Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Синтетические олигодезоксирибонуклеотиды и искусственные генетические структуры 7
3. Хишко-ферментативный синтез модельного гена кальцитонина человека 44
4. Материалы и методы 64
Приложение 76
Выводы 102
- Синтетические олигодезоксирибонуклеотиды и искусственные генетические структуры
- Хишко-ферментативный синтез модельного гена кальцитонина человека
- Материалы и методы
Введение к работе
Достижения последнего десятилетия в молекулярной биологии и биоорганической химии служат наглядным примером плодотворного сотрудничества исследователей, работающих в этих областях современного естествознания. Все более широкое использование в разнообразных биологических исследованиях находят синтетические олигодезок-сирибонуклеотиды. В свою очередь, успехи кооперации химии и биологии стимулируют работы в области направленного химического синтеза фрагментов ДНК /1-6/.
Развитие техники рекомбинантных ДНК позволило конструировать генетические системы, способные функционировать в клетках прокариот и эукариот. Эти возможности используют для получения организмов, обладающих новыми свойствами, например, штаммов кишечной палочки, синтезирующих эукариотические белки. Более широко одна из основных задач генетической инженерии состоит в создании новой технологии, так называемой, биотехнологии производства полезных белков из микроорганизмов.
Среди белковых продуктов,-представляющих большой интерес, следует выделить пептидные и полипептидные гормоны. До недавнего времени их выделяли, как правило, из органов животных, если гормон не обладал выраженной видовой специфичностью. Сравнительно короткие пептидные гормоны получают также химическим синтезом. Однако такой способ малорентабелен для молекул, состоящих уже из нескольких десятков звеньев, главным образом, из-за трудностей очистки от примесей. Наиболее перспективным оказалось использование клеток микроорганизмов для производства продуктов белковой природы путем введения в их геном и экспрессии чужеродных генов. Существенный вклад в решение этой задачи вносит направленный химический синтез фрагментов ДНК. Успехи в развитии синтеза олигодезоксирибо-нуклеотидов позволили получить гены ряда пептидов и белков. В ре --6 зультате экспрессии этих генов получены соматостатин, инсулин, интерферон и др. /2,136,137,139,153/.
К числу важнейших пептидных гормонов принадлежит калыщтонин. Вместе с паратироидным гордоном и витамином Д он осуществляет регуляцию метаболизма кальция и неорганического фосфата в организме. Основная физиологическая функция кальцитонина заключается в предотвращении гиперкальцемии, потенциально возможной при постзшлении в организм кальция, ингибировании скелетной ресорбции и стимуляции переноса кальция из крови в костную ткань /I69,186/.
Цель данной диссертационной работы - химико-ферментативный синтез модельного гена кальцитонина человека. Настоящая работа составляет часть исследований, проводимых в отделе генетической инженерии МБ АН СССР, по изучению экспрессии генов пептидных гормонов в про-и эукариотических системах.
