Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы.
Пропионовокислые бактерии: метаболизм и корриноиды 7
Глава 2.Объекты, методология и методы исследований 23
Глава 3. Ионы кобальта и кобаламин в физиологии Propionibacterium freudenreichii в «жестких» условиях существования 41
Глава 4. Изменения в физиологии P. freudenreichii при лимитировании по ионам кобальта в среде и дефиците корриноидов в клетках 68
Глава 5. Изучение процесса образования ДНК, происходящего в клетках P. freudenreichii при участии кобаламина 108
Глава 6. Альтернативная рибонуклеотидредуктаза P. freudenreichii, функционирующая в анаболизме ДНК без участия кобаламина 142
Глава 7. Регуляция кобаламином системы рибонуклеотидредуктазы P. freudenreichii 167
Глава 8. Практически значимые аспекты работы 173
Глава 9. Общее заключение 193
Выводы 213
Список литературы 215
- Пропионовокислые бактерии: метаболизм и корриноиды
- Ионы кобальта и кобаламин в физиологии Propionibacterium freudenreichii в «жестких» условиях существования
- Изучение процесса образования ДНК, происходящего в клетках P. freudenreichii при участии кобаламина
- Регуляция кобаламином системы рибонуклеотидредуктазы P. freudenreichii
Введение к работе
Широкие и разнообразные физиолого-биохимические возможности прокариот, определяющие их жизнеспособность в изменяющейся среде, хорошо известны и рассматриваются как проявление периода эволюции организмов на уровне химии живой клетки. Это представление возникло и сформировалось при изучении энергодающих процессов и путей ассимиляции углерода, вариабельность которых зависит от действия существенного (критического) фактора внешней среды (свет, молекулярный кислород, источник углерода и т. д.), но и в настоящее время происходит расширение представления о пластичности метаболизма прокариот [Madigan et al., 1997; Lengeler et al., 1999]. Так, открываются новые возможности фотосинтезирующих бактерий в отношении ассимиляции С2 соединений [Ivanovsky et al., 1997]; вариабельность дыхательной цепи при катаболизме С1 соединений облигатными аэробными метилобактериями [Muntyan et al., 2002]; неоднотипность нитрогеназ азотфиксирующих бактерий [Якунин и др., 1991]. Одна и та же, существенная для метаболизма биохимическая реакция, ведущая к образованию центроболита, у прокариот может быть катализирована разными по строению активного центра (альтернативными), но изофункциональными ферментами.
Сигналом для перестроек в метаболизме обычно служит критический фактор внешней и(или) внутренней среды клетки, определяющий реализацию метаболического пути, детерминированного геномом. Перестройки метаболизма прокариот - суть проявление биологического разнообразия на уровне многообразия типов обмена, которое является отражением их адаптации и эволюционного движения.
Корриноиды - особые тетрапирролы древнего происхождения, отличающиеся химической и биохимической полифункциональностью. Известно более 30 анаэробных реакций с участием витамина BJ2, который,
вероятно, служил биокатализатором широкого спектра действия у древних, примитивных организмов, но распространён в обмене веществ современных про- и эукариот [Рыжкова (Иордан), 2003]. Кобальт как центральный атом молекул корриноидов контролирует и стимулирует синтез корриноидов у некоторых прокариотических организмов.
Проблема биологической роли корриноидов и их высокого содержания в клетках ряда прокариотических организмов была поставлена в середине прошлого столетия [Barker et al., 1958; Weisbach et al., 1959]. Co временем находили всё новые биохимические реакции и ферментные системы, вовлекающие корриноиды, но эти открытия не приводили к объяснению значения больших количеств корриноидов для физиологии (метаболизма) тех или иных естественных продуцентов. Причина, как нам представляется, лежала в сфере научной идеологии (методологии): в редукционизме, ведущем, как известно, к детализации знания и не позволяющем подняться на уровень более широкого обобщения [Заварзин, 1995; Карпинская и др., 1995].
Пропионовокислые бактерии, известные с начала прошлого века и выделяемые из естественной среды в настоящее время, представляют собой компактную филогенетическую линию. В научном плане они интересны как организмы, неоднозначно относящиеся к молекулярному кислороду и образующие в норме большие количества корриноидов.
