Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Биология Propionibacterium freudenreichii в связи с решаемой проблемой 9
1. Молекулярно-биологическая идентификация микроорганизмов и филогения пропионовокисльгх бактерий 11
2 (А). Физиология и биохимия классической ПКБ (P. freudenreichii) — в основе её пробиотических и технологически значимых свойств 16
(Б). P. freudenreichii как кандидат в пробиотики: пробиотическое действие и пробиотически значимые свойства бактерии 32
3. Практическое значение P. freudenreichii: применение и разработка способов микробиологической защиты пищевых и сельскохозяйственных продуктов 44
Цель и задачи работы 60
Экспериментальная часть 62
Объекты, материалы и методы 62
Результаты и обсуждение 84
1. Секвенирование фрагментов 16S рРНК и филогенетический анализ исследуемых штаммов ПКБ 84
2. Пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов P. freudenreichii и их действие на макроорганизм 87
2.1. Выживаемость штаммов P. freudenreich іі в условиях модельного ЖКТ 87
2.2. Действие штаммов P. freudenreichii на макроорганизм 91
2.3. Иммунотропные свойстваисследуемых штаммов P. freudenreichii 93
2.4. Внеклеточный витамин Віг (корриноиды) и некоторые ферменты культуральной жидкости штаммов P. freudenreichii 100
2.5. Избирательная антимикробная активность исследуемых штаммов P. freudenreichii 108
2.6. Антиоксидантные свойства жидких культур штаммов P. freudenreichii 122
3. Разработка способов применения P. freudenreichii для защиты пшеничного хлеба от «картофельной болезни», вызываемой развитием бацилл 127
Заключение 149
Выводы 156
Список литературы 158
- Молекулярно-биологическая идентификация микроорганизмов и филогения пропионовокисльгх бактерий
- Практическое значение P. freudenreichii: применение и разработка способов микробиологической защиты пищевых и сельскохозяйственных продуктов
- Иммунотропные свойстваисследуемых штаммов P. freudenreichii
- Разработка способов применения P. freudenreichii для защиты пшеничного хлеба от «картофельной болезни», вызываемой развитием бацилл
Введение к работе
Актуальность проблемы
Выявление микроорганизмов-пробиотиков, изучение их пробиотически значимых свойств, исследование воздействия на физиологию макроорганизма (животного и человека), создание новых способов применения как биоконсервантов пищевых продуктов - всё это в целом современная обширная проблема, которую решают специалисты разных областей. Актуальность её определяется стремлением людей к экологическим (биологическим) подходам в поддержании здоровья: сокращению применения химических препаратов (химиотерапия) и любых ксенобиотков, включая антибиотики. И это действительно возможно: лечение многих заболеваний достигается с помощью пробиотиков именно потому, что они настраивают (регулируют) иммунную систему человека (животных), способны нормализовать микробиоту желудочно-кишечного тракта благодаря избирательной антимикробной активности (без антибиотиков), вызывать апоптоз некоторых опухолей. Последнее относится и к пропионовокислым бактериям (ПКБ), действующим, например, против аденокарциномы прямой кишки [Jan et al., 2004]. Все эти наблюдения и достигнутые результаты исследователей в Мире по сути иницированы русским учёным, лауреатом Нобелевской премии 1908 г, И. И. Мечниковым, который в своё время «вылечил Балканы» от желудочно-кишечных заболеваний с помощью только одной полезной бактерии: Lactobacillus delbrueckii.
Понятие «пробиотик» в настоящее время расширяется по смыслу по сравнению с первоначальным [Rolfe, 2000; Шендеров, 2001; Nomoto, 2005; Суворов, 2007; Adams, Huang, 2008] и по определению ВОЗ (2002) подразумевает живой микроорганизм, поступивший в организм естественным путём, улучшающий его общее физиологическое состояние. Пробиотики в настоящее время условно подразделяют на три категории: антимикробные, иммуномодулирующие и метаболические [Суворов, 2007]. Возможно и комплексное воздействие пробиотических микроорганизмов. Пробиотики могут быть индигенными (резидентными, автохтонными) или транзиторными, которые проявляют неспецифическую слабую адгезию на эпителии и не колонизируют его.
Пробиотическое действие обусловлено видом микроорганизма, его метаболизмом. Биологической особенностью классических ПКБ (по сравнению, например, с МКБ) является способность продуцировать ряд метаболитов-нутрицевтиков, включая витамины группы В, в том числе фолиевую кислоту, витамин Віг [Воробьёва, 1976; Hugenholtz, 2002] и бифидогенные факторы [Kaneko et al., 1994; Isawa et al., 2002; War-minska-Radiko et al., 2002], выделение пропионовой кислоты (пропионатов) и полипеп-
тидов, обладающих антимикробными [Holo et al., 2002] и антимутагенными свойствами [Vorobjeva, 2000], наличие в клетках ферментов-антиоксидантов [Краева, Воробьёва, 1981] и другое. В последнее время выявляется штаммовая специфичность пробиотиче-ских эффектов микроорганизмов [Warminska-Radiko, 2002; Lan et al., 2007; Kekkonen et al., 2008]. Поэтому выявление новых пробиотиков, в том чиле среди штаммов P. freude-nreichii, актуально.
