Содержание к диссертации
Введение
1. CLASS Введени CLASS е
1.1. Актуальность проблемы
1.2. Научная новизна
1.3. Цель работы 8
1.4. Задачи 9
2. Обзор литературы
2.1. Строение молочной железы К)
2.2. Формы рака молочной железы. Классификация И
2.3. Статистика заболеваемости раком молочной железы П
2.4. Возможные механизмы возникновения рака при мутациях в генах опухолевых супрессоров 18
2.5. Тканеспецифичность проявления мутаций в гене BRCA1 20
2.6. Заболевания, связанные с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 22
2.7. Наследственная предрасположенность к раку молочной железы 23
2.8. Структура гена и белка BRCA1 24
2.9. Роль BRCA1 в регуляции транскрипции 30
2.9.1. C-MycuBRCAl 30
2.9.2 CtlP и BRCAI 3J.
2.9.3 RHA и BRCA1 33
2.9.4р53 и BRCA 1 33
2.10. Роль BRCA1 в репарации ДНК 33
2.11. Роль BRCA1 в росте и дифференцировке клеток 36
2.12. Мутации гена BRCA1 37
2.13. Спектр мутаций в гене BRCA1 в разных популяциях 41
3. Материалы и методы
3.1. Пациенты 52
3.2. Выделение ДНК из свежей и замороженной крови по методу Кюнкеля
3.2.1 Выделение ДНК из свежей крови 53
3.2.2 Выделение ДНК из замороженной крови 54
3.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле 55
3.4. Полимеразная цепная реакция 56
3.5. Электрофорез ДНК в полиакрил амид ном геле 58
3.6. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 59
3.7. Гетеродуплексный анализ 60
3.8. SSCP-анализ 60
3.9. Окрашивание образцов ДНК 61
3.9.1 Окрашивание бромистым этидием 61
3.9.2 Окрашивание нитратом серебра 6Х
ЗЛО. Клонирование 62
3.10.1 Лигирование 62
3.10.2. Трансформация Е. coli 63
3.10.3. Идентификация рекомбинаитных клонов путем амплификации клонированных последовательностей 65
3.11. Секвенирование ДНК 65
3.12. Статистические методы 66
4. CLASS Результат CLASS ы 68
4.1. Мутация 2963dell0 (c.2963-2972dell0) 70
4.2. Мутация 5382insC (c.5382-5383insC) 79
4.3. Мутация 3819del5 (c.l234-1235del5) 84
4.4. Мутация 3875del4 (c.l252-1253de!4) 92
4.5. Мутация 2274insA (c.720insA) 98
4.6. Мутация R1203X (c.3726C>T) 1Ш
4.7. Мутация E1250K (c.3867G>A) 105
4.8. Полиморфизм S694S (c.2201OT) 110
4.9. Полиморфизм L771L (c.2430T>C) 110
4.10. Полиморфизм El038G (c. 3232A>G) U5
5. Обсуждение результатов
5.1. Введение И8
5.2. Мутация 5382insC -одна из наиболее распространенных в мире 121
5.3. Впервые обнаруженная мутация 2963dell0 124
5.4. Роль мутаций 3819del5 и 3875del4 в развитии предрасположенности к заболеванию 125
5.5. Редкая мутация 2274 ins А 127
5.6. Нонсенс-мутация R1203X 127
5.7. Миссенс-мутация Е1250К —мутация или полиморфизм? 128
5.8. Полиморфизмы E1038G, S694S и L771L 130
5.9. Поиск мутаций в 5 экзоне гена BRCA1 133
5.10. Заключение 134
6. Выводы 139
7. Список литературы 140
- Тканеспецифичность проявления мутаций в гене BRCA1
- Выделение ДНК из замороженной крови
- Идентификация рекомбинаитных клонов путем амплификации клонированных последовательностей
- Впервые обнаруженная мутация 2963dell0
Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы
Достижения молекулярной генетики последних десятилетий привели к идентификации десятков тысяч генов человека. Это позволяет уже в настоящее время проводить молекулярную диагностику сотен моногенных заболеваний и определять генетические факторы риска развития распространенных болезней человека. Появился новый раздел медицины, получивший название молекулярной медицины, основанный на точном знании молекулярных механизмов возникновения наследственных заболеваний (Баранов и др., 2000). Определенные успехи достигнуты и в изучении механизмов патогенеза так называемых мультифакториальных (Горбунова и др., 1997) заболеваний, в этиологию которых наряду с факторами внешней среды значительный вклад вносят генетические составляющие.
