Кобальт и корриноиды в биологии Propionibacterium freudenreichii Рыжкова, Евгения Петровна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Пропионовокислые бактерии: метаболизм и корриноиды 7

Глава 2. Объекты, методология и методы исследований 23

Глава 3. Ионы кобальта и кобаламин в физиологии Propionibacterium freudenreichii в «жестких» условиях существования 41

Глава 4. Изменения в физиологии P. freudenreichii при лимитировании по ионам кобальта в среде и дефиците корриноидов в клетках 68

Глава 5. Изучение процесса образования ДНК, происходящего в клетках P. freudenreichii при участии кобаламина 108

Глава 6. Альтернативная рибонуклеотидредуктаза P. freudenreichii, функционирующая в анаболизме ДНК без участия кобаламина 142

Глава 7. Регуляция кобаламином системы рибонуклеотидредуктазы P. freudenreichii 167

Глава 8. Практически значимые аспекты работы 173

Глава 9. Общее заключение 193

Выводы 213

Список литературы 215

• Пропионовокислые бактерии: метаболизм и корриноиды
• Ионы кобальта и кобаламин в физиологии Propionibacterium freudenreichii в «жестких» условиях существования
• Изменения в физиологии P. freudenreichii при лимитировании по ионам кобальта в среде и дефиците корриноидов в клетках
• Изучение процесса образования ДНК, происходящего в клетках P. freudenreichii при участии кобаламина

Введение к работе

Актуальность проблемы. Физиология прокариот - центральное направление микробиологии, формирующее целостное представление о жизнедеятельности организма. Изучение физиолого-биохимических свойств практически значимых микроорганизмов актуально в плане решения общечеловеческой задачи -улучшения качества жизни. Пропионовокислые бактерии (ПКБ) имеют разнообразное практическое применение. Достаточно напомнить, что Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii (далее - P. freudenreichii) -основная и незаменимая культура, используемая в мировом производстве «твёрдых» сыров, а в России - и в производстве витамина Bi₂, однако области применения ПКБ этим не ограничены. Поэтому биология ПКБ находится под постоянным «прицелом» специалистов разных профилей. Регулярно проводится международный тематический симпозиум "Propionibacteria". Научный интерес вызывает неоднозначность метаболизма ПКБ, например их отношение к молекулярному кислороду. Исходя из основного способа получения энергии (пропионовокислого брожения, ПБ) и способности развиваться при доступе кислорода, - это аэротолерантные анаэробы (Определитель бактерий Берджи, девятое издание, 1997), но их относят к микроаэрофильным организмам (Воробьёва, 1958; 1976; Pritchard et al., 1977; Ye et al., 1999). Актуальным является вопрос, каким образом ПКБ обеспечивают свою аэротолерантность; и в этом направлении ранее была проделана большая исследовательская работа, однако многое оставалось не выясненным.

Существует проблема метаболического лимитирования экспрессии генов в норме (Головлёв, Головлёва, 2000); одновременно расширяется представление о роли альтернативных ферментов в пластичности метаболизма бактерий (Якунин и др., 1999). Выявление естественной модификации (перестройки) метаболизма прокариот под действием факторов внешней (и внутренней) среды наряду с изучением метаболического лимитирования биохимических реакций актуально в связи с активным развитием метаболической инженерии. Главной задачей этого нового направления биотехнологии является «оптимизация экспрессии генов» с использованием целенаправленной переориентации потоков вещества (энергии) так, что, активно продуцируя целевой метаболит, бактериальная клетка сохраняет свою

2 жизнеспособность. Этот подход принципиально отличен от «максимизации экспрессии целевых генов» в клетках, погибающих в результате сверхпродукции метаболита или чужеродного белка, в которых заинтересован только человек [Дебабов, 1999; Машко и др., 2002].

В последнее десятилетие значительно возросло знание функций корриноидов (соединений группы витамина Ві₂) в биологии прокариот. Являясь древними полифункциональными (био)катализаторами они вовлечены в центральные метаболические процессы современных прокариот, такие как ПБ, метаногенез, гомоацетогенез, сульфатредукция, биосинтез метионина и дезоксирибозильных предшественников ДНК и другие. К настоящему времени открыто и изучено более тридцати биохимических реакций, катализируемых корриноидсодержащими ферментами. Открытие новых функций корриноидов продолжается [Рыжкова (Иордан), 2003]. Проблемам биосинтеза и функций корриноидов посвящают международные конференции (последняя происходила в 1996 году в Австрии), но, несмотря на обнаружение всё новых биохимических реакций, протекающих при участии корриноидов, актуален вопрос о физиологическом значении его высокого естественного уровня образования в клетках некоторых бактерий и архей. Новый взгляд на роль кобальта и корриноидов в жизнедеятельности P. freudenreichii неизбежно ускорил бы изучение этого явления у других прокариотических организмов.

Состояние вопроса. В исследованиях В.Я. Быховского значительное внимание было уделено роли кобальта и кобаламина (истинного витамина Ві₂) в биосинтезе корриноидов - соединений группы витамина В₁₂ (Быховский и др., 1969 а,б; 1975; Быховский, 1979; Быховский, Зайцева, 1989; Bykhovsky et al., 1997). Значение ионов кобальта и корриноидов для жизнедеятельности бактерии в целом оставалось вне поля зрения авторов. Вместе с тем потребность в ионах кобальта для роста культур (и образования корриноидов) в своё время отмечали у представителей p. Rhizobium (Kliewer, Evans, 1963; Cowles et al., 1969) и некоторых цианобактерий (Fogg et al., 1973; Beck, 1982).

