Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Взаимодействие alu ретроэлментов и генома человека. обзор литературы 7
1.1 Структура и амплификация АЫ-ретроэлементов 7
1.2 Классификация А1и-ретроэлементов 10
1.3 Взаимодействие Alu-ретроэлементов и генома человека 13
1.3.1 Транскрипция Alu-ретроэлементов с собственного промотора способна влиять на транскрипцию близлежащих генов 13
1.3.2 Образование Alu-элементами вторичных структур меняет уровень транскрипции генов человека 14
1.3.3 Последовательность А1и способна определять структуру хроматина 14
1.3.4 Транспозиционная активность Alu-повторов - источник инсерционного мутагенеза в геноме человека 14
1.3.5 Последовательность Alu содержит сайты связывания целого ряда регуляторов транскрипции 17
1.3.6 Интеграции Alu в интроны способны приводить к нарушению нормального сплайсинга гена 20
1.3.7 Длинные поли(Т) последовательности интронных интеграции Alu вызывают образование укороченного транскрипта 22
1.3.8 Метилирование CpG динуклеотидов в составе А1и-последовательности влияет на экспрессию как отдельных генов, так и обуславливает полногеномный импринтинг 23
1.3.9 Редактирование РНК Alu-повторов 24
1.3.10 Транскрипты Alu-элементов способны оказывать влияние на трансляцию белков 25
1.3.11 Рекомбинация между Alu-ретротранспозонами может являться причиной локальных и обширных перестроек в геноме человека 26
Глава 2. Экспериментальная часть 31
2.1 Материалы 31
2.2 Методы 40
Глава 3. Результаты и обсуждения 51
3.1 Создание представительного набора полиморфных Аіи-маркеров, расположенных в интронах генов 51
3.1.1 Характеристика экспериментально идентифицированных Alu полиморфизмов 51
3.1.2 Создание интернет базы данных полиморфныхретроэлементов 53
3.2 Определение аллельного состояния клеточных линий по полиморфным штеграциям Alu 62
3.3 Сравнение относительного количества несплайсированных транскриптов аллелей генов, различающихся интронной инсерцией Alu 65
3.4 Анализ возможных причин снижения уровня транскрипта А1и-содержащего аллеля генов человека 71
3.4.1 Сравнительно-структурный анализ нуклеотидных последовательностей Alu элементов, проявляющих различную степень влияния на уровень экспрессии в разных клеточных линиях 72
3.4.2 Анализ связывания исследуемых локусов с ядерными белками 72
3.4.3 Оценка размеров интронного Alu элемента в составе гякДНК 76
Заключение 80
Выводы 81
Список литературы 82
Благодарности 97
- Взаимодействие Alu-ретроэлементов и генома человека
- Последовательность Alu содержит сайты связывания целого ряда регуляторов транскрипции
- Определение аллельного состояния клеточных линий по полиморфным штеграциям Alu
- Анализ возможных причин снижения уровня транскрипта А1и-содержащего аллеля генов человека
Введение к работе
Структура и амплификация АЫ-ретроэлементов 7
Классификация А1и-ретроэлементов 10
Взаимодействие Alu-ретроэлементов и генома человека 13
Транскрипция Alu-ретроэлементов с собственного промотора способна влиять на транскрипцию близлежащих генов 13
Образование Alu-элементами вторичных структур меняет уровень транскрипции генов человека 14
Последовательность А1и способна определять структуру хроматина 14
Транспозиционная активность Alu-повторов - источник инсерционного мутагенеза в геноме человека 14
Последовательность Alu содержит сайты связывания целого ряда регуляторов транскрипции 17
Интеграции Alu в интроны способны приводить к нарушению нормального сплайсинга гена 20
Длинные поли(Т) последовательности интронных интеграции Alu вызывают образование укороченного транскрипта 22
Метилирование CpG динуклеотидов в составе А1и-последовательности влияет на экспрессию как отдельных генов, так и обуславливает полногеномный импринтинг 23
Редактирование РНК Alu-повторов 24
Транскрипты Alu-элементов способны оказывать влияние на трансляцию белков 25
Рекомбинация между Alu-ретротранспозонами может являться причиной локальных и обширных перестроек в геноме человека 26
Взаимодействие Alu-ретроэлементов и генома человека
Несмотря на большое количество Alu-последовательностей в геноме, транскрипты Alu, образующиеся с собственного промотора РНК полимеразы III, в здоровых тканях встречаются в очень небольшом количестве. Это может обуславливаться несколькими факторами. Во-первых, полноразмерная Alu-PHK способна быстро деградировать до коротких фрагментов [20], во-вторых, может происходить разрушение транскрипта с 3 -конца из-за неспособности La белка связываться с нарушенным терминатором РНК-полимеразы III. Кроме того, метилирование CpG-регионов рядом или внутри Alu-повтора подавляет экспрессию, так как транскрипционные факторы не способны связываться с метилированными элементами промотора [18, 21]. Также было показано, что Alu-нуклеосомный комплекс, наблюдаемый как in vitro, так и in vivo, делает Alu-последовательность недоступной для транскрипции [22-24]. Другим объяснением может служить и то, что для эффективной транскрипции необходим дополнительный регуляторный элемент ДНК, который отсутствует в окружении большинства Alu [25,26]. Было отмечено, что экспрессия Alu РНК увеличивается в ответ на клеточный стресс, заражение вирусом или ингибирование трансляции [15, 27]. Хотя Alu элементы - большое мультигенное семейство, экспрессия индивидуальных интеграции Alu в ответ на клеточный стресс различается в зависимости от геномного окружения [13]. Активность промотора Alu оказывает влияние и на экспрессию клеточных генов. Существуют примеры, когда собственная транскрипция Alu подавляет транскрипцию близлежащих генов по механизму транскрипционной интерференции, как в случае глобиновых генов.