Рак принадлежит к группе мультифакториальных заболеваний, хотя в некоторых случаях предрасположенность к раку наследуется по моногенному типу. Именно так наследуется предрасположенность к семейным формам рака молочной железы, вызванным мутациями в генах BRCA1 и BRCA2,
Рак молочной железы является одной из наиболее часто встречающихся форм онкопатологии. В развитых странах мира около 10% женщин заболевают раком молочной железы в течение жизни. Изучение семей с несколькими случаями рака молочной железы в анамнезе позволило изолировать специфические гены предрасположенности к этому заболеванию, получившие название генов BRCAI (Miki et al.,1994) и BRCA2 (Wooster et al.,1995) (BReast CAncer). При мутации в любом из этих генов высока вероятность развития рака молочной железы, а при мутациях в гене BRCA1 возрастает вероятность развития рака яичника. Носители мутаций в этих генах имеют риск развития заболевания в течение жизни, приближающийся к 80%.
Интенсивные исследования вариабельности генов Я/?С4-семейства проводятся во всем мире. Первые популяционные исследования мутаций в гене BRCAI были проведены в Канаде в 1994 году (Simard et al., 1994). К настоящему времени известны около 1200 мутаций и полиморфных вариантов гена BRCAI (BIC), причем набор мутаций и степень распространенности каждой из них характерен для каждой популяции и этнической группы, В связи с этим невозможно использовать данные, полученные при изучении мутаций и полиморфизмов генов BRCA в одних странах, для проведения ранней ДНК-диагностики предрасположенности к раку молочной железы в других. Именно этот вид диагностики позволяет выявить контингент женщин с высоким риском развития данного заболевания до возникновения клинических его проявлений. Предыдущие исследования российской популяции (Gayther et al., 1997; Мандельштам и др., 2001; Tereschenko et al., 2002, Карпухин А.В. и др., 2002) показали как наличие распространенной в Европе мутации (5382 insC), так и существенные различия спектра мутаций в гене BR.CA1 в различных регионах (Gayther et al., 1997; Карпухин А.В, и др., 2002; Tereschenko et ah, 2002).
Эффективность лечения рака молочной железы во многом зависит от своевременной диагностики. ДНК-диагностика позволяет выявить предрасположенность к раку молочной железы и осуществить постановку на учет к онкологу еще до возникновения клинических проявлений заболевания. В связи с постоянным увеличением заболеваемости раком молочной железы проблема ранней диагностики приобретает чрезвычайную актуальность. 1.2. Научная новизна
У больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге идентифицированы семь мутаций в гене BRCAJ: 5382insC, 2963dell0, 3819del5, 3875del4, 2274insA, R1203X и E1250K, причем мутация 2963dell0 является новой. Из числа выявленных пять мутаций (3875del4, 2274insA, 2963dell0, R1203X и Е1250К) ранее в Российской Федерации обнаружены не были. Впервые в Санкт-Петербурге обнаружен ряд сцепленных друг с другом полиморфизмов (S694S, L771L и E1038G), ранее описанных во многих странах мира.
В результате работы была охарактеризована вариабельность гена BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге. Разработанные для обнаруженных нами мутаций методы экспресс-диагностики могут быть использованы для генетического консультирования в семьях больных семейными формами рака молочной железы, а также для ранней диагностики предрасположенности к этому заболеванию.