Поистине многогранна их практическая значимость как биофакторов (биологических добавок), применяемых в пищевой промышленности и сельском хозяйстве, а также в производстве биологически активных веществ. Определённые виды и штаммы имеют большое коммерческое значение. Биологии бактерии, ответственной за созревание «твёрдых» сыров (Р. freudenreichii subsp. shermann) посвящаются международные симпозиумы.
До нашего исследования представление о биологической роли витамина Ві2 в жизнедеятельности пропионовокислых бактерий ограничивалось двумя биохимическими реакциями, протекающими с его
участием и не вовлекающими молекулярный кислород. Высказывалось мнение, что причиной высокого уровня накопления корриноидов в клетках является дерегуляция биосинтеза. Наряду с этим существовала и крайне противоположная точка зрения: метаболизм P. freudenreichii «настроен» исключительно на высокое содержание корриноидов в клетках [Вороьёва, 1995]. Вместе с тем биология пропионовокислых бактерий в последнее время представляется уже как дуалистичная.
Предлагаемая нами концепция состоит в том, что для жизнедеятельности пропионовокислых бактерий, в частности Propionibacterium freudenreichii, витамин В12 - больше, чем участник той или иной биохимической реакции. Это «ось, стержень» метаболизма, фактор обратимой его перестройки или, другими словами, внутренний критический фактор (а ионы кобальта - внешний), определяющий развитие и выживание организма в изменяющейся среде.
Актуальность проблемы и её научное значение. В последнее десятилетие значительно расширилось представление о роли корриноидов в биологии прокариотических организмов. Они вовлечены в такие центральные метаболические процессы, как пропионовокислое брожение, метаногенез, гомоацетогенез, сульфатредукция, синтез метионина, синтез дезоксирибозильных предшественников ДНК и многие другие. К настоящему времени открыто и изучено более тридцати биохимических реакций, катализируемых ферментами, использующими кобамиды как коферменты или простетические группы [Рыжкова (Иордан), 2003], в то время как десятилетие назад таких ферментов было известно чуть более десяти; кроме того, выявляются некоферментные функции корриноидов в клетках.
Изучение физиологии P. freudenreichii в связи с её удивительной способностью к образованию корриноидов в больших количествах - ключ к пониманию новых особенностей биологии организма, его статуса в эволюции, расширению представления о биологическом разнообразии в мире
прокариот в целом на уровне метаболизма и целенаправленному использованию.
Итак, открытия новых биологических функций корриноидов продолжается. Регулярно проблемам биогенеза и функциям корриноидов посвящаются международные конференции, последняя из которых происходила в 1996 году в Австрии.
Научный интерес представляет обнаружение новых факторов антиоксидантной защиты клетки, среди которых, исходя из присущих ему химических свойств, мог бы оказаться и витамин BJ2. Все известные корриноидные ферменты катализируют реакции, протекающие без участия кислорода, что, вероятно, отражает их роль как древних биокатализаторов у примитивных анаэробных организмов. Биокатализы с участием аденозилированных кобамидов - свободнорадикальные превращения в активных центрах ферментов. Биосинтез корринового ядра у анаэробов и микроаэрофилов инактивируется молекулярным кислородом, но некоторые аэробные бактерии синтезируют кобаламин уже вовлекая кислород, т. е. биогенез корриноидов эволюционирует.
Несмотря на обнаружение всё новых биохимических функций витамина В^ в жизнедеятельности прокариот проблема высокого естественного уровня его образования некоторыми бактериями и археями в связи с их биологией сохранялась. Она актуальна в связи с выявлением и объяснением действия неизвестных ранее факторов, контролирующих метаболические пути и участвующих в поддержании гомеостаза прокариотических клеток.
Пропионовокислые бактерии привлекают постоянный научный интерес неоднозначностью метаболизма, в частности, по отношению к молекулярному кислороду. Исходя из основного способа получения энергии (пропионовокислое брожение) и способности развиваться при доступе кислорода, ранее их считали аэротолерантными анаэробами, но сейчас относят к микроаэрофилам или факультативным анаэробам. Причём среди
видов рода Propionibactehum имеются как тяготеющие к анаэробиозу (Р. freudenreichii), так и имеющие тенденцию (достаточно развитое кислородное дыхание) к аэробиозу (P. jensenii). Параллельный актуальный вопрос заключается в том, каким образом бактерия обеспечивает свою аэротолерантность. В этом направлении уже проделана определённая исследовательская работа [Воробьёва, 1958; Buchanan, Gibeons, 1974; Краева, Воробьёва, 1981; Воробьёва и др., 1986], однако экспериментальные данные и доводы, приводимые в настоящей работе, расширяют рамки известного ранее.