Транскрипционная интерференция является результатом активности внутреннего промотора РНК полимеразы III [28] и связана с тем, что при элонгации с выше лежащего промотора транскрипционные факторы не могут взаимодействовать с последующим промотором и транскрипция с него снижается [29]. Взаимодействие последовательности Alu повтора с геномом может происходить и через образование вторичных структур ДНК. Примером могут служить Alu элементы, участвующие в регуляции гена CD8a. В последнем интроне CD8a расположена интеграция Alu, которая является частью энхансера этого гена. В тоже время, в гене CD8a был обнаружен элемент, ингибирующий активность энхансера, и представляющий собой половину Alu последовательности, способную образовывать крестообразную вторичную структуру с энхансерной последовательностью Alu и, таким образом, ингибировать функционирование энхансера. Существование такой структуры было прямо показано при транзиентной трансфекции, и имеются подтверждения ее существованию in vivo [ЗО]. Alu-ретроэлементы способны оказывать влияние на функционирование генома через опосредованное интеграцией Alu изменение структуры хроматина. Так, последовательность Alu оказалась способна к позиционированию нуклеосом в in vitro экспериментах [22]. In vivo показано, что Alu-элементы могут организовывать ротационное позиционирование нуклеосом и нуклеосомоподобных частиц и формировать позиционирование нуклеосом соседних участков. Так как организация хроматина способна непосредственно влиять на экспрессию генов, то это еще один немаловажный путь взаимодействия Alu-ретроэлементов и генома человека [23]. Ретропозиционная активность ретроэлементов является значительным фактором инсерционного мутагенеза в геноме человека. Считается, что новая интеграция Alu происходит в геноме каждого из 200 новорожденных [31]. Alu элементы способны встраиваться в любом положении относительно генов человека: как в межгенные пространства, так и в регуляторные последовательности генов, нетранслируемые участки и даже в экзоны.
Интеграции Alu, расположенные достаточно далеко от начала гена, в большинстве случаев не оказывают влияния на его экспрессию, тогда как инсерции, расположенные рядом с регуляторными последовательностями генов или в интроны, могут как механически разрушать необходимые для транскрипции и процессинга элементы гена, так и привносить собственные регуляторные участки, например, промотор РНК полимеразы HI, CpG островки, сайты связывания рецепторов гормонов, вносить собственные сайты и энхансеры сплайсинга, сигнал полиаденилирования и др. [32-34]. В экзонах генов человека обнаружено небольшое число интеграции Alu, главным образом потому, что такое их положение полностью нарушает функции гена и подвергается действию негативного отбора. Однако, известен ряд исключений, когда Alu-элементы являются частью С-конца транслируемого продукта [35, 36]. Вероятно, подобные инсерции Alu-элементов не нарушают активность белка. Существуют механизмы, специфически подавляющие транспозицию ретроэлементов, такие метилирование CpG динуклеотидов последовательности Alu и активность семейства генов АРОВЕСЗ, чьи продукты подавляют ретротранспозицию Alu и LINE-1 элементов [37]. Часть интеграции, нарушающих функции генов, способна вызывать заболевания человека. Как правило, такие интеграции происходят в экзоне или в непосредственной близости от экзона. Инактивация белка может происходить по разным механизмам: привнесение стоп-кодона, приводящее к преждевременному обрыву трансляции и синтезу укороченного не функционального продукта, сдвиг рамки считывания, нарушение сплайсинга, приводящее, как правило, к пропуску экзонов, или вызванные ретротранспозицией геномные делеции [14, 38]. В приведенной ниже таблице перечислены случаи генетических заболеваний, связанных со встраиванием Alu-ретроэлементов. Не во всех случаях инсерция Alu является причиной возникновения заболевания, но присутствие элемента значительно увеличивает вероятность его возникновения, как в случае АСЕ [39]. При анализе Human Genetic Mutation Database, содержащей 14374 охарактеризованных мутации человека, оказалось, что около 0,1% генетических заболеваний вызваны интеграцией Alu [40].