Синтетические олигодезоксирибонуклеотиды и искусственные генетические структуры
Современное состояние нуклеотидного синтеза, его успехи и проблемы широко представлены в обзорах Отсуки, Итакуры, Шабаровой и др. /1-5/. В данном обзоре предпринята попытка обобщить наиболее интересные результаты работ по синтезу олигодезоксирибонуклеотидов за последние 3-4 года, которые, по нашему мнению, отражают общие тенденции его развития. Основное внимание будет уделено следующим этапам синтеза: а) получению защищенных нуклеозидов; б) получению мононуклеотидов; в) синтезу олигонуклеотидов. Второй раздел обзора посвящен использованию синтетических фрагментов ДНК в конструировании искусственных генетических структур. Эта область применения синтетических олигонуклеотидов, являясь одной из наиболее важных, охватывает широкий круг возможных вариантов их приложения в биологических исследованиях. Подробные сведения о разнообразном использовании синтетических олигощгклеотидов в молекулярной биологии и генетической инженерии имеются в обзорах /2,3, 6-8/. В настоящее время наиболее распространенным методом синтеза олигонуклеотидов является фосфотриэфирный /9,10/. На рис.1 представлены основные этапы получения мононуклеотидов (3) и (4) - ключевых соединений для этого метода синтеза. Мононуклеотиды (3) и (4) служат исходными соединениями в фосфатном и фосфитном вариантах триэфирного метода синтеза /1,11,12/. Направленный химический синтез фрагментов ДНК проводят в растворе и/или на полимерном носителе. Нуклеотиды (3) применяются в обоих случаях, тогда как нуклеотиды (4) используют, главным образом, в синтезе на полимерных носителях. I. Получение N - 0-защищенных нуклеозидов Непосредственными предшественниками соединений (3) и (4) явля-ются N-0-защищенные нуклеозиды (2). Для защиты первичного гидроксила рибозного остатка нуклеозидов используют, преимущественно, моно- и диметокситритильные грушш Основное внимание в этой главе уделено проблеме совершенствова-шя способов защиты функциональных групп оснований нуклеозидов.
Общепринятыми защитами для экзопдклических аминогрутш служат бен-зоильная для JA и Ю и изобутирильная для dG . Проведенные недавно ки-іетические исследования реакций N-ацилирования и деапилирования іуклеозидов показали, что бензоильная и изобутирильная группы явля-зтся оптимальными защитами, хотя первоначальный их выбор произошел эмпирически /17/. Способ получения N-ацилированных нуклеозидов, разработанный Ко-раной, до недавнего времени оставался практически единственно надеж-шм вариантом подобного рода превращений /18/. Он состоит в исчерпы-зающем ацилировании нуклеозида (см. рис.3 на примере 2-дезоксиадено-зина) и избирательном удалении N-защитных групп под действием 1н здкого натра. Усилия многих исследователей были направлены на разработку методов селективного N -ацилирования нуклеозидов. Такие попытки увенчались успехом только в случае dC, например, при использовании в качестве адшшрущего агента пентафторфенилбензоата /19/. Очевидные недостатки поэтапного введения N-ацильных защит (метод Кораны), равно как и отсутствие универсального селективного метода защиты для всех оснований, стимулировали поиск принципиально новых решений данной проблемы. В 1982 г. Ти с сотр. предложил эффективный и изящный способ N -ацилирования гетероциклических оснований нуклеозидов (рис.4) с использованием "временных" триметилсилильных защит /20/. та (60-70$) при получении М2-изобутирил-2-дезоксигуанозина. Однако МакГи и сотр. /21/, пршденив в качестве силилирущего реагента гексаметилдисилазан, а в качестве растворителя - диметилформамид, увеличили выход продукта до 94$. В свою очередь, нам удалось модифицировать метод Ти, что привело к более стабильным и высоким выходам целевых продуктов (см. "Обсуждение результатов", стр.48)» В последние 2-3 года проведено много работ по поиску новых М -защитных групп. В большинстве случаев сущность таких исследований сводилась к применению уже известных защит из других областей био-органической химии. Например, для защиты A, JC и dG были опробованы 2,2,2-трихлор-трет-бутилоксикарбонильная (ТЬос) и бензилокси-карбонильная (Cbz) группы, применяемые