Микробиологическая защита пищевых продуктов от порчи всегда актуальна и является альтернативой применению вредных для человека химических препаратов и дорогостоящих физических факторов. Она во все века применялась человеком (эмпирически, без знания микробиологии), например, сыроделие, в котором ПКБ участвуют, зародилось как способ консервирования молочного белка, казеина, а не как производство деликатесов. Вместе с тем, разработки новых способов ведут к улучшению результатов в плане эффективности защиты пищевых продуктов и её безопасности, особенно если в основе способов лежит знание биологии микроорганизмов. Именно это актуально.
Классические или «молочные» пропионовокислые бактерии в настоящее время активно прокладывают себе путь в обоих этих направлениях.
Безопасность P. freudenreichii признаётся Европейским комитетом (European Food Safety Authority, EFSA), основанном в 2002 году: статус QPS (Qualified presumtion of Safety, ). Комитет США (Food and Drug Administration) также недавно включил эту бактерию в список GRAS (Generally Recognized AS Safe) под номером: 21 CFR133.195 [Lan et al., 2007].
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось обнаружение действия исследуемых штаммов классических пропионовокислых бактерий (p. Propionibacterium) в качестве пробиотиков, начальное изучение их пробиотически значимых свойств и разработка новых способов защиты пшеничного хлеба от гнилостного поражения.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
идентифицировать имеющиеся в лаборатории штаммы ГЖБ с применением молеку-лярно-биологическиго метода (сиквенс фрагментов гена 16S pPFIK) и филогенетического анализа;
исследовать жизнеспособность штаммов пропионовокислвх бактерий в условиях модели желудочно-кишечного тракта;
испытать штаммы ПКБ на животных в отношении их действия как возможных про-
биотиков;
оценить пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов пропионовокис-лых бактерий: их иммунотропую, антимикробную, антиоксидантную активности, а также способность к образованию некоторых специфических полезных экзометаболи-тов;
разработать основы накопительной заквасочной технологии производства пшеничного хлеба, устойчивого к бактериальной деструкции («картофельной болезни»)
Научная новизна работы
Биология классических пропионовокислых бактерий достаточно полно изучена. Она позволяет прогнозировать их активность в качестве пробиотиков. P. jensenii 702 уже признана эубиотиком, способным к адгезии на слизистой и размножению в ЖКТ [Adams, Huang, 2008]. Вместе с тем адгезия и колонизация эпителия рассматривается как полезное, но необлигатное пробиотическое свойство. Более важным является выживаемость и функциональная активность полезного для человека (животного) транзи-торного микроорганизма в ЖКТ. Научные предпосылки указывают на штаммовую детерминированность тех или иных свойств бактерий-пробиотиков. Штаммы Р. freudenreichii ещё не получили статуса истинного или автохтонного пробиотика (эу-биотика), однако немногочисленные испытания, в том числе и проведённые в нашей работе, свидетельствуют о пробиотическом действии этой бактерии на организм животного. Важное значение работы состоит в оценке и обобщении имеющейся в литературе информации по биологии и пробитически значимым свойствам классических ПКБ.
Новизна настоящей работы состоит, во-первых, в оригинальной оценке выживаемости бактерий - кандидатов в пробиотики в агрессивной среде ЖКТ при использовании разработанной нами модели, а также в обнаружении положительного воздействия P. freudenreichii на организм животного на примере птицы; во-вторых, в выявлении пробиотически значимых свойств (в жидких культурах, культуральных жидкостях и в суспензиях живых клеток) новых изолятов классических ПКБ, которые были филогенетически идентифицированы нами как штаммы P. freudenreichii. Так, показано, что Р. freudenreichii подавляет развитие как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, причём в нейтральной среде, за счёт пропионатов и бактериоцин-подобных веществ. Проведена оценка внеклеточного содержания витамина Bi2 и активности некоторых экзоферментов. Впервые выявлены антиоксидантные свойства жидких культур P. freudenreichii, что существенно для их пробиотического действия в ЖКТ, и пока-
зана иммунотропная активность клеток бактерии (результаты получены практически одновременно с финскими исследователями). Эти наблюдения свидетельствуют о возможности реализации биологии классических ПКБ в ЖКТ животных, определяющей пробиотические эффекты.
В-третьих, при разработке заквасочного способа применения бактерии для защиты пшеничного хлеба от гнилостного поражения обнаружили способность Р. freudenreichii развиваться на мучной среде только вслед за МКБ. Установили, что трофическая цепь между Lactobacillus delbrueckii и P. freudenreichii на мучной среде действует. Предварительное культивирование термофильной молочнокислой бактерии обеспечивает развитие пропионовокислой культуры, предположительно, вследствие накопления лактатов и ферментативной модификации белков мучной среды с образованием стимуляторов её роста.
Практическая значимость работы
Полученные научные результаты показывают целесообразность использования наших штаммов P. freudenreichii в пробиотических препаратах.
Исследованные штаммы P. freudenreichii готовы для испытаний в качестве пробиотических препаратов, которые могут быть применены как в животноводстве, так и в клиническом или профилактическом питании пациентов-добровольцев. Поскольку данные бактерии, скорее всего, транзиторные пробиотики, их потребление должно быть перманентным (периодическим) при высокой исходной концентрации клеток (не менее 10s - 10у) и их экзометаболитов.
