Введение к работе
Актуальность проблемы
Рибосома является клеточной органеллой, ответственной за синтез белка во всех клетках. Анализ
структуры рибосомы, выполненный с помощью рентгеноструктурной кристаллографии, в
последние годы значительно улучшил понимание структурных основ функционирования рибосомы.
Однако, сравнительно мало известно о биогенезе рибосом, особенно у эукариот. В клетках
млекопитающих синтез цитоплазматической рибосомы требует сборки 4 молекул РНК и 79
различных белков [1]. В среднем клетка содержит примерно 4 миллиона цитоплазматических
рибосом, для которых необходимо порядка 80% всей клеточной РНК и 5-10% белков.
Исследование механизмов, которые контролируют экспрессию компонентов рибосомы, является
важной задачей современной науки. Три различных РНК-полимеразы вовлечены в продукцию РНК
и белков для рибосомы: РНК-полимераза I транскрибирует гены, кодирующие 28S, 18S и S,8S
рРНК, РНК-полимераза II - гены рибосомных белков (РБ), и РНК-полимераза III - гены 5S рРНК.
Нуклеотидные последовательности большинства генов РБ и рРНК уже определены, однако лишь
для небольшой части генов РБ млекопитающих исследована регуляция их экспрессии. В отличие от
рРНК, которые кодируются несколькими сотнями генов и кластеризуются в несколько локусов,
каждый эукариотический РБ кодируется только одним геном (кроме RPS4, различные гены
которого находятся на X и Y хромосомах), и эти гены распределены по всему геному [2]. Кроме
единственной функциональной копии гена, существует также большое количество
процессированных псевдогенов, что осложняет клонирование и функциональный анализ генов РБ.
Регуляция синтеза РБ отличается от большинства других белков домашнего хозяйства тем, что
клетке всегда требуется сбалансированное количество всех РБ. Координация экспрессии РБ
осуществляется на нескольких уровнях: транскрипционном, посттранскрипционном,
трансляционном и посттрансляционном. Так, регуляция на транскрипционном и
посттранскрипционном уровнях экспрессии генов РБ необходима для достижения примерно равного количества всех рибосомных белков. Это демонстрируют эксперименты, показывающие равное привлечение РНК-полимеразы промоторами различных генов РБ, равное количество мРНК, сравнимую степень экспрессии репортерных генов [3]. Однако, более тонкое исследование архитектуры промоторных районов генов РБ не выявило характерных особенностей в их строении. В целом, можно сказать, что промоторы генов РБ высших эукариот используют небольшой набор неспецифичных повсеместно используемых транскрипционных факторов (ТФ) и большое разнообразие ткане- и стадиоспецифичных активаторов и репрессоров. Таким образом, механизм получения стабильной экспрессии РБ во всех типах клеток до сих пор остается слабо понятным.
Интерес к биосинтезу рибосомы также стимулируется находками, что мутации в генах, кодирующих компоненты рибосомы или белки, вовлеченные в созревание, сборку или экспорт рибосомы из ядра, могут приводить к развитию некоторых наследственных заболеваний у человека. Так, например, анемия Diamond-Blackfan (DBA) - врожденная (наследственная) форма парциальной красноклеточной аплазии, причиной которой являются мутации в одном или нескольких генах РБ. Мутации, приводящие к развитию DBA, были найдены в генах RPS19 (около 25% случаев), RPS24 (2%), RPLII и RPL5 (по 10%) и др. Во всех случаях наследование является аутосомно-доминантным. Считается, что в основе заболевания лежит гаплонедостаточность РБ, которая приводит к недостаточному созреванию рибосом [4], что в свою очередь вызывает синтез малого количества гемоглобина и гибели предшественников эритроцитов.