1.3. Цель работы
Основной целью работы было изучение спектра мутаций гена BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге. 1.4. Задачи:
1. Создать коллекцию образцов ДНК пациентов с семейными формами рака молочной железы;
2. Осуществить поиск мутаций в 5, 11 и 20 экзоне гена BRCA1 этих пациентов методами гетеродуплексного анализа и анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (SSCP-анализа);
3. Идентифицировать обнаруженные мутации методом секвенирования ДНК;
4. Разработать быстрые методы идентификации обнаруженных мутаций;
5. Провести анализ ДНК родственников пациентов, у которых были обнаружены мутации, с целью проведения генетического консультирования в семьях больных.
Тканеспецифичность проявления мутаций в гене BRCA1
Имеющиеся на сегодняшний день данные не позволяют дать точный ответ, почему мутации в гене BRCA1 вызывают предрасположенность именно к раку эпителиальных тканей, таких как ткани молочной железы и яичника, но позволяют выдвинуть несколько гипотез (Venkitaraman, 2002). Все гипотезы в той или иной степени связаны с тем фактом, что стимуляция развития этих тканей происходит под контролем эстрогенов. Как правило, воздействие эстрогенов приводит к повышению скорости пролиферации клеток. В частности, именно эстрогеновая стимуляция обуславливает пролиферацию протоков молочной железы.
Первая гипотеза объясняет тканеспецифичность проявления наследуемых мутаций в гене BRCA1 повышенной чувствительностью клеток молочной железы и яичника к действию локальных мутагенов, таких как метаболиты эстрогена. Недостаток белкового продукта гена BRCA1 приводит к нарушению репарации вызванных такими мутагенами повреждений ДНК, в том числе и в областях, ответственных за предотвращение малигнизации клеток. В пользу этой гипотезы может свидетельствовать тот факт, что повышенный уровень эстрогенов увеличивает риск развития рака молочной железы у женщин в постменопаузе и у женщин, несущих мутации в гене BRCAI, но не влияет на риск развития этого заболевания у молодых женщин. Увеличение уровня эстрогенов у молодых женщин, помимо индукции дифференцировки и стимулирования пролиферации, помогает поддерживать генетическую стабильность, так как повышает экспрессию генов, участвующих в поддержании целостности генома, в том числе и гена BRCAL В этом случае клетки молочных желез еще не успели накопить критический уровень мутаций, необходимых для инициирования и развития рака, и способны устранить последствия повреждающего эффекта метаболитов эстрогенов. Поэтому у молодых женщин эстрогены не увеличивают риск развития рака молочной железы. Напротив, молочные железы пожилых женщин, скорее всего, содержат клетки, несущие мутации в генах системы репарации и контроля клеточного цикла, и, следовательно, стимулирование пролиферации таких клеток эстрогенами может привести к возникновению опухоли (Hilakivi-Clarke, 2000).
Другая гипотеза связана с предположением, что одной из функций белка BRCA1 является связывание рецептора эстрогена в отсутствие лиганда (Fan et al., 1999). Было показано (Zheng et al., 2001), что в отсутствие эстрогена BRCA1 связывается с эстрогеновым рецептором ER-a внутри клетки и в составе белкового комплекса локализуется на элементах, транскрипция которых зависит от ER-a. Видимо, BRCA1 входит в комплекс, ингибирующий ER-a-зависимую транскрипцию с помощью деацетилирования гистонов. Поэтому мутации в гене BRCA1 могут вызывать эстроген-независимую активацию транскрипции белков, которая в норме происходит в ответ на воздействие эстрогенов. Это приводит к неконтролируемому увеличению скорости пролиферации, что, при наличии инактивированного аллеля гена BRCA1, может послужить причиной возникновения опухоли.
Третья гипотеза связана с различием протекания процесса потери гетерозиготности в разных тканях. В тканях молочной железы и яичника длительные периоды покоя чередуются с периодами активной пролиферации. Некоторые авторы полагают, что такие условия наиболее благоприятны для протекания процесса гомологичной рекомбинации и потери аллеля дикого типа (Venkitaraman, 2002).
Мутации в генах BRCA -семейства в основном приводят к развитию рака определенной локализации — раку молочной железы и раку яичника. Однако существуют данные о развитии некоторых других заболеваний при мутациях в генах BRCA1 и BRCA2. Так было предпринято исследование, направленное на поиск мутаций в гене BRCA1 у больных различными формами рака, В результате были обнаружены 3 различные миссенс-мутации в последовательности гена BRCA1 у двух больных, одного, с раком мозга, и, второго, с В-клеточной лимфомой (Seen et al., 2000).