Актуальной является проблема пластичности анаболических процессов у прокариот, о которой известно значительно меньше, чем о вариабельности энергодающих процессов, но представление о роли альтернативных ферментов в анаболизме бактерий, в том числе в образовании ДНК, расширяется. Вместе с тем давно известно и продолжает изучаться такое явление, как метаболическое лимитирование экспрессии генов в генетически (и физиологически) нормальных клетках бактерий [Головлёв, 1985; Головлёв, Головлёва, 2000]. Выявление и изучение метаболического лимитирования биохимических реакций, а также естественной модификации (перестройки) метаболизма прокариот под действием факторов внешней (и внутренней) среды, необходимо в связи с тем, что в последние годы активно развивается метаболическая инженерия. В задачи этого нового направления биотехнологии входят, с одной стороны, оптимизация экспрессии генов, а с другой, - целенаправленная переориентация потоков вещества (энергии), что необходимо для повышения эффективности микробиологических производств [Дебабов, 1999; Машко и др., 2002].
Пропионовокислые бактерии имеют многоплановое практическое (коммерческое) значение. Достаточно напомнить, что это основные биоагенты в мировом производстве «твёрдых» сыров. Поэтому физиология (как и генетика) этих бактерий, и, прежде всего P. freudenreichii subsp. shermanii, находится под постоянным «прицелом» специалистов разных
профилей. Изучение физиологии бактерии в связи с её удивительной способностью к образованию корриноидов (в больших количествах) могло дать ключ к пониманию особенностей биологии данного организма, его статуса в эволюции, биологического разнообразия на уровне метаболизма и более эффективному использованию. Новый взгляд на физиологическую роль корриноидов на примере пропионовокислой бактерии неизбежно ускорил бы объяснение таковой у других прокариотических организмов, обладающих подобной способностью.
Пропионовокислые бактерии: метаболизм и корриноиды
Проблема биологической роли корриноидов и их высокого содержания в клетках ряда прокариотических организмов была поставлена в середине прошлого столетия [Barker et al., 1958; Weisbach et al., 1959]. Co временем находили всё новые биохимические реакции и ферментные системы, вовлекающие корриноиды, но эти открытия не приводили к объяснению значения больших количеств корриноидов для физиологии (метаболизма) тех или иных естественных продуцентов. Причина, как нам представляется, лежала в сфере научной идеологии (методологии): в редукционизме, ведущем, как известно, к детализации знания и не позволяющем подняться на уровень более широкого обобщения [Заварзин, 1995; Карпинская и др., 1995].
Пропионовокислые бактерии, известные с начала прошлого века и выделяемые из естественной среды в настоящее время, представляют собой компактную филогенетическую линию. В научном плане они интересны как организмы, неоднозначно относящиеся к молекулярному кислороду и образующие в норме большие количества корриноидов.
Поистине многогранна их практическая значимость как биофакторов (биологических добавок), применяемых в пищевой промышленности и сельском хозяйстве, а также в производстве биологически активных веществ. Определённые виды и штаммы имеют большое коммерческое значение. Биологии бактерии, ответственной за созревание «твёрдых» сыров (Р. freudenreichii subsp. shermann) посвящаются международные симпозиумы.
До нашего исследования представление о биологической роли витамина Ві2 в жизнедеятельности пропионовокислых бактерий ограничивалось двумя биохимическими реакциями, протекающими с его участием и не вовлекающими молекулярный кислород. Высказывалось мнение, что причиной высокого уровня накопления корриноидов в клетках является дерегуляция биосинтеза. Наряду с этим существовала и крайне противоположная точка зрения: метаболизм P. freudenreichii «настроен» исключительно на высокое содержание корриноидов в клетках [Вороьёва, 1995]. Вместе с тем биология пропионовокислых бактерий в последнее время представляется уже как дуалистичная.
Предлагаемая нами концепция состоит в том, что для жизнедеятельности пропионовокислых бактерий, в частности Propionibacterium freudenreichii, витамин В12 - больше, чем участник той или иной биохимической реакции. Это «ось, стержень» метаболизма, фактор обратимой его перестройки или, другими словами, внутренний критический фактор (а ионы кобальта - внешний), определяющий развитие и выживание организма в изменяющейся среде.