Выявленные пробиотические эффекты и свойства исследуемых штаммов Р. freudenreichii позволяют использовать их в пищевой промышленности в качестве биоконсервантов не только с уверенностью в безопасности, но и достигая обогащения пищевых продуктов клетками-пробиотиками и их полезными экзометаболитами.
Разработан способ приготовления пшеничного хлеба, устойчивого к «картофельной болезни», с использованием пропионовокислой закваски, которую можно накапливать в условиях хлебозаводов перед внесением в дрожжевое тесто на мучной среде в требуемом количестве. Этот удобный и экономичный способ включает трофическую цепь между L. delbrueckii и P. freudenreichii. Он даёт возможность накапливать пропионовокислую закваску в нестерильных условиях (без контаминации), которая содержит натуральные пропионаты, в геометрической прогрессии путём её двукратного разбавления свежей мучной средой, предварительно ферментированной L. delbrueckii. Способ испытан в условиях, соответствующих производственным. Достигнуты практически важные результатов в хранении хлеба и улучшении его качества
(способ патентуется).
Апробация результатов
Результаты диссертационной работы были доложены на Всероссийском симпозиуме «Автотрофные микроорганизмы». Москва. МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, декабрь 2005; на Международном Конгрессе «Пробиотики, пре-биотики, синбиотки и функциональные продукты питания». Санкт-Петербург, май 2007 г.
Основные положения, выносимые на защиту
Исследуемые штаммы безопасны для животных и человека на основании их принадлежности к Propionibacterium freudenreichii.
Выживаемость исследуемых штаммов P. freudenreichii в в модельной пищеварительной системе даёт возможность их применения в качестве метаболизирую-щих пробиотиков.
Пробиотическое действие в отношении животного организма выявлено на примере двух исследуемых штаммов.
Пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов P. freudenreichii: им-мунотропная, антиоксидантная, избирательная антимикробная активности, а также образование полезных внеклеточных соединений (в том числе бактерио-цин-подобных веществ, витамина Віг и некоторых экзоферментов) служат объяснению их общего пробиотического действия.
Применение ПКБ для защиты пшеничного хлеба от поражения гнилостными бактериями на основе заквасочной технологии (в крупномасштабном производстве хлеба) может быть успешно реализована с использованием трофической цепи между L. delbrueckii и P. freudenreichii.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, получено положительное решение по заявке на Патент РФ.
Объём и структура диссертации
Диссертация содержит: Введение, Обзор литературы, раздел Объекты, материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Список цитируемой литературы (всего 141 наименование), Список публикаций соискателя. Работа изложена на 174 страницах, включает 16 таблиц, 28 рисунков и список сокращений.
Работа выполнена в рамках Договора № 5 (2006-2009 гг) о научном и учебно-методическом сотрудничестве между Биологическим факультетом МГУ имени М.В. Ломоносова и Институтом систематики и экологии животных СО РАН (куратор Сереб-
ров ВВ.).
Молекулярно-биологическая идентификация микроорганизмов и филогения пропионовокисльгх бактерий
Молекулярно-биологическая (генетическая) идентификация микроорганизмов основана на 1) рестрикции ДНК, например, метод RFLP (restriction fragments length polymorphism - анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции ДНК) или метод пульс-электрофореза фрагментов ДНК; 2) на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и 3) на определении последовательности нуклеотидов (секвенировании генов).
RFLP-метод может включать этап гибридизации фрагментов ДНК, в том числе фрагменнтов гена 16S рРНК, с зондами, что значительно упрощает генетическую идентификацию прокариот.
ПНР с использованием taq-полимеразы является наиболее широко используемым молекулярно биологическим подходом при идентификации микроорганизмов. Существует ряд методов, основных на ПНР: RAPD-PCR (randomly amplified polymorphic DNA analysis), ARDRA (amplification and polymorphism of restricted 16S rRNA genes), специфическая ПЦР, видоспе-цифическая ПЦР, PCR-DGGE и другие [Ленгерер и др. 2005].
Секвенированием ДНК называют комплекс методов, позволяющих определить нуклеотидную последовательность ДНК и её фрагментов. Существует два основных принципа секвенирования: определение порядка расположения нуклеотидов при помощи расщепления ДНК и, наоборот, при наращивании ДНК. Для проведения секвенирования необходимо провести амплификацию выбранного гена, для чего используется также ПЦР-метод. Основной мишенью в настоящее время при генотипировании прокариот служит 16S рРНК, последовательность гена которой используется для идентификации микроорганизма. Обычно для идентификации достаточно секвенировать не весь ген, а только его часть.
Почему выбран ген 16S рРНК? Последовательность этого гена очень консервативна. Она изменяется только в результате редких случайных мутаций, происходящих с постоянной скоростью (биологические часы). Именно поэтому её последовательность служит критерием родства прокариот. Примером такого подхода для идентификации молочнокислых, бактерий служит работа Хейлинг [Heiling et al., 2001]. Вместе с тем, применяют и другие подходы для идентификации микрооорганизмов: RAPD-PCR (random amplified polymorphic deoxyribonucleic acid), пульс-электрофорез, другие методы и их сочетания [Bouton et al., 2001].