Последовательность Alu содержит сайты связывания целого ряда регуляторов транскрипции
Одним из механизмов возможного изменения активности генов при встраивании последовательности Alu является привнесение участков связывания регуляторных факторов, способных изменять транскрипцию расположенных рядом генов.
Последовательность Alu-элемента содержит сайты связывание целого ряда белковых факторов [32-34, 79-85]. Распределение сайтов узнавания регуляторных факторов не одинаково для различных подсемейств и индивидуальных копий Alu. Большинство участков связьшания регуляторных белков, оказывающих влияние на транскрипцию РНК полимеразы II, расположены в промоторе Alu-элемента между А и В боксами. Некоторые сайты связывания образовались благодаря спонтанным мутациям, произошедшим после встраивания элемента, в том числе дезаминированию метилированных CpG динуклеотидов. Таким образом, больше всего регуляторных элементов в последовательности ретроэлементов, принадлежащих старому семейству AluS, а меньше всего у представителей молодого AluY семейства. Например, сайты для API, ERE, nCARE белков присутствуют у членов старого и среднего семейства Alu, но редко встречаются у представителей молодых семейств. Обратная ситуация наблюдается для белка СЕТР, сайты связывания которого присутствуют только в молодых Alu. RARE и TRE сайты присутствуют в консенсусной последовательности всех подсемейств, тогда как LXR специфичен только для семейства AluS.
В представленных ниже таблицах 2 и 3 приведена последовательность и расположение сайтов связывания регуляторных факторов в различных семействах Alu.
Связывание с последовательностью Alu-ретроэлемента регуляторных белков широко распространено в геноме человека. Около 14000 генов различных функциональных групп содержит в промоторном регионе хотя бы одну копию Alu, и для ряда интеграции показано связывание транскрипционных факторов in vitro и in vivo [86]. Для последовательностей, узнаваемых рецепторами ретиноевой кислоты (RAR), 90% всех присутствующих в геноме человека DR2 мотивов и 50% DR4, расположены в Alu-повторах. Причем часть из них расположена в непосредственной близости от генов, регулируемых ретиноевой кислотой, и показывает связывание с RAR in vivo [87]. Степень влияния интегрировавших регуляторных последовательностей на транскрипцию близлежащих генов, зависит от целого ряда факторов: их положения относительно гена, взаимного расположения ретроэлементов, тканевой принадлежности и последовательности данной копии Alu элемента.
Интеграция Alu во многих случаях вызывает изменение экспрессии соответствующего гена. Зачастую, при встраивании в составе последовательности Alu сайтов связывания регуляторов транскрипции, экспрессия гена усиливается. Так, одним из примеров положительного влияния привнесенных Alu участков связывания транскрипционных регуляторов на активность близлежащего гена может служить Alu элемент, предшествующий гену миелопероксидазы (МРО). Этот Alu повтор содержит 4 гексамерных мотива, представляющие собой участки узнавания ядерных рецепторов гормонов. Эксперименты по торможению в геле и транзиентной экспрессии показали, что эти последовательности выступают как сайты связывания рецепторов ретиноевой кислоты и тиреоидных гормонов и активируют in vivo репортерный ген [32]. Однако первый из этих повторов показал связывание не с рецептором гормона, а с транскрипционным фактором SP1. При транзиентной экспрессии такое связывание активирует экспрессию в 25 раз. По-видимому, активация происходит и в организме человека и может приводить к развитию заболевания. На это указывает и то, что большинство случаев острой миелоидной лейкемии ассоциировано с гомозиготностью по наличию сайта связывания SP1 [84]. Однако в большинстве случаев Alu повторы ассоциированы с сайленсингом близлежащих генов, например таких как кератин 18 [88], эритропоэтин [89], глобиновых [90], цепи Fc Т-клеточного рецептора [91] и других. Большинство исследователей связывают ингибирующую активность Alu именно с взаимодействием со специфическими белковыми факторами.