Известно, что среди неполимерных соединений корриноиды - сложнейшие молекулы с уникальной кобальт-углеродной связью, обратимое расщепление которой определяет их множественные химические и биохимические функции

(Рыжкова, 2003). Биосинтез корриноидов требует значительных затрат центроболитов и энергии, однако некоторые бактерии и археи способны к естественному образованию и внутриклеточной аккумуляции корриноидов в количествах, в 100 - 1000 раз превышающих обычные уровни их содержания в клетках (единицы - десятки мкг на грамм АСБ). Вопрос о биологическом значении этого явления был впервые поставлен в отношении P. freudenreichii (Barker et al., 1958; Weisbach et al., 1959). Открывали всё новые биохимические (коферментные) функции корриноидов, изучали механизмы их действия, но на главный вопрос ответа не было.

Неоднозначность метаболизма пропионовокислых бактерий, возможность его перестроек, констатирована при изучении влияния молекулярного кислорода на энергетический обмен ПКБ, в котором помимо основного процесса - ПБ, включающего в себя электрон-транспортную цепь с использованием фумарата в качестве конечного акцептора электронов, определённое место занимает дыхание кислородное. Фактором перестройки энергетического обмена ПКБ, в том числе и Р. freudenreichii, служит молекулярный кислород. При ограниченной аэрации у Р. freudenreichii функционирует дыхательная цепь, которая имеет, прежде всего, предохранительное (от токсического действия кислорода) значение (De Vries et al., 1972; Бонарцева, 1973; Брюхачева и др., 1975; Pritchard, 1977; Pritchard, Asmundson, 1980; Скулачёв, 1997; Edwards et al., 2000). Обнаружение ферментов антиокислительной защиты клеток (ФАОЗ): супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и пероксидазы - позволило подойти к объяснению аэротолерантности Р. freudenreichii (Воробьёва, 1976; Краева, Воробьёва, 1981; Воробьёва и др., 1986), однако вопрос о причинах устойчивости бактерии к действию молекулярного кислорода не был исчерпан.

ПКБ обладают эффективным и пластичным конструктивным обменом. Они синтезируют все необходимые аминокислоты и другие компоненты клетки, развиваясь на минеральных средах с одним из многих Сахаров (или иным источником органического углерода) и некоторыми витаминами (ауксотрофы по пантотеновой кислоте и биотину). Вместе с тем ПКБ используют для роста аминный или молекулярный азот (Баранова, Климонтович, 1971; Баранова, Гоготов, 1974).

В поле зрения всегда оставалась удивительная способность P. freudenreichii подвидов shermanii и freudenreichii к накоплению в клетках больших количеств корриноидов (соединений группы витамина В₁₂, кобамидов, СЬа), среди которых доля кобаламина (СЫ) - истинного витамина Ві₂, в молекулу которого входит азотистое основание 5,6-диметилбензимидазол (Krautler, 1998 а), составляет ~ 10% (Быховский, Зайцева, 1989; Bykhovsky et al., 1997).

Существовало представление о «настройке» метаболизма P. freudenreichii исключительно на высокий уровень их образования как физиологической особенности бактерии (Воробьёва, 1995; Vorobjeva, 1999, 2000). Высказывалось также противоположное мнение о дерегуляции биосинтеза этих соединений, однако для его отрицания появлялись всё новые наблюдения, например постоянство содержания СЫ в клетках экспоненциально растущей культуры (Воробьёва, 1976), регулируемость биосинтеза корриноидов (Быховский, 1979; Bykhovsky et al., 1997). К началу наших исследований в метаболизме P. freudenreichii были известны две биохимические реакции, катализируемые кобамид-зависимыми ферментами: ключевая реакция ПБ (изомеризация сукцинил-КоА в метилмалонил-КоА) и биосинтез метионина. Ферменты этих реакций используют кобамиды в качестве коферментов, но проявляют разную специфичность к форме кобамида (Overath et al., 1962; Skupin et al., 1970; McKie et al, 1990; Chowdhury et al., 2001).

Цель и задачи исследований. Цель диссертационной работы была определена как поиск и раскрытие биологического смысла способности Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii к образованию внутриклеточных корриноидов в высоких концентрациях в период активного развития, что свойственно и некоторым другим прокариотам. Поэтому в целом работа была направлена на изучение роли кобальта и корриноидов в жизнедеятельности бактерии. Принципиальный методологический подход состоял в выявлении различий в физиологическом состоянии бактерии: её развитии, выживании и метаболическом статусе - при нормальном (физиологическом) уровне образования корриноидов и при снижении последнего, вплоть до глубокого (1000-кратного) дефицита в клетках.

Основные задачи, на решение которых была направлена работа, заключались в следующем:

1. Исследовать последствия изменения концентрации соли кобальта в среде для

5 развития P. freudenreichii в разных условиях культивирования в связи с изменяющимся уровнем эндогенных корриноидов - соединений группы витамина В12 (кобамидов). Установить физиологически значимый или нормальный (соответствующий наиболее активному развитию бактерии) уровень их образования в клетках.

1. Оценить возможность развития бактерии при свободном доступе воздуха (аэротолерантность) в сравнении с аноксическими условиями на разных средах, а также устойчивость клеток к летальному действию УФ-излучения в норме и при лимитировании клеток по содержанию корриноидов.

2. Определить уровни эндогенных кобамидов, необходимые для эффективного пропионовокислого брожения, биосинтеза метионина и образования нуклеиновых кислот в клетках бактерии.

3. Проанализировать воздействие разных форм корриноидов на образование ДНК в клетках дефицитной по ним бактерии. Доказать прямое специфическое вовлечение кобаламина (истинного витамина Ві₂) в процесс и показать его метаболическое лимитирование кобаламином в полноценных по содержанию суммарных корриноидов клетках.