Несколько групп исследователей изучали вклад мутаций в последовательностях генов BRCA1 и BRCA2 в патогенез рака простаты. Так Arason et al. (Arason et al., 1993) предположили, что у мужчин-носителей мутаций в гене BRCA1 может быть повышен риск возникновения рака простаты. В 1996 году при обследовании 61 пациента с семейными формами или ранним началом заболевания были обнаружены 6 различных мутаций (Langston et al., 1996). Однако выявить повышение риска развития рака у родственников больных раком простаты не удалось (Isaaks et al., 1995). Также не было выявлено повышенной частоты встречаемости мутаций 185delAG, 5382insC и 6174delT ни в одной из трех обследованных групп больных раком простаты по сравнению с частотой встречаемости этих мутаций в популяции в целом (Vazina et al., 2000; Wilkens et al., 1999; Nastiuk et al., 1999). Из представленных данных можно сделать вывод, что вклад мутаций в генах ЯйС4-семейства в предрасположенность к развитию рака простаты невелик.
Также было показано, что кроме перечисленных выше заболеваний, у носителей мутаций в BRCA-генах. может развиться мультифокальная папиллярная серозная перитонеальная карцинома (Schorge et al., 1998).
Выделение ДНК из замороженной крови
1. Образец крови размораживали и добавляли 1 мл холодного раствора I (см. выше), тщательно перемешивали в течение 5 мин. Если кровь свернулась, то гомогенизировали получившуюся смесь в тефлоновом гомогенизаторе. Все дальнейшие стадии по выделению ДНК проводили сразу же после размораживания образца. 2. Смесь центрифугировали при 2500g в течение 15 минут, Надосадочную жидкость сливали. Эту процедуру повторяли до образования осадка белого цвета.
Все описанные стадии вели при +4 С,
Дальнейшая процедура выделения полностью совпадает с выше описанной процедурой для свежей крови, начиная со стадии выделения ядер лейкоцитов.
Для приготовления геля смесь компонентов прогревали до полного растворения агарозы, после чего охлаждали до 50С и заливали на горизонтальную платформу размером 80ммх110мм. Толщина геля составляла 5 мм. Напряженность электрического поля составляла 5 В/см.
3.4 Полимєразиая цепная реакция
ДНК добавлялась к реакционной смеси в количестве 40 нг (кроме экспериментов, в которых использовались различные концентрации ДНК). В исследовании использовались праймеры, указанные в таблице 2-1. Все праймеры изготовлены фирмой «Медиген» (Новосибирск).
Наиболее протяженный 11 экзон гена BRCAI был разбит на перекрывающиеся фрагменты, для удобства пронумерованные буквами латинского алфавита (11А-11Р). Праймеры к 5 и 20 экзонам гена BRCA1 находились во фланкирующих их нитронах. Для контроля чистоты амплификации в каждый опыт добавлялась проба, не содержащая геномной ДНК. ПЦР проводилась в микроцентрифужных пробирках объемом 0.5 мл на аппарате «Терцик» с набором программ, определяющих температурный режим ПЦР.
Температурный профиль ПЦР. Тотжига для всех фрагментов 11 экзона составляла 55С, для 5 и 20 экзонов -60 С.
3.5 Электрофорез продуктов амплификации ДНК в полна крилам ид ном геле (ПААГ)
Для оценки количества и специфичности продуктов амплификации ДНК проводился электрофорез этих продуктов в вертикальных пластинах полиакриламидного геля (80x100x2мм) (Остерман, 1981).
В зависимости от необходимой концентрация ПААГ в буфер для геля добавляли различное количество 30% раствора акриламида (соотношение бисакрил амид: акрил амид= 1:29). В работе использовался ПААГ с концентрацией 6, 8 и 10%. Напряженность поля составляла 13 В/см.