Актуальность проблемы и её научное значение. В последнее десятилетие значительно расширилось представление о роли корриноидов в биологии прокариотических организмов. Они вовлечены в такие центральные метаболические процессы, как пропионовокислое брожение, метаногенез, гомоацетогенез, сульфатредукция, синтез метионина, синтез дезоксирибозильных предшественников ДНК и многие другие. К настоящему времени открыто и изучено более тридцати биохимических реакций, катализируемых ферментами, использующими кобамиды как коферменты или простетические группы [Рыжкова (Иордан), 2003], в то время как десятилетие назад таких ферментов было известно чуть более десяти; кроме того, выявляются некоферментные функции корриноидов в клетках.
Изучение физиологии P. freudenreichii в связи с её удивительной способностью к образованию корриноидов в больших количествах - ключ к пониманию новых особенностей биологии организма, его статуса в эволюции, расширению представления о биологическом разнообразии в мире прокариот в целом на уровне метаболизма и целенаправленному использованию.
Итак, открытия новых биологических функций корриноидов продолжается. Регулярно проблемам биогенеза и функциям корриноидов посвящаются международные конференции, последняя из которых происходила в 1996 году в Австрии.
Научный интерес представляет обнаружение новых факторов антиоксидантной защиты клетки, среди которых, исходя из присущих ему химических свойств, мог бы оказаться и витамин BJ2. Все известные корриноидные ферменты катализируют реакции, протекающие без участия кислорода, что, вероятно, отражает их роль как древних биокатализаторов у примитивных анаэробных организмов. Биокатализы с участием аденозилированных кобамидов - свободнорадикальные превращения в активных центрах ферментов. Биосинтез корринового ядра у анаэробов и микроаэрофилов инактивируется молекулярным кислородом, но некоторые аэробные бактерии синтезируют кобаламин уже вовлекая кислород, т. е. биогенез корриноидов эволюционирует.
Несмотря на обнаружение всё новых биохимических функций витамина В в жизнедеятельности прокариот проблема высокого естественного уровня его образования некоторыми бактериями и археями в связи с их биологией сохранялась. Она актуальна в связи с выявлением и объяснением действия неизвестных ранее факторов, контролирующих метаболические пути и участвующих в поддержании гомеостаза прокариотических клеток.
Пропионовокислые бактерии привлекают постоянный научный интерес неоднозначностью метаболизма, в частности, по отношению к молекулярному кислороду. Исходя из основного способа получения энергии (пропионовокислое брожение) и способности развиваться при доступе кислорода, ранее их считали аэротолерантными анаэробами, но сейчас относят к микроаэрофилам или факультативным анаэробам. Причём среди видов рода Propionibactehum имеются как тяготеющие к анаэробиозу (Р. freudenreichii), так и имеющие тенденцию (достаточно развитое кислородное дыхание) к аэробиозу (P. jensenii). Параллельный актуальный вопрос заключается в том, каким образом бактерия обеспечивает свою аэротолерантность. В этом направлении уже проделана определённая исследовательская работа [Воробьёва, 1958; Buchanan, Gibeons, 1974; Краева, Воробьёва, 1981; Воробьёва и др., 1986], однако экспериментальные данные и доводы, приводимые в настоящей работе, расширяют рамки известного ранее.
Ионы кобальта и кобаламин в физиологии Propionibacterium freudenreichii в «жестких» условиях существования
Интенсивность характерного сигнала электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), возникающего в процессе функционирования AdoCbl-зависимой РНРазы, была прямо пропорциональна активности фермента, измеряемой другими методами, и по значению g-фактора соответствовала свободнорадикальным состояниям известных AdoCbl-зависимых ферментов. Фактор g - безразмерная величина, зависимая от электронной структуры свободного радикала и его электронного окружения, находится в соответствии с моментом резонансного поглощения энергии переменного магнитного (СВЧ) поля неспаренным электроном при плавном изменении напряженности постоянного магнитного поля. Он выводится из формулы g = PHo/hf, где р - магнетон Бора, Но - напряжённоость постоянного магнитного поля, hv - энергия переменного магнитного поля (постоянная Планка и частота).