На самом деле, только фингерпринтинг, основанный на анализе сайтов рестрикции полного генома под действием рестриктаз, метод BRENDA), или/и ПЦР-типировании по профилю амплификации специфи ческих фрагментов хромосомы (с использованием праймеров из повторяющихся последовательностей, широко распространённых в геноме) позволяет получить в настоящее время генетический паспорт штамма, что необходимо для его юридической защиты.
Молекулярная биология и филогения ПКБ
Данные, представленные на рисунках 2 и 3 показывают, что про-пионовокислые бактерии, располагаясь компактно относительно друг друга, филогенетически соседствуют с родами Luteococcus, Nocardia, Nocardi-oides, Aeromicrobium, Arthrobacter, Terrabacter, при этом чётко от них отделяясь. В кластре пропионовокислых бактерий P. jreudenreichii (вместе с P. cyclohexanicum) занимает наиболее удалённое положение на бескорневом дереве, построенном по сиквенсу фрагментов генов 16S рРНК [Char-freitag, Stackebrandt, 1989; Dasen et al., 1998]. В первой работе для анализа использовали последовательность из 1519 пар нуклеотидов, т. е. соответствующую 98,4 % таковой в 16S рРНК Е. coli. Большинство последовательностей начиналось возле позиции 110 и заканчивалось позицией 1480.
Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК в 1994 году позволил заключить о более тесных генетических отношениях вида Р. rubrum с видом P.jensenii, чем с видом P. thoenii [Riedel et al. 1994].
Ведётся поиск векторов для P. freudenreichii и условий её трансформации [Jore et al., 2001; Brede et al., 2005]. Установлен размер генома P. feudenreichii. Величина хромосомной ДНК пропионовокислых бактерий составляет 2,7 - 2,8 Мб. В процессе выполнения находится проект по сек-венированию генома P. freudenreichii ssp. shermanii: определена последовательность отдельных фрагментов генома [Meurice et al., 2004]. Генетике и молекулярной биологии пропионовокислых бактерий посвящен обширный обзор авторов из Голландии, Швейцарии и Франции: "Genetics and molecular biology of propionibacteria" [Luijk et al., 2002].
Практическое значение P. freudenreichii: применение и разработка способов микробиологической защиты пищевых и сельскохозяйственных продуктов
Использование способности ПКБ подавлять портящие микроорганизмы: биопротекторное действие и технологии биоконсервирования Препараты на основе P. freudenreichii уже используются для- борьбы с патогенными или портящими микроорганизмами, т.е. консервирования продуктов. Актуальность применения, ПКБ состоит в. замене химических препаратов и антибиотиков на биологические,, которые экологически предпочтительны.
Так, был разработан биологический консервант «Микрогард» -пастеризованное снятое молоко послекультивирования в нём Propionibacerium freudenreichii subsp. shermanii. Этот консервант был официально-утверждён для- использования- в продуктах типа домашнего сыра и йогурта. По некоторым данным, примерно 30% всего домашнего сыра в США производится с добавлением «Микрогарда». Препарат ингибирует рост грибов, дрожжей и грамотрицательных бактерий. Считают, что антимикробную активность этот консервант проявляет за счёт наличия в нём пропионовои кислоты/пропионата, ацетата, а также особого пептида [Ayres et al., 1992; Holo et al., 2002]. Препарат представляет собой пастеризованное снятое молоко, которое подкисляют до рН 5,3 и культивируют на нём Р. freiidenreichii ssp. shermanii (АТСС 9617) в течение 48 часов. Затем препарат нейтрализуют, пастеризуют и замораживают [Ayres et al., 1992]. Следует отметить, что используемое значение рН препарата оптимальным для развития P. freiidenreichii не является [Воробьёва, 1995]. Поэтому не удивительно, что «Микрогард» содержит менее 0,02% пропионовой кислоты/пропионата; этого недостаточно для подавления микробного роста. Антимикробным действием, по-видимому, обладают метаболиты с молекулярной массой больше 300 Да, подверженные действию протеолитических ферментов. «Микрогард» подавляет рост многих исследованных грибов, например, Penicillum exvansum OSU, Black yeast, Kluyvermyces marxianus 8554, но не всех. Нечувствительность некоторых грибов {Aspergillus niger OSU, Yeast Y) может быть связана с действием их протеолитических ферментов. Минимальная ингибирующая. концентрация для разных микроорганизмов различается. Она колеблется от 1% (для Ps. putida, Yersinia sp., Aeromonas sp., Salmonella paratyphi) до 3% (Ps. aeruginosa ATCC 419, S. typhimurium) [Al-Zoreky et al., 1991]. Действие препарата очень сильно зависит от состава того или иного пищевого продукта [Ayres et al., 1992 ]. Другой коммерческий препарат «Биопрофит» содержит L. rhamnosus и P. freiidenreichii. Этот продукт используется для подавления роста дрожжей в молочнокислых продуктах и бацилла в хлебной закваске. Ингибирующий эффект обусловлен совместным действием двух штаммов [Al-Zoreky, 1991].
