Королевский Технологический Институт, Бангкок, Таиланд), проф. Д. Шислера (Институт научного обслуживания сельского хозяйства, Пеория, США) за сотрудничество в области биологической защиты растений.
Благодарю за поддержку и помощь моих друзей и родных, помогавших на всех этапах выполнения работы.