Для разделения гомодуплексов и гетеродуплексов, образующихся при амплификации образцов ДНК с мутацией 5382insC, проводился электрофорез продуктов амплификации 20 экзона в вертикальных пластинах полиакриламидного геля (165x120x0,8 мм), а напряженность поля составляла 20 В/см.
Наблюдение за миграцией продуктов амплификации в ПААГ осуществлялось с помощью лидирующих красителей, добавленных в буфер для образцов. Ксиленцианол в Iх буфере ТВЕ в 8% ПЛАГ мигрирует как фрагмент двунитевой ДНК размером приблизительно 160 п.н., а бромфеноловый синий - 60 п.н.
Идентификация рекомбинаитных клонов путем амплификации клонированных последовательностей
Секвенирование продуктов амплификации проводили по методу Сэнджера (Sanger et al., 1977) на приборе ALFexpress II фирмы «Amersham Biosciences». Использовали набор реактивов The Thermo Sequenase Су5 Dye Terminator Kit, разработанный для использования при секвенировании на приборах ALFexpress.
Для приготовления образцов для секвенирования использовали стандартные праймеры для исследуемого фрагмента, меченные Су5 дидезокситринуклеотиды и термосеквеназу (Thermo Sequenase I DNA polymerase). В случае, когда образец был клонирован в плазмиде, для постановки секвенирующей реакции использовали прилагающиеся модифицированные универсальные меченные праймеры (Universal Primer).
Электрофорез продуктов секвенирующей реакции проводили на указанном приборе с использованием программного обеспечения AlfWinSoftware. Анализ полученных последовательностей проводили с использованием прилагающегося пакета программ.
В некоторых случаях образцы отправлялись на секвенирование пользователям прибора аппарата DNA Sequencer 377 (ABI 377) фирмы Applied Biosystems. 3.12. Статистические методы
Проверку равновесия Харди-Вайнберга для генотипов по изучаемым полиморфизмам проводили с помощь критерия % (Айала и др., 1988) по формуле:
где Н] - наблюдаемое число гомозигот [АА], Н2 — наблюдаемое число гомозигот [ВВ], Нз - наблюдаемое число гетерозигот [АВ], а О і 02 и Оз -ожидаемое число соответствующих гомо- и гетерозигот. Значения О; (і = 1,2, 3) рассчитывали следующим образом: Oi = np s 02 = nq , ОЗ = 2npq, где п -число пациентов, а р и q — частоты аллелей А и В, соответственно. Частоты аллелей определяли как отношение числа аллелей из всех трех генотипов к общему числу изученных аллелей (удвоенное число пациентов). В работе проводили сравнение частот аллелей ряда полиморфизмов гена BRCA1 между группами из разных популяций. Для сравнения частот аллелей во всех этих случаях использовали критерий значимости %2, предложенный Пирсоном и Фишером (Тюрин и др., 1998). Экспериментальные частоты аллелей определяли исходя из частот отдельных генотипов путем подсчета числа определенного аллеля, поделенное на общее число изученных аллелей. Проверяли нулевую гипотезу о принадлежности рассматриваемых выборок к одной генеральной совокупности. В предположении правильности нулевой гипотезы объединяли данные выборок из разных популяций и считали частоты, полученные при объединении этих групп, ожидаемыми частотами. Для расчета меры расхождения между сравниваемыми частотами строили таблицу сопряженности:
где і, j менялись от 1 до 2, Ку - число соответствующих аллелей в сравниваемых выборках, ni0 - общее число аллелей в выборке, noj - общее число одноименных аллелей в выборках, an- общее число аллеей в сравниваемых выборках.
Расчет параметра % эксп производился по следующей формуле:
Значения Ojj рассчитывали следующим образом: Ojj = пю поУп. Формула применима при Од 5. После вычисления параметра % эксп по формуле (2), строили критерий значимости, основанный на статистике критерия, подчиняющейся распределению % (Глотов и др., 1982). Число степеней свободы для распределения % вычисляли по формуле: (k-1)(1-1), где к -количество анализируемых выборок, 1 - количество событий в полной группе. Если %а X эксп, то нулевая гипотеза принимается, если х„ х2эксп -отвергается на уровне значимости а. 4. РЕЗУЛЬТАТЫ
Материалом для исследования являлась коллекция геномной ДНК пациентов с семейными формами первичного рака молочной железы, состоящая из 43 образцов. Полная схема исследования представлена на рисунке 4-1.