Подробно о применении P. freudenreichii в производстве «твёрдых» сыров типа «Швейцарского», в производстве витамина Bi2 и пропионовой кислоты микробного происхождения, а также в составе заквасок при силосовании трав на корм скоту можно прочитать в книге Воробьёвой Л.И. [Воробьёва, 1995]. Одна из разработок с использованием подсырной сыво ротки и Pfr подвида shermanii, а также смешанных культур, позволила получать пропионовую кислоту в концентрации 1,6 - 2,2% [Bodie et al., 1987]. Другая - с использованием последовательного культивирования сначала термофилов Lactobacillus bulgaricus и Streptococcus thermophilic на под-сырной лактозной сыворотке, а затем ГЖБ, использующей лактат, обеспечивала образование 2,6% пропионата [Ahern et al., 1987].
Всё современное производство высококачественных сыров в мире включает, использование штаммов ПКБ. Сыры - это, прежде всего, консервирование молочного белка, казеина. В России, как и в Мире в целом, пропионовокислые бактерии как заквасочные (стартерные) культуры в производстве сыров примененяют с конца 80-х - начала 90-х годов прошлого столетия. Для созревания» сыра (формирования его структуры, органолептических свойств-и биологической ценности) абсолютное значение имеют соединения, выделяемые бактерией. Это прежде всего продукты пропионовокислого брожения: углекислый газ, пропионовая и другие летучие кислоты, их альдегиды, ацетоин, диацетил и пропанол, а также диметилсульфид. Пролин и свободные нуклеотиды, выделяемые пропио-новокислыми бактериями, создают специфический вкус сыра. «Настоящие» сыры, помимо их вкусовой привлекательности, продукты - весьма полезные для человека, благодаря биологически активным веществам, образуемым именно ПКБ. Среди них - незаменимые аминокислоты (метио-нин, пролин), свободные нуклеотиды, витамины группы В, в том числе фолиевая кислота и следы витамина Bi2, нуклеотиды и нуклеозиды, естественные актимикробные факторы (пропионаты, пропионицины) и противовирусный антибиотик (пропионин), а также другие пептиды, в частности с антимутагенными и реактивирующими свойствами [Иконников и др., 1982; Воробьёва,. 1995; Hugenholtz et al, 2002; Рыжкова, 2003].
Таким образом, благодаря именно пропионовокислым бактериям высококачественные сыры являются продуктом, пищевые и биологические свойства которого превосходят молоко и молочные продукты, хотя сыро делие возникло в глубокой древности, и по сути таковым является сейчас, как способ консервирования молочного белка. Технологии производства сыра с применением заквасочных (стартерных) культур ПКБ, которая начала активно применяться в 90-годы прошлого века, а также о проблемах такого применения посвящена большая статья специалистов из Швейцарии [Frohlich-Wyder et al., 2002].
Любая микробиологическая биотехнология подразумевает выявление эффектов микроорганизма(ов), их изучение и разработку (оптимизацию) способа введения в тот или иной пищевой продукт. По нашим представлениям, ПКБ как источник пропионатов и бактериоцинов (пребиоти-ков и нутрицевтиков) можно применять тремя способами:
1) в качестве биодобавки, т.е. выращенной культуры или культу-ральной жидкости, содержащей нужные экзометаболиты, не растущей и не ферментирующей субстрат;
2) в качестве ферментирующей углеводы или лактат с образованием пропионата суспензии клеток: не растущая культура (отделённые, в том числе иммобилизованные, живые или пермеабилизованные клетки);
3) в качестве растущей культуры ПКБ при совместном культивировании действующего микроорганизма (дрожжей, МКБ) и ПКБ. Это возможно в микробиологическом производстве, когда м-о используют общий субстрат или наблюдается трофическая связь или кометоболизм (МКБ-ПКБ).
Вместе с тем, иногда исходят из общих представлений о полезных свойствах ПКБ, почерпнутых из литературных источнков, и вносят их в пищевой продукт механически без выявления их реальной активности (жизнедеятельности или метаболического вклада). В последнее время в России запатентовано достаточно много изобретений по внесению культур ПКБ в пищевые продукты (табл. 4), однако надежность описываемых в изобретениях результатов по применению ПКБ, на самом деле, может быть невысокой. Основной проблемой, возникающей при включении ПКБ в состав комплексной закваски, является их взаимодействие с другими заквасоч-ными культурами. Как уже было сказано, ПКБ растут медленнее, чем большинство молочнокислых бактерий и достаточно чувствительны к снижению рН среды, которое они вызывают. Поэтому усовершенствование технологий приготовления заквасок с ПКБ должно быть направлено на обеспечение активности культур ПКБ в процессе создания продукта.
Технологи Иркутского молочного завода совместно с учеными Восточно-Сибирского ГТУ Улан-Удэ разработали кисломолочный продукт «Целебный», биологически активный напиток, для изготовления которого применяли сухую закваску ПКБ. Напиток «Целебный» содержит витамин В12- Он предложен для использования в профилактике и лечении желудочно-кишечных заболеваний, дисбактериоза, анемии [Хамагаева, Качанина, 2005].