в пептидной химии /22,23/. Однако использование ТЬос и СЬг защит не давало никаких преимуществ по сравнению с традиционными способами и отнюдь не упрощало метод синтеза. Вследствие этого указанные защиты не получили дальнейшего распространения. В таблице I представлен ряд других предложенных в последнее время защитных групп для аминофункций гетероциклических оснований нуклеозидов. Важно и то, что эти защиты удовлетворяют требованиям нук-леотидного синтеза: легко и количественно вводятся, достаточно устойчивы в процессе синтеза и удаляются в мягких условиях. Многие из приведенных выше защитных групп не нашли еще широкого применения. Однако использование их в нуклеотидном синтезе составляет тот ценный экспериментальный материал, на основе которого возможен в будущем выбор оптимальных вариантов. На необходимость защиты не только амино-, но и карбонильных функций гетероциклических оснований обратили внимание после того, как удалось установить природу ряда побочных продуктов, образующихся в процессе олигонуклеотидного синтеза /30-34/. Пример с тимиди-ном наиболее показателен. Этот нуклеозид всегда считался устойчивым к модификациям практически на всех этапах нуклеотидного синтеза. Тем не менее, Риз с сотр. /32/ обнаружили, что в присутствии конденсирующего реагента К-мезитилен-2-сульфонил)-триазола ( MST) тимидин превращается в соединение (18), которое под действием аммиака дает 5-МЄТИЛ-2-ДЄЗОКСИЦИТИДИН (19) (рис.6). защитные группы Еис.7 Некоторые модификации могут быть устранены обработкой анионом р-нитробензальдоксима /35,36/. Другие протекают необратимо, что приводит к нарушению первичной структуры синтезируемого олигонук-леотида. Последнее обстоятельство, в отдельных случаях, оправдывает затраты усилий на введение дополнительных О-защитных групп. Примеры таких защитных групп приведены в таблице 2.
Хишко-ферментативный синтез модельного гена кальцитонина человека
Кальцитонин принадлежит к числу важнейших пептидных гордонов, регулирующих обмен кальция в организме /169/. В 1968 г. из тканей медуллярной карциномы был выделен кальцитонин человека и установлена его аминокислотная последовательность /170/. Молекула природного гормона содержит 32 аминокислотных остатка (см. рис.30). 1 10 Cys Gly Asn Leu Ser Thr Gys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gin Asp Phe TGC GGT AAT CTG AGT ACT TGC ATG CTG GGG АСА TAC ACG CAG GAC TTC 20 30 Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gin Thr Ala He Gly Val Gly Ala Рго-Ш, AAC AAG TTT CAC ACG TTC GCC CAA ACT GCA ATT GGG GTT GCA GOT OCT Рис.30 Ha N-конце и в 7 положении полипептидной цепи находятся два по-луцист иновых остатка, обеспечивающих образование 1-7 дисульфидного мостика. С-Конец пептида представлен пролинамидом. Как было отмечено ранее (см. стр.34), при конструировании синтетических генов последовательность нуклеотидов в кодирующей части искусственного гена либо копирует известную структуру природного гена, либо выводится на основе известной аминокислотной последовательности белка. Выбирая нуклеотидную последовательность модельного гена, мы решили максимально приблизить ее к опубликованной в 1982 г. природной структуре, внеся в нее лишь незначительные изменения /171/ (см. рис.30,31). Так., вместо триплета АТС для Met8 введен триплет $тт ( VoC6). Выбор триплета QTT взамен ATQ не случаен. У большинства кальцитонинов высших организмов, в том числе и наи- более активного - кальцитонина лососевых рыб, в 8 положении аминокислотной цепи расположен VaB /169/. Мы полагаем, что произведенная аминокислотная замена не должна сказаться и на иммунологических свойствах пептида, поскольку известно, что носителем иммунологической активности кальцитонинов является аминокислотный фрагмент 10-32 /172/. С другой стороны, отсутствие Met в аминокислотной последовательности пептида позволит легко выщеплять целевой продукт из посттрансляционного химерного белка с помощью цианбромида по стартовому метионину С целью введения в структурную часть гена сайта эндонуклеазы рестрикции Kpnl { QQTACC ) нагли произведены точечные замены в двух триплетах: I) QGC ( qeyi0 ) - QQT ( ?V); 2) АСА (гл- )- АС с (r/trH ).