Отбор пациентов с этой патологией проводился сотрудниками НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова. Критерием принадлежности пациента к группе больных с наследственной предрасположенностью к раку молочной железы являлось наличие в семье не менее 3 случаев рака данной локализации (1). Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов крови методом Кюнкеля (в модификации Белла) (раздел 3.2). Для определения образцов ДНК, пригодных для дальнейшего исследования, проводилась оценка качества и концентрации ДНК с помощью электрофореза в 0.8% агарозном геле (2). Для амплификации участков гена BRCA1 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (раздел 3.4) использовали праймеры, предложенные Friedman et al., 1994 (раздел 3.4). Наиболее протяженный 11 экзон гена BRCA1 был разбит на перекрывающиеся фрагменты, для удобства пронумерованные буквами латинского алфавита (ПА-ИР). Была проведена амплификация ДНК всех исследуемых пациентов с праймерами для фрагментов 11 экзона, а также 5 и 20 экзонов (3). Для проверки специфичности реакции и количества продуктов амплификации проводили электрофорез в 8% ПААГ в однократном ТВЕ буфере. Размер фрагмента оценивали с помощью маркера молекулярного веса от 100 до 1000 через 100 пар нуклеотидов фирмы «Медиген». В случае специфичной реакции амплификации, уже на этом этапе можно проводить первичный поиск мутаций методом гетеродуплексного анализа (4) и выявлять образцы, в которых из-за наличия нормального и мутантного аллелей образуются гетеродуплексы. Для уточнения данных, полученных в результате гетеродуплексного анализа, проводили электрофорез в денатурирующих условиях (6).
Впервые обнаруженная мутация 2963dell0
У одного из пробандов нами была идентифицирована новая мутация в 11 экзоне гена BRCAL В соответствии с международной номенклатурой она была названа 2963dell0 (с. 2963-2972dell0). Данная мутация также является мутацией сдвига рамки считывания и приводит к изменению аминокислотной последовательности белка. Начиная с 948 аминокислотного остатка последовательность приобретает случайный характер вплоть до возникающего в позиции 999 терминирующего кодона. Вообще, при идентификации новой мутации важно определить ее роль в развитии заболевания. Проверка функциональной активности белка в случае, когда в результате мутации утрачивается существенная часть мул ьти функционального белка, чаще всего невозможна. В таких случаях обычно используют косвенные методы доказательства влияния неизвестной ранее мутации на развитие заболевания или предрасположенности к нему. Одним из таких методов является сопоставление новой мутации с известной мутацией, вызывающей предрасположенность. В мире описано 14 мутаций, приводящих к возникновению стоп-кодона в той же позиции (BIC), из них 13 мутаций сдвига рамки считывания и одна мутация - L999X - нонсенс-мутация. Вышеназванные мутации приводят к предрасположенности к развитию заболевания (BIC), и, поэтому, мы сделали вывод о том, что данная мутация также приводит к предрасположенности к развитию рака молочной железы и яичника. Анализ ДНК родственников пациентки, несущей делецию 2963dell0 показал, что данная мутация присутствует в последовательности ДНК сестры и дочери пробанда. Таким образом, пациентка, ее сестра и дочь являются гетерозиготными носителями мутации 2963dell0 в гене BRCA1. Скорее всего, данная мутация явилась причиной возникновения рака молочной железы у пробанда в 41 год и рака яичника у ее сестры в 52 года. 19-летняя дочь пациентки в данный момент не имеет признаков заболевания.
Результаты обследования были сообщены лечащему врачу с целью рекомендации постановки дочери пробанда на учет к онкологу.