Интенсивность ЭПР-сигнала, представляющего собой радикальный синглет с g-фактором 2,0036, возрастала прямо пропорционально концентрации субстрата (АДФ) для РНРазы и зависела также от концентрации AdoCbl в реакционной смеси. Поэтому регистрацию интенсивности ЭПР-сигнала использовали как один из методов измерения активности AdoCbl-зависимой РНРазы, но ограничением для применения этого метода являлось «дорогое машинное время».
Работу проводили на радиоспектрометре ER 220D фирмы "Bruker" (Германия) в Лаборатории основ действия радиации и биологически активных веществ на клетку Института химической физики им. Н.Н.
Семёнова РАН. Образцы для ЭПР-спектрометрии, представляющие собой сконцентрированные суспензии клеток или бесклеточные препараты, замороженные в жидком азоте, готовили по методике, предложенной Л.К. Пулатовой с сотр. [Пулатова и др., 1986; Гудцова и др. 1987].
Поглощение молекулярного кислорода в PHP-реакции измеряли полярографически с использованием закрытого электрода (тип Кларка). Полярографическая ячейка объёмом 1,5 мл содержала: 1) 70 мМ трис-НС1 (рН 7,0 - 7,2), 15 мкМ AdoCbl и диализованный гомогенат полноценных по содержанию корриноидов клеток (Сог+, 6 мг по белку); 2) 70 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 2,5. мМ Mg-ацетат и диализованный гомогенат дефицитных по содержанию корриноидов (Сог=, 6 мг по белку). Растворы были насыщены кислородом (350 нмолей 02 в 1,5 мл, 35С).
В полярографическую ячейку с растворами 1 или 2 последовательно вводили следующие соединения (конечные концентрации, мМ): дитиотреитол (/ЦТ) - 12; АДФ, (1) 0,7 - 0,8 и (2) 2,5 - 3,0; гидроксимочевину (ГМ, «Sigma», США), 5 - 10.
Поглощение Ог регистрировали по уменьшению его содержания в ячейке с помощью электрода и самописца; выражали в нанамолях поглощённого Ог на мг белка. С целью увеличения количества фермента в клетках применяли экспозицию растущих культур бактерии (варианты Сог+ и Cor", см. глава 6) с блеомицином А5 в течение 4 часов роста (оптимальная концентрация - 0,4 мг.л"1). При этом условии достигали увеличения количества РНРазы в 2,5 - 3 раза по сравнению с клетками без воздействия блеомицина. Блеомицин, как и другие антибиотики, подавляющие биосинтез ДНК, а также налидиксовую кислоту, используют для увеличения количества РНРазы в клетках, основываясь на установленном факте: при специфическом подавлении биосинтеза ДНК (любым способом) происходит дерепрессия синтеза апофермента РНРазы [Filpula, Fuchs, 1977; 1978].
Блеомицин оказывает сложное воздействие на клетку, которое в настоящее время изучается. Он препятствует биосинтезу ДНК как интеркалятор в матрицу, вызывающий одиночные и двойные разрывы в молекуле [Овчинников, 1987; Ляпунова и др., 1989]. БЛ как хелатирующее соединение может содержать металл. В этом случае деструкция ДНК происходит и без встраивания БЛ в ДНК в результате её разрушения активными (токсичными) формами кислорода, которые возникают вследствие одноэлектронного восстановления О2 металлом (Fe2+, Си ), ассоцированным с блеомицином [Abracham et al., 2001]. Вместе с тем БЛ как комплекс с Ог (БЛ-О2) использовали для активирования металлофермента, а именно содержащей марганец РНРазы Corynebacterium ammoniagenes, активность которой стимулирует Ог [Aiding, Follmann, 1994]. Сопутствующее образование свободного радикала 02" является нормой реакции; удаление супероксида в клетках происходит при участии супероксиддисмутазы [Eliassonetal., 1986].
Выделение и очистку рибонуклеотидредуктаз проводили из цельных диализованных гомогенатов (экстрактов) клеток, которые предварительно обрабатывали сульфатом стрептомицина (1,5 - 2,0 %, 40 мин при 0 - 6С) с целью удаления нуклеиновых кислот [Oxenburg, Snoswell, 1965; Скоупс, 1995; Rieraetal., 1997].