4. Объяснить участие кобаламина в анаболизме ДНК, с одной стороны, и не прекращающийся биосинтез ДНК при глубоком дефиците корриноидов в клетках, с другой.

5. Исследовать функциональные и некоторые структурные свойства альтернативных (в отношении зависимости от аденозилкобаламина) рибонуклеотидредуктаз (РНРаз, КФ 1.17.4.-), ответственных за формирование пула дезоксирибозильных предшественников ДНК.

6. На примере системы РНРазы выявить регуляторное действие кобаламина; показать его функцию как фактора физиологической (метаболической) перестройки бактерии.

Научная новизна и значимость работы. В результате обобщения полученных в настоящей работе экспериментальных данных и имеющихся научных предпосылок возникло новое представление о двойственном характере физиологии Propionibacterium freudenreichii, определяемом ионами кобальта в среде и уровнем образования корриноидов в клетках.

Бактерия представляет собой пример прокариота, у которого кобальт не только контролирует (и стимулирует) образование корриноидов, но в определённых условиях служит фактором роста. Концентрационную зависимость роста прокариотического организма от соли кобальта в среде проследили впервые (Иордан и др., 1984); позже она была исследована у Methanosarcina barkeri (Kumar et al., 1987). Нам представляется, что это должно быть учтено в отношении других микроорганизмов, обладающих способностью к образованию корриноидов в значительных количествах.

Установили, что естественный высокий уровень образования корриноидов, на 2 - 3 порядка превышающий таковой у многих прототрофов по витамину Bi₂, существен для аэротолерантности и УФ-резистентности бактерии, что, видимо, отражает особенность предков ПКБ, их первичную среду обитания и экологическую нишу в условиях древней Земли. Впервые корриноиды рассматриваются как возможные (дополнительные) факторы защиты прокариотической клетки от стрессорного (токсического) действия кислорода.

Выяснили, что для нормальной интесивности ПБ P. freudenreichii достаточно ~ 1% синтезируемых ею кобамидов, что объясняется широкой специфичностью ключевого фермента ПБ к разнообразным формам кобамидов. СЫ-зависимая реакция биосинтеза метионина сохраняет свою эффективность при снижении общего содержания кобамидов на порядок. Вместе с тем, биосинтез ДНК в клетках P. freudenreichii метаболически лимитирован по СЫ даже при высоком уровне образования корриноидов. Стимулирующий эффект СЫ в отношении биосинтеза ДНК показан нами для представителей других видов ПКБ и некоторых стрептомицетов. Пришли заключению, что с уровнем СЫ может быть связано непостоянство содержания ДНК в прокариотической клетке. Установленное нами прямое и специфическое воздействие СЫ на образование ДНК позволяет прогнозировать его участие в физиологическом контроле репликации (и генетических процессов, которые репликацию включают) у многих прокариот, синтезирующих или требующих витамин В12 (условие необходимое).

Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о вовлечении метилкобаламина (МеСЫ) в качестве донора метильных групп в трансметилирование ДНК альтернативно по отношению к S-аденозилметионину.

7 Это третья биохимическая реакция в метаболизме P. freudenreichii, протекающая при участии витамина В₁₂. Обнаруженное нами зависимое от аденозилкобаламина (AdoCbl) превращение рибонуклеотида в дезоксирибонуклеотид явилось четвёртой реакцией, известной в настоящее время в метаболизме P. freudenreichii, в которой участвует кобамид.

Для P. freudenreichii впервые показано, что РНРаза, катализируя первую специфическую и скоростьлимитирующую реакцию анаболизма ДНК, облигатно требует аденозилированный кобаламин (AdoCbl), при этом естественный уровень кобамидов (кобаламина) в клетках бактерии в норме ограничивает её активность. Обнаружение этого фермента позволило объяснить прямую и специфическую зависимость образования ДНК от кобаламина у бактерии и дало возможность преодолевать метаболическое лимитирование процесса по нему. Функционирование AdoCbl-РНРазы в клетках - условие достаточное для того, чтобы стимулировать биосинтез ДНК у того или иного прокариота витамином В₁₂ (AdoCbl).

Впервые обнаружили, что P. freudenreichii, в отличие, например, от Rhizobium meliloti (Cowles et al., 1969), способна активно развиваться на «бескобальтовой» среде, практически не синтезируя корриноиды. При этом она испытывает потребность в дополнительных факторах роста, например цистеине, метионине, восстановленном глутатионе или триптоне, и перестраивает метаболизм. При глубоком дефиците корриноидов в клетках изменяется характер ПБ; образование ДНК происходит без участия кобаламина, причём AdoCbl в этом случае подавляет процесс. Установили, что основной «мишенью» служит дублирующая РНРаза, зависимая от ионов марганца и активируемая молекулярным кислородом, активность которой AdoCbl ингибирует. Альтернативные РНРазы в клетках одного организма показаны впервые (Иордан и др., 1975; 1986; 2000; Иордан и др., 1986; Иордан, Петухова, 1989; Иордан, 1992). Полученные нами результаты были подтверждены на примерах других бактерий (Barlow, 1988; Fontecave et al., 1989; Jordan et al., 1999; Borovok et al., 2002).

