Введение к работе
Актуальность іщвбд&мьі, В сельском хозяйстве остро стоит проблема поражаемостиг культивируемых растений различными заболеваниями. В связи с этим создание трансгенных растений, устойчивых к грибным и бактериальным патогенам, является одним из приоритетных направлений генной инженерии культурных растений. Для получения растений с такими свойствам и в их геном вводят чужеродные геныу кодирующие защитные белки (PR) других растений* либо подобные белки животного и бактериального происхождения. Нужно отметить, что использование гене* из растений имеет преимущества по сравнению с применением тенов из других источников, поскольку в данном случае не требуется оптимизация нухлеоткдного состава для стабильной экспрессии генов,
Среди известных PR белков наибольший практический интерес представляют короткие (30-50 а.к.) цистеин-богатые пептиды, к которым, в частности, относятся дефетаины и хитинсвязывающие белки растений. Данные пептиды обладают широким спектром антимикробной активности и оказывали-воздействие на патогенные грибы и Грам+ бактерии в мнкромолярных количествах (1040 мкг), Важной особенностью «их пептидных антибиотиков является то, что они в отличие от других: защитных белков не проявляют токсического действия ка клетки животных и человека [Broekaert et Ы-, 1992t 1993 J. Поэтому гены этих белков достаточно перспективны для трансгеноза важнейших сельскохозяйственных культур.
На сегодняшний день выявлено, что среди данных антимикробных пептидов растений высокой фунгсшкдной активностью обладают дефен*ины? выделенные из семян редьки {Rapkanus sativus) - Rs-AFPt и Rs-AFP2, а фунгицидно-бактерицидной активностью - хитинсвязыаающие белки из семян Шарайти (Amarcnthus caudatus) Ас-АМР1 И А0-АМР2. Группой ученых Бельгийского Католического Университета были получены трансгенные растения табака, трансформированные векторами с участками кДНК, кодирующими белки Rs*AFP2 и Ас-АМР2. Показано, что растения, экспресскруюшие белок редькн> проявляли усггойчнвость по стютешпо к грибному патогену Ahernaria longipes ITeiras FA.G. et aU І995]. Однако, использованная а данных исследованиях яуклеотидная последовательность хДНК дефензйна редьки не содержит интронв^ наличие хоторого в кодирующей последовательности гена, как показано, способствует по&вденто уровня экспрессии белка и стабильности гена в трансгешшх растениях [Callis J. et aL, 19S7, Mascarenbaa D. et ai„ 1990],
В связи с этим представляет практический интерес клонирование геномных копий, кодирующих пептидные антибиотики редьки и амаранта, получение трансгенных растений, содержащих эта гены, дальнейшее научение их наследования и функционирования в семенном потомстве.
Цель и задачи исследования. Исходя Из вышеизложенного, целью настоящей работы являлось создание векторных конструкций с природными гедами хитинсвязывающего белка амаранта ас-арг дефензица редьки rs-ap ц изучение на модельном растении табаке {Nicotiana tabucum) интеграции і геном и функционирования этих генов. Для достижения, цели были поставлены. следующие задачи;
-
Клонировать и секвенироаать полученные геномные копии ас-ар и п-ар> кодирующие пептидные антибиотики амаранта я редьки соответственно;
-
На основе стандартного бинарного вектора рРС V002 и полученного во ВНИИСБ вектора рН22Кпео создать генетические конструкция, содержащие геномные копии ас-ар и rs-ap под контролем растительных регуляторных элементов, а также - маркерный ген ирг//;
-
Получить травсгенные растения табака, содержащие гены ас-op и rs-ap адоимихр обиы х белков амаранта и редьки;
4,Сраанить эффеетивность трансформации растений при поможи стандартного вектора pPCV002 и вектора рН22Кпео> содержащих ген rs-ap\
S. Получить семенное поколение Тв от трансгевных растений с генами ас-яр и rs-ap для изучения наследования и экспрессии этих генов.
Научная новизна. Впервые были клонированы геномные копии кодирующие дефензин редьки Rs-AFP3 и хнткнсвяэыванхцяй белок амаранта АоАМР2, определены размеры и иуклеотидные последовательности нитронов гена rs-йр дефензина редьки Rs«AFP3 и гека п дефензина редьки R&-AFP2.
На примере трансгенных растений табака, полученных с помощью созданных нами конструкций, показано, что природные гены антимикробных белков из амаранта и редьки стабильно наследуются при получении семенного потомства путем самоопыления. Наследование происходит согласно законам Мендели и в геноме трансгенных растений данные гены присутствуют в виде единичных копий.
Ппашическви ценность работу. В ходе данной работы созданы генетические конструкции, содержащие природные гены антимикробных белков из амаранта и редьки, с помощью которых возможно проведение агробактерйальной трансформации ряда сельскохозяйственных культур. Создана система комплексной молекулярно-генетической оценки трансгенных растений с генами белков из амаранта и редьки*
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результата и обсуждение, заключение, выводы, список литературы (156 названий). Работа изложена на 98- страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков и 5
таблиц.