Можно отметить тенденцию, что в недавних интеграциях Alu сохраняются последовательности, необходимые для транспозиции и рекомбинации, а старые семейства Alu несут множество сайтов связывание регуляторных факторов РНК полимеразы И. Это может говорить в пользу гипотезы эволюции транспозонов Кидвелла [92], согласно которой, каждый класс элементов проходит три стадии: возникновение и амплификацию в геноме, затем накопление мутаций и зрелость, постепенное старение и угасание. По-видимому, в случае Alu, при старении элементов, организм хозяина приспосабливается к интеграциям, и они постепенно включаются в хозяйскую систему регуляции активности генов и становятся ее неотъемлемой частью [93].
Определение аллельного состояния клеточных линий по полиморфным штеграциям Alu
По результатам выполненного анализа геномного положения и функциональных характеристик были отобраны 32 локуса, содержащие полиморфные интеграции Alu в интронах различных генов человека. Для каждого локуса были подобраны и синтезированы пары уникальных геномных праймеров, фланкирующие сайт интеграции Alu. С использованием созданного набора пар праймеров (см. главу Материалы и методы, таблица 7) было определено аллельное состояние панели линий клеток человека по присутствию/отсутствию Alu во всех исследуемых локусах. Наличие Alu повтора в ДНК клеточной линии определяли методом локус-специфической ПЦР с фланкирующими инсерцию геномными праймерами. Присутствие А1и+ и Alu0 аллеля устанавливали по длине получаемого ПЦР продукта. Схема эксперимента представлена на рисунке 8 (1). Пример электрофореза в агарозном геле ПЦР продуктов с праймерами для локуса MLS63 показан на рисунке 8(2).
Результаты типирования всех 11 -ти клеточных линий суммированы в таблице 14. Часть проанализированных локусов не показала полиморфизма в исследованных линиях клеток.
Каждая исследованная клеточная линия характеризуется уникальным распределением Alu-содержащих и Alu-несодержащих аллелей (таблица 14). Созданный нами набор полиморфных Alu маркеров может использоваться для генотипирования клеточных линий с различными фенотипами и различного тканевого происхождения.
Из использованных в анализе Alu инсерций, для 21 был обнаружен полиморфизм в используемой панели клеточных линий человека. Принимая, что диплоидная клетка может иметь 3 генотипа (+/+, + /- или - / -) и что все эти генотипы равновероятны, мы получим, что для 21 диморфного локуса существует 1010 (1/3"21) уникальных комбинаций генотипов. Таким образом, вероятность того, что две различные клеточных линии будут иметь одинаковое распределение генотипов по всех локусам, крайне мала, и предложенный набор маркеров достаточно информативен, чтобы эффективно различать индивидуальные клеточные линии. Большинство клеточных линий человека, особенно линий опухолевого происхождения, в течение культивации подвержены разного рода генетическим перестройкам, что влияет на биохимию, регуляцию и другие характерные черты. Таким образом, необходимо периодически подтверждать генетическую идентичность образцов клеточной линии каким-либо стандартным тестом, и предложенный метод на основе использования полиморфных интеграции Alu в качестве маркеров может успешно применяться для мониторинга генотипа клеточных линий.
Для исследования влияния интеграции недавних инсерций AluY на экспрессию генов человека определяли относительное количество содержащих и не содержащих интеграцию Alu транскриптов исследуемых генов. Уровень транскрипции Alu-содержащего аллеля (А1и+) и Alu-несодержащего аллеля (Alu0) определяли в клеточных линиях, гетерозиготных в используемых нами на локусах. При этом как Alu+ аллель, так и Alu аллель будут находиться в одинаковых условиях и одинаковом генном окружении, что позволяет утверждать, что возможные различия в экспрессии аллелей обусловлены именно интеграцией Alu ретроэлемента. Для анализа использовали клеточные линии различного происхождения (эпителиальные (Тега-1, Тега-2, НЕК293, HeLa, НТ1080, HepG2), лимфобластоидные (HL60, Jurkat), фибробластоидные (RMS-13, OsA-CL), нейробластоидная (NGP-127)) и гены с различными функциями и тканеспецифичностью, что дает возможность экстраполировать полученные результаты.
Анализ возможных причин снижения уровня транскрипта А1и-содержащего аллеля генов человека
Другой вероятной причиной наблюдаемых различий в уровне транскрипции аллелей может являться привнесение или, наоборот, разрушение интеграцией Alu существующих сайтов связывания ядерных белков. Для исследования взаимодействия белковых факторов с Alu-содержащими и с Alu-несодержащими ДНК фрагментами были отобраны те локусы и клеточные линии, где различия в транскрипции аллелей были наиболее значимыми или была выявлена тканеспецифичность влияния инсерций Alu.