Мы также впервые наблюдали обратимую перестройку метаболизма Р. freudenreichii под действием ионов кобальта или кобаламина. Ионы кобальта, добавленные в среду, на которой активно развивается испытывающая глубокий дефицит корриноидов (кобаламина) бактерия, возвращают ей первоначальное

8 физиологическое состояние: возобновляется биосинтеза корриноидов и способность бактерии развиваться на минимальной среде в присутствии воздуха. Экзогенный кобаламин (AdoCbl) вызывает перестройку в системе альтернативных РНРаз бактерии, действуя на уровне активности ферментов и биосинтеза белка. Способность P. freudenreichii к альтернативным физиологическим состояниям в зависимости от обеспеченности клеток кобальтом и корриноидами (кобаламином), является проявлением её метаболической пластичности, обусловленной этими факторами, что, видимо, способствует освоению бактерией новых сред обитания.

Практическая ценность. Некоторые установленные в настоящей работе закономерности биологии P. freudenreichii нашли практическое применение. В зависимости от конкретной задачи рекомендовано либо поддерживать высокий уровень образования корриноидов в клетках бактерии, либо значительно снижать его.

1. Для получения пропионовой кислоты, используемой в качестве антисептика в пищевой промышленности и сельском хозяйстве, на основе иммобилизованных клеток P. freudenreichii, синтезирующей витамин В₁₂, создан биокатализатор и предложен способ его реактивации (Воробьёва и др., 1978; Иордан и др., 1979).

2. Изобретения способов приготовления теста и защиты хлеба от «картофельной болезни» при использовании в заквасках P. freudenreichii (с заданным уровнем витамина Ві₂ в клетках) внедрены в хлебопекарной промышленности (Богатырёва и др., 1988; 1990).

3. На основе пермеабилизованных клеток P. freudenreichii, трансформирующих рибонуклеотиды в дезоксирибонуклеотиды благодаря активности AdoCbl-РНРазы, разработан способ получения дезоксирибонуклеотидов (Иордан, Прянишникова, 1997).

4. В связи с началом работ по генетической модификации штаммов бактерии, применяемых в производстве «твёрдых» сыров типа «Швейцарский», практически значимыми явились рекомендации по культивированию бактерии в условиях активного биосинтеза ДНК, зависимого от обеспеченности клеток кобаламином [Ryzhkova (Ionian), 2001].

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на республиканских конференциях молодых учёных (Ташкент, 1976, 1978; Рига, 1977);

заседаниях секции и Съезде ВМО (Москва, 1980, 1982; Алма-Ата, 1985); всесоюзных конференциях: «Биосинтез ферментов микроорганизмами» (Кобулети, 1986), «Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов» (Пущино, 1989); международных конференциях, симпозиумах и конгрессах: FEMS International Symposium "Environmental regulation of microbial metabolism" (Puschino, USSR, 1983); 14^th International Congress of Microbiology (Manchester, England, 1986); First International Congress on Vitamins and Biofactors in Life Scince (Kobe, Japan, 1989); 4^th International Conference "Thioredoxins and related proteins" (Whitzenhausen - Kassel, Germany, 1995); 5^th International Conference "Thioredoxins and related proteins" (Smolenice - Bratislava, Slovak Republic, 2000); 3^rd International Symposium on Propionibacteria (Zurich, Switzerland, 2001).

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, девяти глав (обзор литературы, описание объектов и методов исследований, изложение экспериментов с обсуждением и заключениями, общее заключение), основных выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 266 страницах, содержит 19 таблиц и 48 рисунков. Список цитируемой литературы включает 385 работ.

Публикации. Опубликована 51 работа: статей 33, изобретений (авторских свидетельств и патентов) 4, тезисов и докладов на конференциях и симпозиумах 14.

Место проведения работы. В основном работа проведена на кафедре микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова при участии студентов, аспирантов и сотрудников кафедры. Ряд совместных работ выполнены: в Отделе функциональной биохимии биополимеров и в Отделе хроматографического анализа Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (МГУ им. М.В. Ломоносова); на кафедре микробиологии Братиславского университета (Словакия); в Лаборатории основ действия радиации и биологически активных веществ на клетку Института химической физики им. Н.Н. Семёнова (РАН), а также - в ГНИЙ Хлебопекарной промышленности (РАСХН).

Основные положения, выносимые на защиту 1. Высокий естественный уровень образования корриноидов, реализуемый в первичном обмене P. freudenreichii при достаточной концентрации ионов кобальта в

среде, имеет положительное (физиологическое) значение для бактерии в «жестких» условиях существования, при воздействии стрессорных факторов среды.

2. Пропионовокислое брожение - основной энергетический процесс бактерии, не
снижает интенсивности при значительном уменьшении содержания витамина В\₂, но
для эффективного биосинтеза ДНК требуется высокий уровень образования
корриноидов в клетках бактерии. В анаболизм ДНК прямо и специфически вовлечён
кобаламин, который в норме лимитирует процесс на уровне образования
предшественников.

3. Бактерия, синтезируя на 2-3 порядка меньше корриноидов, чем в норме, способна развиваться; при этом она испытывает новые ростовые потребности и изменяет метаболизм.

4. Синтез ДНК при дефиците корриноидов в клетках бактерии не прекращается и происходит благодаря функционированию альтернативных ферментных систем формирования предшественников ДНК, среди которых ключевой является рибонуклеотидредуктаза, независимая от кобаламина.

5. Кобаламин участвует в перестройке системы альтернативных рибонуклеотидредуктаз у P. freudenreichii.

Пропионовокислые бактерии: метаболизм и корриноиды

Пропионовокислые бактерии (ПКБ) образуют компактный филогенетический кластер (рис. 1, 2) в домене (империи или надцарстве) Bacteria. Они принадлежат филетической линии «Грамположительные бактерии», ветви с высоким содержанием ГЦ-пар в хромосомной ДНК. Наиболее удалённое положение среди классических (молочных) ПКБ занимает Propionibactehum freudenreichii [Charfreitag, Stackebrandt, 1989; Dasenetal., 1998].