Такие замены не нарушают природной аминокислотной последовательности. Наличие же сайта рестрикции в кодирующей части позволит клонировать синтетический ген по отдельным фрагментам, а также создавать различные его конструкции. В остальном последовательность нуклеотидов модельного гена полностью соответствует природной. Мы отказались от применения одинаковых кодонов для повторяющихся аминокислот, полагая, что использование вырожденности генетического кода будет способствовать эффективной экспрессии искусственного гена (см. стр.36). Конструкция синтетического гена традиционна (рис.31,стр.45). Кодирующую последовательность из 96 нуклеотидов ограничивают стартовый код он ATQ И тандем терминирующих триплетов TQA и TAQ . Для встраивания в вектор в заданной ориентации на концах гена предусмотрены "половинные" сайты рестриктаз BcoRl ( ААТТС ) и BamHI ( С, ATT С ). Последовательность нуклеотидов в транслируемой и комплементарной цепях модельного гена (по НО нуклеотидов) была разбита на 16 перекрывающихся блоков (см. рис.31). Причем, размеры фрагментов I-I6 (от 10 до 16 звеньев) подобраны таким образом, чтобы перекрывание в комплементарных последовательностях составляло не менее 6 нуклеотидов и обеспечивало однозначное протекание реакции лигазного сшивания гена (см. ниже). Таким образом, экспериментальная часть работы состоит из двух самостоятельных разделов: 1) химический синтез, выделение и доказательство структуры олигонуклеотидов 1-І6; 2) лигазное сшивание гена и подтверждение его структуры. Олигонуклеотиды I-I6 были синтезированы блочным фосфотриэфир- ным методом в растворе (см. стр.22). На рис.32 представлена схема синтеза трех видов исходных соединений (69,71 и 72) для фос-фотриэфирного способа синтеза олигонуклеотидов в растворе. Общими предшественниками соединений (69), (71) и (72) служат 5-дшлетокситритил-ы-ацилнуклеозиды (68). Ацилирование аминогрупп гетероциклических оснований dQ, dС и dA проводили модифицированным методом Ти с использованием "временных" триметилсилильных защит. По нашему мнению, описанные в литературе /20/ условия протекания реакции (5-кратный избыток ацилирущего реагента и мягкий аммонолиз для снятия триметилсилильных защит) не являются оптимальными. Мы сократили втрое количество ацилирующего реагента, не увеличивая при этом продолжительности реакции, и исключили обработку аммиаком при снятии временных защит в случае JQ и d С . В результате отпала необходимость в кристаллизации продуктов N-ацилирования. После упаривания водных растворов N-ацили-рованные нуклеозиды без предварительного выделения (кристаллизации) высушивали упариванием с пиридином и вводили в реакцию с диметокситритилхлоридом. Таким образом, нагл удалось упростить способ получения защищенных нуклеозидов (68) и сократить потери материала на этом этапе синтеза. Выходы продуктов стабилизировались и составляли 80-95$ в расчете на исходные нуклеозиды (см. "Приложение", табл.1, стр.77 ). Традиционно Р-компоненты (диэфиры 71) получают из Ы,Р,О -защищенных нуклеотидов 6-элиминированием Р-цианэтильной защитной группы органическими основаниями (см. "Литературный обзор", стр.17).