Для экспресс-диагностики наличия этой мутации у пациентов может быть применен гетеродуплексный анализ с использованием в качестве положительного контроля продукта амплификации ДНК фрагмента 11J носителя мутации. Эта делеция не приводит ни к появлению нового, ни к исчезновению существовавшего сайта ни для одной из известных эндонуклеаз, поэтому метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов не пригоден для тестирования на наличие данной мутации,
Роль мутаций 3819del5 и 3875del4 в развитии предрасположенности к заболеванию
Мутация 3819del5 была обнаружена нами у двух пациенток с семейными формами рака молочной железы. У одной пациентки рак молочной железы был диагностирован в возрасте 31 года, у другой — в возрасте 36 лет. В дальнейшем, в возрасте 48 лет, у второй пациентки был диагностирован первичный рак второй молочной железы. К сожалению, родственники пациенток были недоступны для исследования. Мутация 3819del5 приводит к сдвигу рамки считывания и образованию терминирующего кодона (стоп 1262) в последовательности гена BRCA1. В базе данных BIC сообщения об этой мутации встречаются 22 раза и, таким образом, она занимает 20 место по распространенности среди этого типа мутаций. Вообще, довольно низкая встречаемость этой мутации может свидетельствовать о высокой ее пенетрантности и сравнительно раннем проявлении заболевания. Помимо нашей выборки данная мутация была найдена в нескольких странах Европы, включая Германию, Данию, Чехию, Францию и Польшу, а также в Австралии и США (BIC).
Другая мутация, локализованная в том же фрагменте 11 экзона - 3875del4 - также приводит к сдвигу рамки считывания и образованию стоп-кодона (стоп 1241) в последовательности гена BRCA1. Она была обнаружена нами у одной из пациенток с диагнозом рак молочной железы, поставленным в возрасте 47 лет, а также у ее дочери, у которой в 14 лет был поставлен диагноз дольковая гиперплазия молочной железы и киста правого яичника. Эта мутация была впервые найдена Castilla и др. в 1994 году при обследовании группы пациентов с семейной историей рака молочной железы и яичника. По данным BIC мутация 3875del4 встречается в большинстве европейских популяций (Италия, Ирландия, Шотландия, Англия, Дания, Чехия, Германия), а также в Азии и Африке. Среди мутаций, приводящих к сдвигу рамки считывания, эта мутация занимает 4 место по распространенности. В базе данных насчитывается 73 сообщения об обнаружении этой мутации у различных пациентов.
Perrin-Vidoz и др. в 2002 году показали возможный механизм, приводящий к развитию заболевания у пациентов, несущих мутации 3819del5 и 3875del4. Близость образовывающихся в результате этих мутаций стоп-кодонов к последовательностям, участвующим в слиянии экзонов, приводит к нарушению процессинга и быстрой деградации мРНК. (рис 5.1) Таким образом, носители этих мутаций обладают лишь одной нормально транслируемой копией гена BRCA1, что существенно повышает риск развития рака молочной железы.
Данные мутации не приводят к появлению нового или исчезновению существовавшего сайта ни для одной из известных эндонуклеаз, что делает невозможным использование ПДРФ-анализа в качестве экспресс-метода для их идентификации.
Метод гетеродуплексного анализа при наличии контрольных образцов позволяет не только выявлять присутствие этих мутаций во фрагменте 110, но и различать их по характерным картинам разделения гетеродуплексов.
Впервые мутация 2274insA была обнаружена Weber в 1997 году среди белых североамериканцев, больных раком молочной железы и принадлежащих к семьям, отягощенным семейной историей заболевания. Данная мутация приводит к сдвигу рамки считывания и образованию терминирующего кодона (стоп 725) в последовательности гена BRCA1. Из данных, представленных в BIC, следует, что эта мутация не является широко распространенной в уже охарактеризованных популяциях, так как запись о ней встречается только один раз. Связь мутации с предрасположенностью к раку молочной железы была показана с помощью косвенных методов. Мутация 2274insA была обнаружена нами у пациентки с семейной формой рака молочной железы. Инсерция 2274msА не приводит к изменению рестрикционной карты фрагмента 11G, поэтому метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов не применим в качестве метода быстрой детекции данной мутации. К сожалению, родственники данной больной были недоступны для исследования.