Этот вид ПКБ в настоящее время подразделён на подвиды: Р. freudenreichii subsp. freudenreichii и P. freudenreichii subsp. shermanii [Skerman et al., 1980], которые имеют определённые физиолого-биохимические различия между собой, но и общие свойства, заметно отличающие их от. представителей других видов ПКБ [Воробьёва, 1976; Cummins, Johnson, 1992]. Наибольший теоретический и практический интерес представляет Р. freudenreichii subsp. shermanii.

Две яркие особенности присущи P. freudenreichii subsp. shermanii (далее P. freudenreichii) как организму: способность к высокому естественному образованию (и содержанию в клетках) корриноидов или соединений группы витамина Bi2 и сложное, неоднозначное отношение к молекулярному кислороду.

Исходя из способа получения энергии (пропионовокислое брожение, рис. 3) и способности развиваться в бескислородной среде бактерию считают анаэробным организмом, но при этом, безусловно, аэротолерантным [Bergeys Manual, 1986; Cummins, Johnson, 1992; Madigan et al., 1997; P. acidipropionici

Определитель бактерий Бер лжи, 1997]. Вместе с тем известно, что бактерия развивается эффективнее не в бескислородных (аноксических) условиях, а в присутствии кислорода [Воробьёва, 1958; Buchanan, Gibeons, 1974]. ПБ протекает более интенсивно, когда активны флавиновые оксидазы [Бонарцева, 1973; Воробьёва, 1976]. Биосинтез кобаламина (истинного витамина Ві2), один из существенных процессов анаболизма бактерии, происходит с вовлечением молекулярного кислорода, а именно при образовании специфической части его молекулы, 5,6-диметилбензимидазола [Renz, 1970, 1998; Быховский, Зайцева, 1989; Scott, 1994; Bykhovsky et al., 1997]. В настоящее время P. freudenreichii относят к микроаэрофильным организмам.

В цитоплазматической мембране (ЦПМ) бактерии функционирует электрон-транспортная дыхательная цепь (ЦПЭ), включающая хиноны и цитохромы, которая служит прежде всего пропионовокислому брожению на стадии восстановления фумарата в сукцинат (здесь, в анаэробном дыхании, вовлечённом в ПБ, фумарат является конечным акцептором электронов). При культивировании бактерии в условиях аэрации дыхательная цепь переключается на молекулярный кислород как конечный акцептор электронов: происходит индуцкция синтеза терминальной оксидазы (цитохромы а\Дг, первоначальное обозначение), увеличивается эффективность окислительного фосфорилирования [De Vries et al., 1972; Бонарцева, 1973; Брюхачева и др., 1975]. При ограниченной аэрации (давление воздуха, поступающего в хемостат, менее 330, но более 42 мм Hg-столба) возрастает общее количество цитохромов (65 so, Ябоо и d621) и выход биомассы [Pritchard et al., 1977; Pritchard, Asmundson, 1980]. При интенсивном аэрировании ПБ угнетено: выделение клетками пропионовой и уксусной кислот снижается или прекращается, но накапливается пируват [De Vries et al., 1972; Pritchard et al., 1977]. В таких условиях пропионовая кислота может быть использована в катаболизме [Ye et al., 1999]. Эти данные свидетельствуют о том, что и «наиболее анаэробная» из классических ПКБ - P. freudenreichii, не способная к образованию колоний на поверхности твёрдых («богатых») сред в присутствии кислорода (в отличие от других видов классических ПКБ), тем не менее уже имеет дыхательную цепь и способна использовать молекулярный кислород (при определённых пониженных концентрациях его в жидкой среде) в качестве конечного акцептора электронов. Однако эта дыхательная цепь редуцирована, несовершенна, что проявляется в резистентности дыхания к цианиду. Она имеет, скорее, значение «предохранительного» дыхания, нейтрализующего молекулярный кислород [Schwartz, 1973; Скулачёв 1997; Edwards et al., 2000]. Бактерия обладает также флавиновыми оксидазами, не связанными с ЦПЭ в ЦПМ, и системой ферментов антиокислительной защиты (ФАОЗ): каталазой пероксидазой, супероксиддисмутазой [Schwartz, Sporkenbach, 1975; Pritchard et al., 1977; Pritchard, Asmudson, 1980; Краева, Воробьёва, 1981; Воробьёва и др., 1986].

Ионы кобальта и кобаламин в физиологии Propionibacterium freudenreichii в «жестких» условиях существования

Ионы кобальта, переходного (и тяжелого) металла, в 1000 раз менее распространённого на поверхности Земли по сравнению с железом, биологически значимы, вовлечены в обмен веществ организмов.

Механизм поглощения ионов кобальта бактериями не изучен, однако по аналогии с транспортом ионов железа предполагается участие в этом процессе соединений, подобных сидерофорам, и фермента хелатазы [Быховский, Зайцева, 1989]. Пропионовокислые бактерии, по-видимому, обладают высокоэффективной системой транспорта ионов этого металла. Для P. arabinosum показано поглощение ионов кобальта из среды при его. пикомолярной концентрации [Schneider et al., 1995; Trojanowska et al., 1996].

Ступперих, немецкий микробиолог, известный исследователь роли корриноидов в жизнедеятельности прокариот, пишет: «Биологическая функция кобальта в основном связана с корриноидами; к настоящему времени известно только три достоверных исключения из этого правила: вне корриноидов кобальт входит в состав ферментов: лизин-2,3-мутазы клостридий, нитрилгидратазы родококков и метионинаминопептидазы Е. coli» [Stupperich, 1993]. В метаболизме ПКБ эти ферменты не показаны.