Для начшіьного фракционирования белков применяли анионную неколоночную хроматографию (так называемая batch-процедура) на ДЕАЕ-целлюлозе (Whatman 52) при ступенчатом градиенте концентрации КС1. Далее, после концентрирования препарата на мембранах РМ 30 или РМ 10 в системе «Amicon», Голландия (10С), проводили рехроматографию белков (скорость потока 0,8 - 1,0 мл.мин 1, температура 20С) при линейном градиенте концентрации КС1 на анионообменной колонке Mono Q H/R 5/5 в системе FPLC («Pharmacia-LKB», Швеция).
Работу с применением FPLC выполняли в Отделе функциональной биохимии биополимеров Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова
Для измерения молекулярной массы (Мг) исследуемых ферментов применяли метод гель-фильтрации на калиброванной колонке Superose 6 HR 10/30 в системе FPLC («Pharmacia-LKB», Швеция) при необходимом условии измерения активности фермента во фракциях. Для калибрования колонки использовали следующие белки-маркёры: цитохром с (12,4 кДа, «Sigma», США), ингибитор трипсина из сои (21,5 кДа, «Reanal», Венгрия), овальбумин (45 кДа, «Reanal», Венгрия), бычий сывороточный альбумин (БСА) и димер БСА (68 и 136 кДа соответственно, «Serva», Германия). Разделение белков по молекулярным массам методом гель-фильрации осуществляли при комнатной температуре со скоростью 0,2 мл. мин"1. Объём собираемой фракции составлял 800 мкл. Молекулярную массу (Mr) определяли по калибровочной кривой в осях lgM/K-Av, где KAv -относительная подвижность белка, вычисляемая по формуле: KAV = (Ve - VG) : (VT-V0): Ve - объём выхода белка, VD - объём выхода голубого декстрана, Vx -объём колонки.
Изучение процесса образования ДНК, происходящего в клетках P. freudenreichii при участии кобаламина
В литературе отсутствуют сведения об участии кобаламина в ферментных системах собственно репликации хромосомы, которые достаточно полно изучены к настоящему времени. Поэтому для выявления точек его приложения к процессу образования ДНК в клетках, для объясения причин участия кобаламина в тотальном синтезе ДНК бактерии, исследовали возможность вовлечения кобаламина в формирование предшественников ДНК (рис. 26), а также в её метилирование.
Биосинтез тимидилата из дезоксирибоуридилата катализирует тимидилатсинтаза (ТМСаза, КФ 2.1.1.45), независимый от кобаламина фермент, но в тимидилатсинтазной (ТМС) реакции непосредственно участвует тетрагидрофолат, а именно 5,10-метилен-ТГФ, который служит одновременно и восстановителем в реакции, и донором С1 фрагмента [Андреева, 1974;Bachmannetal., 1983; Allen etal., 1993]. Свободный тетрагидрофолат может быть регенерирован только в сопряженной метионинсинтазной реакции, поскольку реакция восстановления 5,10-метилен-ТГФ до метил-ТГФ (МеТГФ), катализируемая соответствующей редуктазой, необратима. Кроме того, вероятно, конкурентно происходит активный «отток» 5,10-метилен-ТГФ на синтез пуринов, что лимитирует и ТМСазу, и образование МеТГФ [Дэгли, Никольсон, 1973; Андреева, 1974; Канопкайте, Рачкус, 1991; Roth et al., 1996; Krautler, 1998(6)]. Этим определяется значение метионинсинтазной реакции, в том числе протекающей при участии кобаламина, в образовании тимидилата. В клетках изучаемой нами бактерии СЫ-зависимая метионинсинтаза (МСаза) функционирует [Skupin et al., 1970].
В отличие от трёх дезоксирибозильных предшественников ДНК: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, образование пула которых происходит только эндогенно из рибонуклеотидов в канале (комплексе ферментов) по основному метаболическому пути (рис. 27), дТТФ может быть образован и по запасному пути из экзогенного тимина [Pato, 1979; Mollgaard, Neuhard, 1983; Mathews, 1985].
Транспорт тимина до конца не изучен (возможен механизм переноса групп с участием фосфорибозил-1-пирофосфата). За формирование дезоксирибозильного тимидина и тимидилата (дТМФ) в клетке могут быть ответственны дезоксирибозилтрансфераза (транс-М-дезоксирибозилаза) [Cardinaud, 1978; Mollgaard, Neuhard, 1983] и нуклеозидфосфорилазы [Зинченко и др., 1989; Зинченко, 1992; Зинченко и др., 1998]. Фосфорилирование тимидина и тимидилата осуществляется собственными (специфическими) киназами [Cory, 1988].