Особый интерес представляют результаты, указывающие на участие многих рибосомных белков в регуляции клеточного цикла. Важность рибосом в регуляции роста и гибели клеток неудивительна, но рибосомные белки вовлекаются в эти процессы не только как структурные элементы рибосомы, но и как эффекторы или модуляторы изменений клеточного цикла. Так, например, инактивация гена рибосомного белка S6 Drosophila melanogaster приводит к образованию опухолей в некоторых тканях, что указывает на RPS6 как на ген-супрессор опухолевого роста [5]. С другой стороны, в опухолевых клетках повышен уровень некоторых рибосомных белков, например, SIS крысы, LI8 и L37 человека, а увеличение экспрессии генов RPL7 и RPS3a человека приводит к угнетению роста клеток и вступлению их в апоптоз [6]. Аминокислотные последовательности многих рибосомных белков сходны с функциональными мотивами ТФ, например, "лейциновая застежка" у RPL7 человека [7], "цинковые пальцы" у RPL37 человека [8], что указывает на возможное участие этих белков в регуляции транскрипции. Поэтому дополнительный интерес к регуляции экспрессии генов рибосомных белков обусловлен и наличием у некоторых из них внерибосомных функций. Рибосомный белок LI1 является компонентом 60S субъединицы рибосомы [9]. Данный белок относится к L5p семейству рибосомных белков и взаимодействует с 5S rRNA. Рибосомные белки LII и L5 необходимы для присоединения 5S рРНК к 90S прерибосомальному комплексу, играя важную роль в созревании рибосомы [10]. Кроме выполнения структурной функции в составе рибосомы, LII играет важную роль в индукции р53-зависимого ареста клеточного цикла, обеспечивая, связь между уменьшением сборки рибосом в ответ на какие-либо изменения условий жизни клетки и ингибированием роста. Данный эффект достигается связыванием избытка LI1 с НОМ2-лигазой, что предотвращает ее взаимодействие с р53, соответственно активируя р53-зависимый арест клеточного цикла[11]. Таким образом, интерес к строению и функционированию гена рибосомного белка L11 связан как с вхождением его в состав рибосомы, так и с его регуляториой ролью в клеточном цикле.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось исследование структурной организации гена рибосомного белка L) 1 человека, а также изучение ФТ, участвующих в регуляции его экспрессии. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Клонирование и секвенирование гена HRPL11 и его промоторной области.
Определение структурных особенностей гена HRPLII (точки старта транскрипции, наличие мяРНК, кодируемых нитронами гена) и сравнение их со структурными особенностями генов других РБ.
Выявление ТФ, взаимодействующих с промоторными элементами гена HRPL11.
Сравнение ТФ, взаимодействующих с промоторными районами генов рибосомных белков RPLU, RPL32 и RPS26 человека
Выявление функционального значения ТФ, взаимодействующих с промоторными элементами гена HRPL11.
Научная новизна работы
Впервые определена полная нуклеотидная последовательность гена RPL11 человека (зарегистрирована в GenBank (AFI01385)). Проведен функциональный анализ промоторной области гена RPL11, выявлены ТФ, участвующие в регуляции транскрипционной активности данного гена.
Теоретическое и практическое значение работы
Рибосома является клеточной органеллой, ответственной за синтез белка во всех клетках. Исследование механизмов, которые контролируют экспрессию компонентов рибосомы, является важной задачей современной науки. Нуклеотидные последовательности большинства генов РБ и рРНК уже определены, однако лишь для небольшой части генов РБ млекопитающих исследована регуляция их экспрессии. Данная работа вносит вклад в фундаментальные знания о строении и функционировании трансляционного аппарата эукариотической клетки.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано 3 статьи в реферируемых российских журналах. Основные положения и результаты работы докладывались и обсуждались на семинарах и конференциях: 1. XXXIX Международная Научная Студенческая Конференция. ВОРОНИНА Е.Н., асп. «Клонирование и секвенирование гена рибосомного белка L11 человека.» Научный руководитель -канд. биол. наук МЛ. Филипенко. 10-12 апреля 2001 г., г.Новосибирск.
2. 9-ая итоговая конференции "Геном человека-99". Филипенко М.Л., Воронина Е.Н., Винниченко Н.А., и др. «Регуляция экспрессии генов рибосомных белков человека». 2-5 февраля 1999 г., г. Черноголовка.
Основные положения, выносимые на защиту
Структура гена HRPL11 соответствует основным характеристикам генов РБ млекопитающих.
Промотор гена HRPLU содержит несколько участков связывания ТФ, таких как YYI (Yin Yang 1), GABP (GA-связывающий белок) и АР2.
Существуют общие белковые факторы, характерные для промоторных районов генов HRPL11, HRPL32 и HRPS26, а также существуют ТФ, общие для HRPLU и HRPL32 и не встречающиеся у HRPS26.
ТФ YYI входит в сложный ДНК-белковый комплекс, формирующийся в районе +6...+26 гена HRPLU и является белком-активатором транскрипции гена HRPL11.