Нам представлялось совершенно очевидным, что такие соединения проще и удобнее синтезировать из промежуточных фосфомо-нотриазолидов (70), исключив стадии пианэтилирования и хроматографии. Для этого нуклеозиды (68) фосфорилировали избытком арил-фосфобистриазолида, а продукт фосфорилирования (70) обрабатывали смесью триэтиламин-пиридин-вода. Полученные диэфиры хранили и использовали далее в виде растворов в пиридине. Другую порцию фосфомонотриазолида (70) обрабатывали цианэтанолом, продукты реакции детритилировали и выделяли 0Н-компоненты (72) адсорбционной хроматографией на силикателе. З-Ацетаты нуклеозидов (69) получали обработкой нуклеозидов уксусным ангидридом с последующим удалением 5-0-диметокситритильной группы 2% раствором бензолсулъфокислоты в смеси хлороформ-метанол (7:3) /91/. В итоге, все введенные наїли усовершенствования позволили ускорить ответственную стадию синтеза исходных Р- и ОН-компонентов и получить их с высокими выходами (см. "Приложение", табл.1, стр. 77). Задачей следующего этапа было создание банка да- и тринуклео-тидных блоков для синтеза фрагментов 1-І6. Как отмечено выше, эффективность реакции межнуклеотидной конденсации в значительной степени определяется свойствами конденсирующего реагента. С практической точки зрения наиболее существенными являются два основных критерия в оценке свойств конденсирующих реагентов: 1) скорость реакции конденсации; 2) степень протекания побочных реакций (модификация оснований и сульфонилирование 5-гидроксильных групп ОН-компонентов). В современном фосфотриэфирном методе используют широкий набор конденсирующих реагентов (см. "Литературный обзор",стр.24-25). При выборе наиболее подходящего из них для синтеза ди- и три-нуклеотидов мы остановились на комбинации TPS+TetrH. По данным Джея /87/ смесь TPS + TetrH в соотношении 1:3 является одним из лучших активаторов диэфирнои фосфатной группы в реакциях межнук-леотидных конденсаций. Причем, количество продуктов сульфонили-рования не превышает 3-5$. К существенным достоинствам такой комбинации реагентов следует отнести их устойчивость и меньшую по сравнению с другими конденсирующими реагентами (например,TPST) чувствительность к влаге. С целью выяснения оптимальных соотношений реагентов в реакции межнуклеотидной конденсации мы сопоставили несколько вариантов синтеза динуклеотида (75) (см. рис.33).
Материалы и методы
Растворители. В работе использовали абсолютированные пиридин, диоксан, триэтиламин, бензол и ацетонитрил. Хлороформ, метанол, гексан, гептан, пентан, толуол применяли без дополнительной очистки. Для ВЭЖХ использовали ацетонитрил и метанол ширмы икл. , Для работы с ферментами применяли перегнанные фенол и хлороформ. Реактивы. 2-Дезоксинуклеозиды СКТБ ЕАВ Главмикробиопрома (Новосибирск) , 5егУА , ,ТиА:гь Merest Триизопропилбензолсульфохлорид, триаз ол, трис-оксиметиламиноме-тан bFet/fct}, Jigwa LOSQ - С/!Є"7сЄ /foc/i - І» ід fit St p - fact Serra. Диметокситришлхлорид, бензол-сульфокислота, цианэтанол, р-нитробензальдоксим, 1,1,3,3-те траме тилгуанидин, триме тилхлор-силан, тетразол,дитиотриэтол,ВША Акриламид, н, N -МЄтиленбисакрил-амид, персульфат аммония, ТЕМЕД Меркаптоэтанол Ксиленцианол Бромфеноловый синий Диметилсульфоксид, гидразин,пиперидин, формамид В работе использовалигАТР из мышц свиньи (Лу/жг), суммарную тРНК из сой в качестве тРНК-носителя (Jerva), ДНК из тимуса те-.