Примерами выявления эффектов, их изучения и тщательных разработок для получения новых пищевых продуктов с использованием ПКБ, которые базируются на собственных исследованиях, являются работы группы A. Babuchowski (Польша, Университет г. Олыптин). Исследовали последствия введения (и инкубирования) ПКБ в овощные продукты, в том числе предварительно ферментированные с помощью МКБ (сквашенная-капуста), смешанные свежие салаты, состоящие из разных овощей, и овощные соки, например, сок красной свеклы. Оценивали способность к развитию классических ПКБ разных видов, образование ими пропионовой и уксусной кислот, обогащение нутрицевтиками (витамином Ві2и фолие-вой кислотой), состав микробиоты по КОЕ, органолептические свойства продуктов и сроки хранения. Получили положительные результаты, показывающие перспективность применения ПКБ для обработки овощной продукции.
Иммунотропные свойстваисследуемых штаммов P. freudenreichii
Ранее было известно, что кожные (cutaneous) ПКБ, например, Р. acnes и некоторые другие виды, способны проявлять иммунотропные і свойства в отношении организма животного и человека [Воробьёва, 1995].
В книге приведены данные о стимуляции как врождённого, так и специфи ческого иммунитета: увеличение числа макрофагов и их активности, увеличение числа Т-лимфоцитов в селезёнке, стимулирование функции В-клеток, активирование лимфоцитов-эффекторов, которые убивают опухолевые клетки, стимуляция синтеза интерферона. Действие кожных про-. пионовокислых бактерий может быть вызвано клеточными стенками или их фрагментами. Факторы адъювантности (предполагаемые): пептиды, ,: взаимодействующие с ЦПМ, и фрагменты КС + тейховые кислоты. Р. acnes, Р: granulosum, P. avidum обнаружны не только на коже и поверхностных слизистых человека, но и в ЖКТ, а именно в прямой кишке. Вопрос о механизмах (способах) взаимодействия кожных ПКБ с иммунными клетками крови остаётся открытым.
Мы впервые наблюдали, что все семь, исследуемых штаммов, которые принадлежат классической (молочной) ПКБ, P. freudenreichii, обладают иммунотропной активностью (в разной- степени), и это является про-., явлением одного из её пробйотических свойств. В исследований примени- i ли модель ex vivo, в которой оценивали образование цитокинов под дейст-. вием клеток исследуемых, штаммов классической ПКБ, а именно P. freudenreichii.
Экспериментальные данные представлены в таблицах 7 и 8. Приведены данные одного из трёх незавимых экспериментов, результаты которых различались в пределах 10%. Можно видеть, что для двух цитокинов (ИЛ1-РА, ИЛ-8) эффект стимуляции обратно зависел от концентрации препаратов. То же наблюдалось и для ИНФ-г кроме вариантов с препаратами Рг 3 и Рг 6. В отношении ФНО-а эффект при низких концентрациях препаратов (2 мкг/мл) был выше, чем при 50 мкг/мл. Интерлейкины ИЛ 2 и ИЛ 10, участвующие в противовоспалительных процессах, обнаружены не были. Стимуляция синтеза цитокинов клетками ПКБ как правило значи-. тельно превышала таковую препаратом «Иммунал». Исключение составило показание по образованию ИЛ-6 и ИЛ-8: «Иммунал» в концентрации 300 мг/мл действовал сильнее, чем препараты штаммов Рг 1 - Рг 7 при кон центрации 50 мкг/мл. Результаты были получены в трёх независимых опытах при трёхкратных повторностях отдельных измерений.
Индекс стимуляции образования цитокинов клетками ПКБ (ИС, см. раздел «Объекты и методы») в некоторых случаях значительно превышал таковой препарата «Иммунал» (табл. 8). Четыре цитокина синтезировались более интенсивно под действием клеток ПКБ по сравнению с контролем. Наибольший ИС, на два порядка превышающий таковой в контроле выявлен в отношении цитокина ФНО-а.
На рисунке 12 представлены данные по ИС для интерферона ИФ-г, полученные при использовании препаратов ПКБ в двух концентрациях. Можно видеть, что эффект стимуляции иммунной активности зависит от концентрации препаратов Рг 1 - Рг 7.
Действие исследуемых препаратов было различным. Наибольший эффект показали препараты Рг 1 и Рг 2. Штаммы Рг 4, 5 и 7 были более активны относительно контроля при низкой концентрации биомассы (2 мкг/мл). Штаммы Рг 3 и Рг 6 действовали на уровне контроля.
Таким образом, для исследуемых в данной работе штаммов Р. freudenreichii показали, что они индуцируют синтез разных цитокинов и в разной степени в цельной крови. Наибольший эффект нативных клеток ПКБ проявился в системе ex vivo в отношении образования интерлейкина ФНО. В целом полученные данные по стимуляции синтеза цитокинов в крови человека свидетельствуют о том, что клетки классических (молочных) ПКБ обладают иммуногенными (иммунотропными) свойствами, т. е. способны воздействовать на иммунную систему. Последнее важно для их пробиотических свойств, и в определённой мере (частично) объясняет положительное влияние P.freudenreichii на макроорганизм (см. часть 2.1).