Исследование взаимодействия ДНК последовательностей с ядерными белками проводили методом торможения в геле (MSA - Mobility Shift Assay). Принцип метода основан на разнице в электрофоретических подвижностях фрагмента ДНК и комплекса ДНК с белком. Введение радиоактивной метки в исследуемые ДНК фрагменты проводилось таким образом, что удельная радиоактивность Alu0 и А1и+ ПЦР продуктов была одинаковой, что позволяло сравнивать интенсивность связывания с белковыми факторами для обоих фрагментов. Схема эксперимента и примеры электрофореграмм ПЦР продуктов для локуса MLS26 на матрице клеточных линий Jurkat и НТ1080 приведены на рисунке 11.
В ходе выполнения эксперимента были получены ядерные экстракты белков из клеточных линий Jurkat, HeLa, НТ1080 и OsA-CL и подтверждена их активность связыванием с контрольным фрагментом ДНК. Связывание неспецифических белков предотвращалось добавлением избытка синтетических полинуклеотидов типа poly(dlC). Комплексы фрагментов ДНК со связавшимися белками и свободные ДНК фрагменты разделялись в полиакриламидном геле, после чего результаты визуализировались получением радиоавтографов. Примеры радиоавтографов приведены на рисунках 12-13.
Методом торможения в геле было показано образование ДНК-белковых комплексов как Alu-содержащими, так и Alu-несодержащими ДНК-фрагментами, причем профили связывания белковых факторов для Alu-содержащего и Alu-несодержащего фрагментов различаются в ряде случаев. По результатам анализа полученных радиоавтографов была определена относительная подвижность (Rf) выявленных ДНК-белковых комплексов. Значения Л/приведены в таблице 17.
Можно отметить, что на радиоавтографах наблюдаются ДНК-белковые комплексы, характерные только для А1и+ фрагментов ДНК, например, с Rf= 0,41 для линии клеток НТ1080, и с /?/= 0,39 для HeLa. Высокомолекулярный комплекс с Rf порядка 0,07 образуется ядерными экстрактами нескольких линий клеток. Образование подобных комплексов, возможно, обусловлено взаимодействием специфических Alu-связывающих белков или их комплексов с последовательностью Alu. Связывание белковых факторов с Alu элементом может являться одной из причин снижения количества гяРНК А1и+ аллеля гена. Например, связывание регуляторов транскрипции способно напрямую изменять активность транскрипционного комплекса РНК-полимеразы II, а связывание белков, взаимодействующих с последовательностью Alu, может создавать механическое препятствие для продвижения транскрипционного комплекса, что, возможно, приводит к его замедлению вплоть до полного прекращения транскрипции и образования укороченного транскрипта. С другой стороны, внедрение Alu способно нарушать существующие сайты связывания специфических белков, что также может негативно сказаться на уровне Alu-содержащего транскрипта. Можно видеть, что в ряде случаев белок образует комплекс с Alu-несодержащим фрагментом, тогда как с Alu-содержащим фрагментом комплекс с тем же значением Rf не образуется. Например, Rf= 0,16 и Rf= 0,57 для фрагмента ДНК MLS26 в линии клеток НТ1080.
Также наблюдались комплексы, характерные только для одного локуса, независимо от присутствия Alu, такие как Rf= 0,8 для фрагмента ДНК cl-63 и Rf= 0,14 в случае MLS63. Вероятно, в этом случае связывание белка происходит со специфической последовательностью, расположенной во фланкирующей Alu ДНК и присутствующей в обеих аллелях гена.
Возможной причиной снижения количества Alu-содержащего транскрипта может быть преждевременный обрыв гяРНК на стадии транскрипции. Прерывание транскрипции РНК полимеразой II может происходить по нескольким причинам: прекращение транскрипции на АТ-богатых участках Alu элемента, остановка транскрипционного комплекса на участках последовательности Alu, образующих комплекс с белковыми факторами или входящими в состав вторичных структур. Для проверки этой гипотезы были выбраны локусы и клетки, для которых транскрипция Alu-несодержащего аллеля детектировалась на достаточно высоком уровне, a Alu-содержащий транскрипт не был обнаружен. Предполагаемую точку обрыва транскрипции определяли по результатам серии ОТ-ПЦР, проводимой с уникальным геномным и каждым из набора AluY-специфических праймеров (глава Материалы и методы, таблица 9). Схема эксперимента приведена на рисунке 14.