ленка в качестве ДНК-носителя, [ Г- Р] АТР (1000 Ки/ммоль) производства ХОД "Радиоизотоп" (Ташкент) и [7-32$гАТР (5000 Ки/ммоль) фирмы AmershQfi). Для радиоавтографирования применяли рентгеновскле пленки РТ-2 и Ш-І ("Тасма", Куйбышев). Ферменты. Фосфодиэстераза змеиного яда ( VPJ 6, К.Ф.3.1.4.1) и фосфодиэстераза селезенки ( SPD ,К.Ф.3.1.4.18) фирмы Whor+bfngto/i Т4 полинуклеотцдкиназа (К.Ф.2.7.1.78) и эндонуклеаза рестрикции А?/?/производства ВНИИ прикладной энзтгологии (Вильнюс); Т4 ДНК-лигаза (К.Ф.6.5.І.І) производства ШШ АН СССР (Пущино). Буферные растворы. ТЕАВ для гель- фильтрации олигонуклёотидов: I М раствор рН 7,5-8,0 (I М раствор ТЕАВ готовили, пропуская ток СС 2 в смесь 150 мл триэшламина и 850 мл воды до рН 7,5-8,0). ТВЕ I для электрофореза в ПАГ: 0,135 М трис, 0,015 М борная кислота, 1,3 М ВША , рН 8,9 (перед употреблением разбавляли в 10 раз). ТВЕ 2 для электрофореза в ПАГ: 0,05 М трис, 0,015 М борная кислота, 0,5 М ВТИА , рН 8,3-8,5 (перед употреблением разбавляли в 20 раз). KB для 5 юсфорилирования олигонуклёотидов:0.,05мМ трис-HCI (рН 9,0),0,01мМ щсе 0,05 М датиотриэтол. LB для лигирования олигонуклёотидов:67 мМ трис-HCI (рН 7,5, 10 Ш MgCez. QES для элюции олигонуклёотидов из ПАГ: 0,125 М МгСв, 0,025 М трис-НСІ (рН 7,5), 5мМ ВША . FAB для растворения проб и электрофореза в ПАГ: 80$ форм-амид, 50 мМ трис-борат (рН 8,3), I мМ ВША , 0,1$ кси-ленцианол, 0,1$ бромфеноловый синий. FBI для ферментативного гидролиза VPDB: 0,1 М трис-НСІ (рН 9,0), 10 мМ П$сег, 0,4 мМ меркаптоэтанол FBI для ферментативного гидролиза SPJ B\ 0,1 М ЩОАс(рН 5,6), 0,02 МВША, 0,5$ твин-80. I экв. нуклеозида высушивали упариванием с абсолютным пиридином и добавляли 5 экв. триметилхлорсилана в пиридине.
Через 15 мин. добавляли 1,5 экв. бензоилхлорида (масляного ангидрида в случае dG). Реакционную смесь перемешивали в течение 1,5-2 часов при комнатной температуре, контролируя ход реакции с помощью ТСХ в системе I. Реакционную смесь разлагали водой (Ь% аммиаком в случае dA), упаривали, остаток растворяли в воде, промывали этилаце-татом, упаривали досуха. Продукт без дополнительной обработки высушивали упариванием с пиридином и вводили в реакцию с диметокси-тритилхлоридом, как описано в работе /91/. Реакционную смесь обрабатывали обычным способом и продукт выделяли хроматографией на колонке с силикагелем I 40/100 (система 3). Выходы продуктов см. "Приложение", табл.1, стр.77. 2) N-Ацил-3-О-ацетилнуклео зиды (69). I экв. 5-0-диметокситритил-N -ацилнуклеозида (68) высушивали упариванием с пиридином и добавляли 20 экв. уксусного ангидрида в пиридине (1:2). Через 2 часа реакционную смесь разлагали метанолом, добавляли воду, продукт экстрагировали хлороформом, промывали Ъ% раствором бикарбоната натрия, сушили над сульфатом натрия, упаривали. Остаток упаривали с толуолом для удаления пиридина. После снятия 5-0-диметокситритильной защиты продукт реакции выделяли хроматографией на колонке с силикагелем (система 3). Выходы продуктов см. "Приложение", табл.1, стр. 77 . 3) Синтез мононуклеотидов (71). 1,5 экз. 0,4-0,6 М раствора р-хлорфенилфосфобистриазолидата в диоксане или ацетонитриле добавляли к I экв. 5-0-диметокситритил- N -ащлнукле о зида (68), растворенного в смеси дихлорэтан - пиридин. Смесь выдерживали при комнатной температуре 20 мин. и приливали 1-2 мл 50$ водного пиридина. Через 5-Ю мин. продукт экстрагировали хлороформом, экстракт промывали триады Ъ% бикарбонатом натрия, водой, сушили над сульфатом натрия и упаривали досуха.