В норме тимидилатсинтазная реакция не является скоростьлимитирующеи стадией в процессе образования ДНК, но синтез и активность ТМСазы могут быть скоординированы с таковыми первого специфического фермента анаболизма ДНК, рибонуклеотидредуктазы [Cory, Whitford, 1972; Bachmann et al., 1983; Cory, 1988].
Рибонуклеотидредуктаза (РНРаза, КФ 1.17.4-) ответственна за сбалансированное восстановление всех 4-х рибонуклеотидов: АТФ (АДФ), ГТФ (ГДФ), ЦТФ (ЦЦФ) и УТФ (УДФ) в соответствующие дезоксирибонуклеотиды. Это первая специфическая и, как считают, скоростьлимитирующая ступень в анаболизме ДНК, а фермент относят к генетическим [Elford, 1970; Cory, Whitford, 1972; Bachmann et al., 1983; Das et al., 1985; Hogenkamp et al., 1987; Cory, 1988; Chiu et al., 1992; Reichard, 1993; Lichtetal., 1996].
РНРаза не только обеспечивает дезоксирибозильные предшественники для синтеза ДНК, но метаболически контролирует скорость репликации на уровне инициации и элонгации репликации [Fuchs, Karlstrom, 1972; Ни et al., 1984; Cory, 1988; Brishwein et al., 1997] и её точность [Das et al., 1985]. РНРазу обнаруживают как в цитоплазме, так и в ДНК-мембранном комплексе бактериальных клеток; она входит в состав комплекса ферментов, участвующих в инициации репликации [Manwaring, Fuchs, 1979; Viswanathan, Noronha, 1979; Firshein, 1989; Laffan et al., 1990]. Незначительные изменения активности фермента немедленно отражаются на интенсивности образования ДНК в клетках [Sinha, Snustad, 1972; Lammers, Follmann, 1983; Reichard, 1985; Cory, 1988; Probst et al., 1989; Chiu et al.,1992; Fan et al., 1996; Brischwein et al., 1997], поэтому фермент используют как мишень противораковой терапии [Chiu et al., 1992; Fan et al., 1996].
Синтез РНРазы не является конститутивным в клеточном цикле: (cell cycle regulated enzyme) максимум синтеза фермента приурочен к началу репликации [Sun, Fuchs, 1992]. С другой стороны, результате «экстренной остановки» синтеза ДНК, например при подавлении полимеризации одним из специфически действующих антибиотиков (митомицина С, блеомицина и других), заметно возрастает синтез апофермента РНРазы, как и появление новых репликативных вилок в хромосоме [Filpula, Fuchs, 1977; 1978; Sun, Fuchs, 1992; Bianchi et al., 1997]. Это же происходит как следствие инактивирования РНРазы, например, при её недостаточности по коферменту [Ghamber, Blakley, 1966; Cowles et al., 1969; Иордан, 1990] или специфического ингибирования [Murphree, Moore, 1969]. Повышение уровня синтеза апофермента (дерепрессия синтеза РНРазы) в отсутствие кофермента В12 указывает на отсутствие в клетках бактерий других типов РНРазы, отличных от AdoCbl-зависимого фермента (см. далее).
Таков в целом биологический смысл РНРазы, катализирующей необратимую реакцию замещения ОН-группы при С2 рибозы нуклеотида на водород, происходящий из растворителя (воды) и переносимый через дитиол белка.
В естественную систему РНРазы in vivo входит дитиоловый низкомолекулярный ( 12 кДа) белок: тиоредоксин или глутаредоксин [Gleason, Holmgren, 1988]. Глутаредоксин рассматривают даже как отдельную специфическую субъединицу РНРазы [Holmgren, 1979]. В систему анаэробной РНРазы Е. coli входит флаводоксин [Reichard, 1993; Harder, 1993].
Регуляция кобаламином системы рибонуклеотидредуктазы P. freudenreichii
Первые данные о функционировании в клетках бактерии двух рибонуклеотидредуктаз, отличающихся отношением к коферменту-В (аденозилкобаламину), были получены нами ещё в 1975 году при использовании стандартной реакционной смеси [Иордан и др., 1975]. По мере снижения содержания суммарных корриноидов в клетках падала активность AdoCbl-зависимой РНРазы с восстановленным глутатионом (Гл-SH) в качестве восстановителя и возрастала альтернативная активность с НАДФН, но добавленный AdoCbl её подавлял (рис. 36). Эти данные указывали на присутствие в клетках бактерии двух РНРаз, различающихся отношением к кобаламину и донору водорода.
