Введение к работе
Для борьбы с болезнями и вредителями растения выработали широкий арсенал механизмов устойчивости. Одним из них является распознавание патогена и передача сигнала для запуска защитного ответа. За специфическое распознавание многих патогенов отвечают серии-треониновые киназы, которые взаимодействуют с белками патогена но механизму рецептор-лиганд. Такое распознавание приводит к актований факторов транскрипции к синтезу белков, уничтожающих патоген.
Рецепторные сери н-треон и новые киназы (РК) растений изучены
достаточно подробно (Ellis et а]., 2000; Hammond-Kosack, Jones, 1997; Michelmore, 2000; Torn, 2000; Young, 2000). Структура PK растений и животных обнаруживает высокую консервативность. В составе этих белков выделяют несколько функциональных доменов, наличие которых является основой для структурной классификации РК (рис, 1).
1 1»
~1 16
Нуклеотид-
свячываюшнй
домен
TIR-домен
Ч7777Л i**««'
LRR-домеп
i,L Протеи н-
*ЗЇЇ*і3* кип аза
Трансмом (>ран ный домен
Рис. 1. Основные структурные классы РК., участвующих в устойчивости растений к болезням и врелнгелям. Гены-прототипы: la - Wren устойчивости табака к вирусу табачной мозаики, L6 - геи лчнз устойчивости к листовой ржавчкис (Afelampiora Ііпі), 15 - Rx ген устойчивости картопля к вирусу X, СгеЗ - і-ен устойчивости пшєріиць» к корневой нематоде (Iteterodera avenat), Prf - ген устойчивости томатов к бактериальной пятнистости томатов {P. syringaae pv. tomato); 2-Cf - ген устойчивости томатов к бурой пятнистости листьев {CtaJospotium futvumy. З - Xall - ген устойчивости риса к бактериальной пелосатости {Xantkomonas огугае pv, oryzae); 4 - Pto - ген устойчивости томатов к fifl 111 її ітпіпГі Tiimmpnmi fP
"****"* І ЦНБМСХА
Фонд научной литературы
TIR домен, названный так вследствие гомологии с белками Toll дрозофилы и imerteukin-1 человека, предположительно, отвечает за связывание с факторами транскрипции защитных белков (Cohnet а]., 2001) и специфическое распознавание патогена (Luck, 2000). В нуклеотид-связывзющем участке (nucleotide-binding site, NBS) происходит присоединение трифосфата, с помощью которого киназа фосфорилируст молекулу следующего участника сигнального каскада, & результате чего активируется транскрипция защитных белков (Li ct al., 1997). LRR домен (leucine-rich repeat, участок, богатый лейциновыми повторами) отвечает за специфическое распознавание патогенов (Fluhr, 2001). В пределах каждого из этих доменов можно выделить несколько участков, консервативных для большинства РК устойчивости. С помощью праймеров, соответствующих этим участкам в составе ДНК, были амплифицированы и клонированы многочисленные фрагменты и патноразмерные гомологи уже известных генов устойчивости (РК. или NBS-LRR гомологи), что позволило получить принципиально новые данные о структуре этих генов, их диверсификации путем дупликации и дивергенции, роли внутримолекулярной рекомбинации и ретротранспоэонов в эволюции РК генов устойчивости и механизмах коэволюции патоген - растение-хозяин (Bergelson, 2001; Ellis, 2000; Michelmore, Meyers, 1998; Richter, Ronald, 2000). В настоящее время изучение структуры существенно опережает функциональные исследования РК устойчивости и кодирующих их генов: анализ аллельного полиморфизма и выявление последовательностей РК, распознающих индивидуальные формы (расы, штаммы) патогена, а также устаноаление связи тех или иных аллелей РК генов с фенотипическими признаками устойчивости или чувствительности к болезням и вредителям. Функциональный анализ РК генов устойчивости открывает путь для их использования в молекулярной селекции растений в качестве ДНК зондов, маркирующих признак устойчивости, или хозяйственно ценных аллелей, пригодных для генетической трансформации растений.
С практической точки зрения, изучение РК генов и кх РПК гомологов открывает новые возможности для создания новых форм сельскохозяйственных растений, устойчивых к болезням и вредителям. ДНК маркеры признаков устойчивости на основе фрагментов РК генов устойчивости можно использовать для поиска новых селекционных источников в генетических коллекциях и ускорения селекционного процесса, Полиоразмервые последовательности РК генов, выделенные прямой амплификацией геномной ДНК или из геномных библиотек, могут стать целевыми генами для генетической модификации растений.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение фрагментов генома злаковых и пасленовых растений, представляющих основные классы РК генов устойчивости растений к бактериальным, вирусным и грибным патогенам, и их сравнительный анализ, а также изучение возможности использовать эти фрагменты
генома в качестве ДНК маркеров генов и признаков устойчивости у различных видов сельскохозяйственных растений. В процессе работы предстояло решить следующие задачи:
-
Синтезировать гомологи РК генов устойчивости путем амплификации геномной ДУіК растений методом полпмеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами и клонировать полученные фрагменты генома.
-
Идентифицировать синтезированные РПК гомологи генов путем анализа их нуклеотидных и производных аминокислотных последо вате л ы юстей.
-
Сравнить полученные РПК гомологи г-енов с уже известными генами устойчивости путем компьютерного анализа с использованием генетических баз данных,
-
Изучить возможность использовать РПК гомологи генов устойчивости в качестве гнбридизациониых зондов в RFLP анализе.
-
Провести сравнительный анализ полиморфизма РПК гомологов и кодирующих их генов в пределах семейств злаковых и пасленовых растений, используя нуклеотидные и производные аминокислотные последовательности и результаты рестрикциокної о анализа.
-
Провести анализ косегрегацни полученных гомологов с фенотнпическими проявлениями устойчивости растений.
Научная іюшшіа. Клонированы и охарактеризованы 23 новых РПК гомолога генов устойчивости, в том числе 4 нолиоразмерных последовательности. Получены новые данные о структурном полиморфизме четырех классов РПК генов устойчивости в семействах злаковых и пасленовых растений-
Практическэя значимость. Показана принципиальная возможность использовать гомологи РК генов устойчивости в качестве ДНК маркеров для селекции растений па устойчивость к болезням и вредителям. РПК гомологи генов устойчивости, выделенные нами из дикорастущих сородичей картофеля, пшеницы, ржи и томатов, могут оказаться перспективными для трансформации этих культурных растений.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глаз "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Заключение", выводов и списка литературы, включающего 134 библиографических ссылки. Работа изложена на 139 машинописных страницах, содержит 30 рисунков и 9 таблиц.