Остаток, растворяли в фиксированном объеме абсолютного пиридина и использовали далее без дополнительной очистки в качестве Р-компонента в межнуклеотидных конденсациях. 4) Синтез N, Р ,о -защищенных мононуклеотидов. 5-0-Диметокситритил-N-ацилнуклеозиды фосфорилировали р-хлорфе- нилфосфотриазолидатом в диоксане (или ацетонитриле) в присутствии триэтиламина с последующим цианэтилированием, как. описано в работе /51/. Реакционную смесь обрабатывали обычным образом и продукт выделяли хроматографией на колонке с силикагелем (система 3). Выходы продуктов см. "Приложение", табл.1, стр. 77. 5) Удаление Р-цианэтильной защитной группы осуществляли: а) действием трет-бутиламина в пиридине (1:9) в течение 10 мин. при комнатной температуре по методу /54/; б)действием смеси пиридин-триэтиламин-вода (3:1:1) в течение 30 мин. при комнатной температуре по методу /185/. 6) Удаление 5-0-диметокситритильной группы в н , Р ,0 -защищенных нуклеотидах проводили обработкой 2% раствором бензолсульфокислоты в смеси хлороформ-метанол (7:3) в течение 2 мин. при 0С по мето ду /91), реакционную смесь после обычной обработки хроматографиро- вали на колонке с силикагелем в системе 3. Выделенные продукты (72) использовали в качестве ОН-компонентов в межнуклеотидных конденсациях. Выходы см. "Приложение", табл.1, стр. 77. II. Синтез ди- и тринуклеотидных блоков (общая методика). Смесь ОН-, Р-компонента и тетразола (соотношения реагентов см. табл.8 ,JM) высушивали упариванием с пиридином. Прибавляли триизо-пропилбензолсульфохлорид в пиридине, раствор концентрировали до 0,2 М концентрации по Р-компоненту, и выдерживали 20-30 минут при комнатной температуре. Хроматографический контроль за ходом реакции осуществляли с помощью TGX в системе I. Реакционную смесь разлагали добавлением 1-2 мл воды, экстрагировали хлороформом, экстракт промывали 5% раствором бикарбоната натрия, водой, сушили над сульфатом натрия, упаривали. Остатки пиридина удаляли отгонкой с толуолом. Продукт реакции выделяли адсорбционной хроматографией на силикагеле в системе 3. Результаты синтезов ди- и тринуклеоти-дов см. "Приложение", табл. 2,3, стр. 78-81. III. Синтез олигонуклеотидов (общая методика). Смесь I экв. ОН-компонента и 1,2 экз. Р-компонента дважды упаривали с абсолютным пиридином. Прибавляли 3,6 экв.ТРЬТ в абсолютном пиридине, раствор концентрировали и оставляли при 20С. Контроль за ходом реакции осуществляли с помощью ТСХ в системе I. Обработку реакционных смесей и выделение продуктов проводили, как, описано выше (см.II). На завершающих стадиях синтеза реакционную смесь без предварительного разделения подвергали обработке для удаления всех защитных групп (см. ниже). Стратегия синтеза олигонуклеотидов, результаты межнуклеотидных конденсаций и характеристики целевых продуктов представлены в "Приложении", табл.4, стр. 80. IV. Удаление защитных групп. После проведения последней стадии синтеза реакционную смесь обрабатывали р-нитроб.ензальдоксимом и 1,1,3,3-тетратлетилгуанидином, как описано в работе /t74 / Раствор упаривали досуха, прибавляли 3-5 мл насыщенного аммиака, нагревали при 60-65С в течение 7-8 часов, упаривали досуха. Остаток растворяли в 5 мл 80$ уксусной кислоты и выдерживали 20 минут при 20С. Уксусную кислоту удаляли упариванием с водой.