Условия реакции были оптимизированы (табл. 15), в результате чего обнаружились и другие функциональные отличия альтернативной РНРазы (а-РНРазы) от AdoCbl-зависимой: её рН-оптимум составлял 7,9 - 8,0 (вместо 7,0), ионы магния стимулировали активность. Наибольшую активность фермент проявлял в препаратах клеток бактерии, которую культивировали (более 20-ти пересевов) на среде, дополнительно очищенной от ионов кобальта (см. главу 2). При этом остаточное содержание корриноидов в клетках составляло менее 2 мкг.г 1 АСБ (вариант Сог=). В таблице 16 представлены сравнительные данные, показывающие различие в проявлении активности РНРазы диализованными гомогенатами Сог+ и Сог= клеток, в том числе под влиянием AdoCbl.
Проявление альтернативной активности РНРазы с НАДФН однозначно указывает на функционирование в Сог= клетках тиоредоксина в качестве естественного восстановителя в PHP-системе. Тиоредоксин, как показано,/ участвует в РНР-системах многих организмов и восстанавливается с помощью НАДФН посредством ФАД-содержащей тиоредоксинредуктазы. Другой естественный восстановитель в РНР-реакции, глутаредоксин, требует, как известно, восстановленный глутатион [Gleason, Holmgren, 1988]. Исходя из представленных данных мы заключаем, что он не входит в систему независимой от кобаламина (альтернативной) РНРазы Р. freudenreichii. AdoCbl «выключает» а-РНРазу бактерии на уровне активности фермента. Данные об ингибировании кобаламином активности какой-либо РНРазы являются оригинальными, а в настоящем контексте они служат объяснению ингибирующего действия кобаламина на синтез ДНК в Сог клетках P. freudenreichii (см. рис. 23).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу различия естественных систем рибонуклеотидредуктазы в полноценных и 1 дефицитных по содержанию корриноидов клетках P. freudenreichii. Примечательно, что кинетика ингибирования активности а-РНРазы аденозилкобал амином носит S-образный характер (рис. 37), т. е. и здесь он проявляет кооперативный эффект, видимо, воздействуя на конформацию фермента (см. рис. 32). Эти данные указывают также на роль AdoCbl в регуляции процесса образования ДНК у бактерии. Для подхода к пониманию природы альтернативной (независимой от кобаламина) РНРазы P. freudenreichii необходимым явился ингибиторный анализ с использованием гидроксимочевины (ГМ) — тушителя свободного радикала тирозила, специфически и неконкурентно инактивирующей металлосодержащие «аэробные» гетеродимерные (R1-R2, класс I) РНРазы [Rozenkranz et al., 1966; Atkin et al., 1973; Karlsson et al.5 1992; Reichard, 1993; Harder, 1993; Auling, Follmann, 1994; Stubbe, 1998]. Свободный радикал тирозила служит предшественником тиилового радикала, непосредственно участвующего в модификации рибозы нуклеотида в дезоксирибозу. В отличие от AdoCbl-зависимой активность альтернативной РНРазы Р. freudenreichii подвержена ингибированию гидрокимочевиной (ГМ), но она устойчива к «внутреннему фактору» (IF). Данные, представленные на рисунке 38, показывают, что при 1 мМ концентрации ГМ достигается 50% ингибирование активности фермента. У бактерии P. jensenii (бывшая P. peterssonii), отличающейся низким естественным уровнем образования корриноидов и наиболее развитым кислородным дыханием среди ПКБ, гидроксимочевина вызывала 50% ингибирование активности РНРазы при концентрации 0,6 мМ и 100% ингибирование при концентрации 5 мМ (рис. 39). Наблюдаемый эффект гидроксимочевины послужил первым доводом в пользу представления об альтернативной РНРазе P. freudentreichii как металлосодержащем, зависимом от кислородом ферменте. Эти данные положительно коррелируют с ответом синтеза ДІЖ на введение в суспензию гидроксимочевины (см. рис. 25). Поэтому далее исследовали отношение активности а-РНРазы к молекулярному кислороду.