Для фосфоенолпируваткарбокситрансфосфорилазы P. freudenreichii, subsp. shermanii, одного из ключевых ферментов пропионовокислого брожения, в определённых экспериментальных условиях (in vitro) наблюдали увеличение активности фермента в присутствии ионов кобальта [Davis et al., 1969]. Л.И. Воробьёвой (1995) эти наблюдения были интерпретированы как метаболический феномен P. freudenreichii, как свойство фермента ФЕП-карбокситрасфосфорилазы. Однако те же авторы в следующей своей статье показали, что Со2+ не взаимодействует с апоферментом, а его эффект является искусственным, возникающим в конкретных условиях проведения реакции «в пробирке» [Willard et al., 1969]. Вместе с тем ионы кобальта действительно могут активировать некоторые ферменты и белки. Так, в 1мМ концентрации кобальт проявлял себя как эффектор белка RecA Е. coli, вдвое увеличивая его протеолитическую активность в отношении репрессора фага X и ускоряя связывание этого белка с одноцепочечной ДНК. В концентрации более 2 мМ_кобальт ингибировал ренагурацию цепей ДНК [Resnik, Sussman, 1982]. Известно, что RecA участвует в общей рекомбинации и в SOS-репарации [Айола, Кайгер, 1988]; последнее имеет значение для выживания клеток при действии, например, радиации в летальных дозах [Bridges, 1971]. Однако вопрос о специфичности ионов кобальта для RecA остался открытым. Не исключена их заменяемость ионами других двухвалентных металлов. Например, ДНК-полимераза 1 Е. coli, обладая in vitro 100% активности с 2 мМ Mg2+, в присутствии Мп2+ имела 153% активности, а с Со2+ - 57%, т.е. ионы этих металлов заменяли магний в качестве активатора ДНК-полимеразы, однако при этом усиливалось ошибочное включение нуклеотидов. Ионы кобальта (никеля и цинка) стимулировали рост опухолей у лабораторных животных [Sirover, Loeb, 1976; Kunkel, Loeb, 1979].

В биосинтезе корриноидов участие кобальта безусловно специфично, поскольку он облигатен как структурный элемент (центральный атом) молекул этих тетрапирролов. Влияние ионов кобальта на образование корриноидов было показано и изучено В.Я. Быховским на примере Propionibactehum freudenreichii subsp. shermanii, которую культивировали на богатой, глюкозо-пептонной, среде. Максимальное внутриклеточное содержание витамина В12 (в клетках стационарной фазы роста, примерно 1000 мкг.г АСБ, химический метод измерения) достигалось в этих условиях при концентрации хлористого кобальта 10 мг.л"1 [Быховский и др., 1969 (а, б)]. В отсутствие ионов кобальта бактерия не синтезировала корриноиды и выделяла из клеток бескобальтовые метилированные тетрапирролы (коррифирины или прекоррины) - предшественники кобириновой кислоты, первого соединения в биогенезе корриноидов, который уже содержит атом кобальта в корриновом кольце [Быховский, 1979; Bykhovsky et al., 1997].

Ранее потребность в добавлении соли кобальта для образования корриноидов отмечали для представителей p. Rhizobium [Kliewer, Evans, 1963], Streptomyces olivaceus и Methanosarcina barkeri [Быховский и др. 1969 (б)], некоторых цианобактерий [Fogg et al., 1973; Beck, 1982]. ДляМ barkeri Fusaro в периодической культуре была показана прямая концентрационная зависимость и найдена оптимальная для образования корриноидов концентрация хлорида кобальта: при концентрации 9,6 мг.л 1 синтезировано 5,8 мг.г"1 АСБ корриноидов, среди которых 19% составлял фактор III (5-гидроксибензимидазолилкобамид), а более 80% - безнуклеотидный фактор В [Kumar et al., 1987]. Кобальт также способствовал увеличению продуктивности по витамину Bi2 клеток Е. coli, синтезирующей его в аноксических условиях [Kamata et al., 1991].

Ионы кобальта не только лимитируют, но иногдда оказывают определённое регулирующее (стимулирующее) влияние на биосинтез корриноидов, сдвигая равновесие потока вещества от общего предшественника тетрапиррольных соединений - уропорфириногена III, к корриноидам. В присутствии ионов кобальта снижалось образование порфиринов в клетках P.freudenrechii и возрастало накопление корриноидов. То же наблюдали для S. olivaceus и М. barkeri [Быховский и др., 1969 (а, б)].

Изменения в физиологии P. freudenreichii при лимитировании по ионам кобальта в среде и дефиците корриноидов в клетках

Propionibacterium freudenreichii способна использовать для роста как органический, так и неорганический азот [Glatz, 1992]. Последнее свидетельствует о возможности развития предков пропионовокислых бактерий в условиях древней Земли с ограниченно доступным органическим веществом. Большинство штаммов не требует аминокислот для роста, но аминокислоты стимулируют их рост на средах с сульфатом аммония [Cummins, Johnson, 1981]. Кроме того бактерия способна к фиксации молекулярного азота, причём P. freudenreichii более активна по сравнению с аэробной (факультативно) P. jensenii (P. peterssonii). Это свойство прямо коррелирует и с активным витаминообразованим ПКБ [Баранова, Гоготов, 1974].