Полученные результаты согласуются с данными, имеющимися в научной литературе. Так, показано ex vivo, что клетки P. Freudenreichii вызывают апоптоз клеток колоректальной аденомы при их контакте [Jan, 2004]. Механизм действия практически не изучен. Эффект может быть обусловлен сигнальными молекулами, в том числе, вероятно, ЛЖК. Во всяком случае, пропионовая кислота имеет неоднозначную функцию: антимикробный фактор, субстрат для питания эпителия ЖКТ, эффектор иммунной системы [Белобородова, Белобородов, 2000].
Имеются и другие данные о воздействии классических ПКБ на иммунную систему животного. Так, индуцированный колит у крыс под действием классической P. acidipropionici, введённой в прямую кишку с помощью катеттера, в значительной степени был ослаблен; при этом улучшалось общее состояние животных, снижались воспалительные симптомы, усиливалось всасывание ЛЖК [Michel et al., 2004]. Живые и убитые клетки P. jensenii 702, которую рассматривают в настоящее время в качестве эубиотика, усиливала гуморальный иммунный ответ (уровень иммуноглобулинов в крови) у мышей на введение через рот жидкой культуры Mycobacterium tuberculosis. Кроме того, выявлены адьювантные свойства P. jensenii 702 для вакцины (М tuberculosis) в отношении пролонгации и активности (по цитокинам) Т-лимфоцитов [Adams et al. 2004; Adams, Huang, 2008].
Отметим, что в наших экспериментах были использованы клетки ПКБ, отделённые от их экзометаболитов, которые содержатся в культу-ральной жидкости. Поэтому стоит вопрос о механизме иммуногенного действия этих клеток, когда они присутсттвуют в естественном ЖКТ. Для проявления эффекта они каким-то образом (с помощью сигнальных молекул эпителия? или в результате действия следов ЛЖК) должны взаимодействовать с иммунокомпетентными клетками крови.
На изолированных мононуклеарных клетках крови человека (в системе in vitro) показана способность клеток разных бактерий, в том числе Р. freudenreichii ssp. shermanii JS (DSM 7067, PJS), взятых в соотношении 1:1 (клетки бактерий: моноциты), индуцировать синтез цитокинов. Эта спо собность сильно варьировала у разных штаммов бактерий [Kekkonen et al., 2008].
Следовательно, иммунотропными свойствами штаммы классической Propioibacterium freudenreichii обладают.
Разработка способов применения P. freudenreichii для защиты пшеничного хлеба от «картофельной болезни», вызываемой развитием бацилл
Выше (см. Результатами обсуждение, 2.5) мы показали, что исследуемые штаммы P. Jreudenreichii (Pfr), выделяя в среду пропионовуюки-слоту/пропионаты и бактериоцин-подобные вещества (БПВ), эффективно подавляют развитие бацилл: В. siibtilis и В. cereus. Именно эти гнилостные бактерии ответственны» за порчу пшеничного хлеба, вызывая его «картофельную болезнь» (КБ).
Традиционная микробиологическая защита хлеба состоит в ведении в дрожжевое тесто молочнокислых бактерий. Молочная кислота (и низин) препятствуют развитию гнилостной микробиоты, однако действуют они только в кислых условиях (рН 3,5 - 4,5). Пропионаты и БПВ, как мы наблюдали, в отличие от лактатов активны в нейтральной среде, хотя и в кислой среде пропионовая кислота в сочетании с уксусной, по литературным сведениям, - более сильный АНМФ, чем молочная [Taniguchi et al., 1998]. При этом ранее в нашей лаборатории было показано, что S. cerevisiae -стартерная, культура в производстве пшеничного хлеба, подобно МКБ проявляет устойчивость к пропионату [Данилова и др., 2006]. Всё это делает перспективным применение ПКБ для защиты хлеба от гнилостной микробиоты. Важно также то, что Pfr, в отличие от МКБ, образует ряд веществ: стимуляторов, ароматизаторов и нутрицевтиков-метабиотиков (см. табл. 1), которые обогащают хлеб, среди них витамины группы В, в том числе фолиевая кислота и витами B]2.
В Обзоре литературы описаны ранние исследования, разработки и испытания в производственных условиях, направленные на применение ПКБ для защиты хлеба. Общим заключением явилось то, что ПКБ целесообразно использовать для этой цели. Задача состоит в разработке экономичного и удобного для производства способа внесения ПКБ в тесто перед замешиванием и инкубированием дрожжей (обычно около 1,5 ч).
В предварительных исследованиях мы установили технологически значимые параметры действия исследуемых ПКБ в защите пшеничного хлеба от КБ. Были определены действующие концентрации пропионата натрия (90% подавление развития бацилл) на мучной среде. Они оказались более высокими, чем на пСС-А,Б. Вместе с тем, стало понятным, что чем «богаче» среда, тем выше действующая концентрация пропионата, что не является неожиданным. Пропионаты в мучной среде эффективны против бацилл в концентрации 0,24 - 0,30 %. Далее подтвердили, что культураль-ная жидкость P. freudenreichii действительно эффективно (на 90%) подавляет развитие бацилл при условии её внесения в мучную среду в количестве не менее 20 об.%. Измерение концентрации ЛЖК показало, что при этом в мучной среде содержится 0,183% пропионата и 0,09% ацетата натрия, и этого оказалось достаточно для подавления прорастания спор бацилл. Наконец, учитывая безопасность классических ПКБ и их потенциальную пробиотическую значимость для человека, предложили не отделять клетки от культуральнои жидкости, а использовать цельные культуры для внесения в тесто. Результаты представлены на рисунках 20 и 21.
В качестве модельной мучной среды использовали водный экстракт оМПЗ, обработанной амилолитическими ферментами (ЭМС). Как видно из полученных результатов (рис. 20), 90% подавление роста В. subtilis достигалось при концентрации пропионата 0,2 % при разном количестве вводимых спор (от 25 до 250 спор/мл среды). Такое количество спор бацилл обычно обнаруживают в пшеничной муке второго сорта. Споры В. cereus оказались более устойчивыми к пропионату, чем споры В. siibtilis.
Для исследования влияния экзометаболитов P. freudenreichiii на рост В. siibtilis была использована культуральная жидкость (КЖ) 4-х суточной культуры ПКБ, выращенной на ГКС. Результаты исследования (рис. 21) показали, что действие КЖ почти не зависит от количества внесенных спор в пределах 25- 250 (спор/мл). При внесении КЖ (20% об./об.) к ЭМС, содержащую споры бацилл, наблюдали 90%-ное подавление роста В. siibtilis (концентрация пропионата в среде - менее 0,2% ). Можно видеть, что КЖ Pfr оказывает даже немного более сильное действие на рост В, subtilis, чем химический пропионат натрия в той же концентрации. Возможно, культуральная жидкость содержит и другие вещества, подавляющие рост бацилл. Ими могут быть соли уксусной кислоты, диацетил, бактериоцины.
Способы введения пропионовокислых бактерий в пшеничное тесто для достижения защитного эффекта
1) Культуру P. freudenreichii можно вырастить на одной из подходящих для применения в производстве хлеба сред, желательно пищевой и обеспечивающей эффективный рост биомассы и образование ЛЖК; затем, не отделяя клетки, культуру (клетки ПКБ + экзометаболиты в КЖ) ввести в дрожжевое тесто при замесе. К таким средам относятся, во-первых, ГКС или пСС-Б и во-вторых, вновь разработанные в нашей лаборатории натуральные среды, представляющие собой: А. - обогащенную кукурузным экстратом (2%) лактозную сыворотку (для штамма Рг 2); обезжиренное молоко, обогащенное кукурузным или дрожевым экстрактом, после предварительного культивирования одной из МКБ: L. acidophilus, L. bulgaricus, L. helveticus или S. thermophilus (образование ПК до 1,4%); Б. - обогащенный экстракт мучной среды (ЭМС) с добавлением дрожжевого экстракта и других компонентов: гидролизата казеина и глюкозы, (результаты получены в совместной работе с магистрантом кафедры микробиологии МГУ Мао Юй-Бинь в 2007-2008 гг.). Выращенные культуры можно вводить в тесто в количестве 20% без отделения клеток, но при 10-кратном концентрировании для достижения защитного эффекта (0,2 - 0,3 % пропионата Na к массе теста) в него достаточно ввести всего один-два процента препарата. Понятно, что эти способы не являются экономичными и удобными, т. к. среды достаточно дорогие, и требуется отдельное, независимое от хлебозаводов, производство препаратов ПКБ.
2) Привнесение в тесто компонентов той или иной среды, на которой выращена ПКБ, может и не ухудшать органолептические свойства теста (хлеба), однако само по себе обогащение хлеба дополнительными компонентами способствует росту бацилл и приводит к необходимости повышения концентраций пропионата-Na. Поэтому был разработан способ приготовления препарата ПКБ, свободного от ростовой среды.
Культуру P. freiidenreichii штамм Рг 4, выращенную в течение 96 часов на среде В (1 литр), центрифугировали (4000 об./мин, 20 минут), клетки суспендировали в водном растворе глюкозы (4 %, вода водопроводная, нестерильная) до концентрации клеток, равной 2,7 - 3,0 г АСБ в 100 мл раствора, и инкубировали (37С) при периодической нейтрализации кислот (через 2 часа и более, ночь) до полного прекращения подкисления раствора. Подкисление происходило в течение 72 часов. В результате была получена суспензия клеток ПКБ в водном растворе пропионата с концен-трайией 2,8 - 3,0 % (+ ацетат, соотношение 2:1, и остаточная глюкоза). А это означает, что при 10-кратном концентрировании суспензии клеток в водном растворе ЛЖК, достаточно введения примерно 1% этого препарата к весу (или объему) теста, чтобы достигнуть эффективной защиты хлеба от «картофельной болезни».
Данные, приведенные в таблице-схеме 15, показывают различие в сроках хранения пшеничного хлеба, выпеченного (в условиях лаборатории ГосНИИ ХП) с добавлением (и без добавления - контроль) в тесто препаратов ПКБ. Препараты не концентрировали, а вносили в тесто в количестве 10% к массе муки. Производили пробную выпечку в стандартных условиях. Хлеб выдерживали в камере ускоренного старения (100% относительной влажность при температура 37С).