В лабораторных условиях бактерию обычно культивируют на богатой среде, содержащей триптон, пептон или дрожжевой (кукурузный) экстракт без добавления сульфата аммония и соли кобальта [De Vries et al., 1972; Cummins, Johnson, 1992]. В процессе приготовления «твёрдых» сыров типа «Швейцарский» в предсырную массу соль кобальта также не вносят [Frohlich-Wyder et al., 2002]. В клетках бактерии в этих случаях остаточное содержание корриноидов должно составлять менее 200 мкг.г! АСБ (табл. 1). В предыдущей главе мы логически допустили, что МОЛОКО И сыры -вторичная естественная среда обитания классических ПКБ. Потребность в ней, видимо, возникла из-за достаточно редкого распространения ионов кобальта в земной коре и появления такой «богатой» (аминокислотами, в том числе серусодержащими) среды, как молоко.

Бактерия активно развивается и на глюкозо-пептонной среде, используя синтезируемые пептидазы. При этом, если в среду добавлена соль кобальта в высокой концентрации (до 10 мг.л"1), образуются значительные количества корриноидов [Быховский и др., 1969 (а,б)]. P. freudenreichii способна использовать смесь аминокислот, а также отдельные аминокислоты в качестве источников азота [Баранова, Климонтович, 1971; Кучерас, 1973]. Замечено, что при одной и той же концентрации соли кобальта на средах со смесью аминокислот уровень образования корриноидов снижается по сравнению с таковым на глюкозо-минеральной среде, содержащей только аммонийный азот [Кучерас, 1973; Воробьёва, 1976]. Выявили, что угнетающее действие на процесс витаминообразования оказывает цистеин даже в присутствии сульфата аммония [Кучерас, 1973], но в биосинтезе корриноидов принимают участие метионин и глутамин [Быховский, Зайцева, 1989; Bykhovsky et al., 1997].

Таким образом, между ростом культуры и образованием корриноидов в клетках в отношении использования (смеси) аминокислот наблюдалось определённое противоречие (нестрогое обратное соответствие).

Две биохимические реакции, протекающие с участием витамина Ві2 в метаболизме P. freudenreichii, требуют, видимо, разного количества корриноидов. Аденозилкобамид-зависимая метилмалонил-КоА-изомераза (мутаза, ММКоАМаза) катализирует ключевую реакцию пропионовокислого брожения: превращение сукцинил-КоА в метилмалонил-КоА, и является высокооборотным, нестрого специфичным к кобаламину и непрочно с ним связанным ферментом (в отличие от ММКоАМазы животного происхождения) [Stadtman et al., 1960, 1976; Overath, 1962; 1976; McKie et al., 1990; Chowdhury et al., 2001]. Кобаламинзависимая метионинсинтаза (МСаза) бактерии [Skupin et al., 1970] катализирует трансметилирование гомоцистеина от метилтетрагидрофолата (МеТТФ) с образованием метионина и регенерацией свободного ТГФ. Здесь кобаламин, являясь простетической группой фермента, строго специфичен для всех известных МСаз [Jeter et al., 1987; Johnson et al., 1992; Roth et al., 1996; Drennan et al, 1998]. Поэтому дефицит корриноидов в клетках P. frendenreichii может обусловливать лимитирование Cbl-зависимой МСазы по кобаламину, который составляет только 10% от количества в норме образуемых бактерией корриноидов. В этом случае она вынуждена потреблять метионин из среды или, что возможно, в работу вступает альтернативная, независимая от кобаламина, метионинсинтаза. Альтернативные МСазы функционируют в клетках Е. coli и S. typhimuhum [Jeter et al., 1987; Drummond, Matthews, 1993; Roth et al., 1996].

Следствием недостатка ионов кобальта в среде является, как показано [Kliewer, Evans, 1963; Cowles, Evans, 1968; Cowles et al., 1969] значительное снижение содержания кобаламина в клетках Rhizobium meliloti и прекращение роста культуры (на минимальной среде). В среде, обогащенной метионином, «бескобальтовая» культура росла, но клетки имели пониженное содержание ДНК и продолжали испытывать затруднения в отношении деления: имели удлинённую форму.

Изучение процесса образования ДНК, происходящего в клетках P. freudenreichii при участии кобаламина

В литературе отсутствуют сведения об участии кобаламина в ферментных системах собственно репликации хромосомы, которые достаточно полно изучены к настоящему времени. Поэтому для выявления точек его приложения к процессу образования ДНК в клетках, для объясения причин участия кобаламина в тотальном синтезе ДНК бактерии, исследовали возможность вовлечения кобаламина в формирование предшественников ДНК (рис. 26), а также в её метилирование.

Биосинтез тимидилата из дезоксирибоуридилата катализирует тимидилатсинтаза (ТМСаза, КФ 2.1.1.45), независимый от кобаламина фермент, но в тимидилатсинтазной (ТМС) реакции непосредственно участвует тетрагидрофолат, а именно 5,10-метилен-ТГФ, который служит одновременно и восстановителем в реакции, и донором С1 фрагмента [Андреева, 1974;Bachmannetal., 1983; Allen etal., 1993].

Свободный тетрагидрофолат может быть регенерирован только в сопряженной метионинсинтазной реакции, поскольку реакция восстановления 5,10-метилен-ТГФ до метил-ТГФ (МеТГФ), катализируемая соответствующей редуктазой, необратима. Кроме того, вероятно, конкурентно происходит активный «отток» 5,10-метилен-ТГФ на синтез пуринов, что лимитирует и ТМСазу, и образование МеТГФ [Дэгли, Никольсон, 1973; Андреева, 1974; Канопкайте, Рачкус, 1991; Roth et al., 1996; Krautler, 1998(6)]. Этим определяется значение метионинсинтазной реакции, в том числе протекающей при участии кобаламина, в образовании тимидилата. В клетках изучаемой нами бактерии СЫ-зависимая метионинсинтаза (МСаза) функционирует [Skupin et al., 1970].

В отличие от трёх дезоксирибозильных предшественников ДНК: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, образование пула которых происходит только эндогенно из рибонуклеотидов в канале (комплексе ферментов) по основному метаболическому пути (рис. 27), дТТФ может быть образован и по запасному пути из экзогенного тимина [Pato, 1979; Mollgaard, Neuhard, 1983; Mathews, 1985].

Транспорт тимина до конца не изучен (возможен механизм переноса групп с участием фосфорибозил-1-пирофосфата). За формирование дезоксирибозильного тимидина и тимидилата (дТМФ) в клетке могут быть ответственны дезоксирибозилтрансфераза (транс-М-дезоксирибозилаза) [Cardinaud, 1978; Mollgaard, Neuhard, 1983] и нуклеозидфосфорилазы [Зинченко и др., 1989; Зинченко, 1992; Зинченко и др., 1998]. Фосфорилирование тимидина и тимидилата осуществляется собственными (специфическими) киназами [Cory, 1988].

В норме тимидилатсинтазная реакция не является скоростьлимитирующеи стадией в процессе образования ДНК, но синтез и активность ТМСазы могут быть скоординированы с таковыми первого специфического фермента анаболизма ДНК, рибонуклеотидредуктазы [Cory, Whitford, 1972; Bachmann et al., 1983; Cory, 1988].

Рибонуклеотидредуктаза (РНРаза, КФ 1.17.4-) ответственна за сбалансированное восстановление всех 4-х рибонуклеотидов: АТФ (АДФ), ГТФ (ГДФ), ЦТФ (ЦЦФ) и УТФ (УДФ) в соответствующие дезоксирибонуклеотиды. Это первая специфическая и, как считают, скоростьлимитирующая ступень в анаболизме ДНК, а фермент относят к генетическим [Elford, 1970; Cory, Whitford, 1972; Bachmann et al., 1983; Das et al., 1985; Hogenkamp et al., 1987; Cory, 1988; Chiu et al., 1992; Reichard, 1993; Lichtetal., 1996].

РНРаза не только обеспечивает дезоксирибозильные предшественники для синтеза ДНК, но метаболически контролирует скорость репликации на уровне инициации и элонгации репликации [Fuchs, Karlstrom, 1972; Ни et al., 1984; Cory, 1988; Brishwein et al., 1997] и её точность [Das et al., 1985]. РНРазу обнаруживают как в цитоплазме, так и в ДНК-мембранном комплексе бактериальных клеток; она входит в состав комплекса ферментов, участвующих в инициации репликации [Manwaring, Fuchs, 1979; Viswanathan, Noronha, 1979; Firshein, 1989; Laffan et al., 1990]. Незначительные изменения активности фермента немедленно отражаются на интенсивности образования ДНК в клетках [Sinha, Snustad, 1972; Lammers, Follmann, 1983; Reichard, 1985; Cory, 1988; Probst et al., 1989; Chiu et al.,1992; Fan et al., 1996; Brischwein et al., 1997], поэтому фермент используют как мишень противораковой терапии [Chiu et al., 1992; Fan et al., 1996].

Синтез РНРазы не является конститутивным в клеточном цикле: (cell cycle regulated enzyme) максимум синтеза фермента приурочен к началу репликации [Sun, Fuchs, 1992]. С другой стороны, результате «экстренной остановки» синтеза ДНК, например при подавлении полимеризации одним из специфически действующих антибиотиков (митомицина С, блеомицина и других), заметно возрастает синтез апофермента РНРазы, как и появление новых репликативных вилок в хромосоме [Filpula, Fuchs, 1977; 1978; Sun, Fuchs, 1992; Bianchi et al., 1997]. Это же происходит как следствие инактивирования РНРазы, например, при её недостаточности по коферменту [Ghamber, Blakley, 1966; Cowles et al., 1969; Иордан, 1990] или специфического ингибирования [Murphree, Moore, 1969]. Повышение уровня синтеза апофермента (дерепрессия синтеза РНРазы) в отсутствие кофермента В12 указывает на отсутствие в клетках бактерий других типов РНРазы, отличных от AdoCbl-зависимого фермента (см. далее).

Таков в целом биологический смысл РНРазы, катализирующей необратимую реакцию замещения ОН-группы при С2 рибозы нуклеотида на водород, происходящий из растворителя (воды) и переносимый через дитиол белка.

В естественную систему РНРазы in vivo входит дитиоловый низкомолекулярный ( 12 кДа) белок: тиоредоксин или глутаредоксин [Gleason, Holmgren, 1988]. Глутаредоксин рассматривают даже как отдельную специфическую субъединицу РНРазы [Holmgren, 1979]. В систему анаэробной РНРазы Е. coli входит флаводоксин [Reichard, 1993; Harder, 1993].

При кажущейся простоте химического превращения катализ представляет собой сложный свободнорадикальный механизм, инициируемый коферментной группой, которая располагается вблизи активного центра, и включающий в процесс свободные радикалы определенных аминокислот (активного центра) и субстрат, нуклеотид [Blakley, 1982; Reichard, 1993; Harder, 1993; Auling, Follmann, 1994; Stubbe, van der Donk, 1995; Griepenburg et al., 1996; Stubbe et al., 1998; Licht et al., 1999; Oehlmann, Auling, 1999].

Похожие диссертации на Кобальт и корриноиды в биологии Propionibacterium freudenreichii

Кобальт и корриноиды в биологии Propionibacterium freudenreichii Рыжкова Евгения Петровна

Пробиотический потенциал штаммов Propionibacterium freudenreichii и микробиологическая защита хлебаЛи Хао (КНР)

Взаимодействие наночастиц феррита кобальта и молекул ДНК in vitroПершина, Александра Геннадьевна