Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Обзор литературы 12
1.1 Распространенность и видовой спектр возбудителей кандидознои инфекции влагалища 12
1.2 Таксономия, морфологические и культуральные свойства грибов рода Candida 15
1.2.2 Культуральные свойства 15
1.3 Факторы патогспности грибов 17
1.3.1 Морфологическая трансформация: дрожжевая- гифальная форма 18
1.3.2 Фосфолипазная активность 20
1.3.3 Продукция протсолитических энзимов 22
1.3.4 Способность к пленкообразованию 23
1.3.5 Устойчивость грибов рода Candida к антимикотическим препаратам
1.4 Взаимоотношения грибов рода Candida и бактерий 29
1.5 Смешанные биопленки 33
ГЛАВА II Материалы и методы исследования
2.1 Многолетняя динамика инфицированности влагалища женщин репродуктивного возраста грибами рода Candida 38
2.2 Микробиологическое исследование образцов вагинального секрета
2.2.1 Отбор проб для исследования 39
2.2.2 Микроскопическое исследование образцов вагинального секрета 39
2.3 Изучение биологических свойств С. albicans 40
2.3.1 Изучение морфологической трансформации С. albicans
2.3.2 Изучение ферментативных свойств С. albicans 40
2.3.3 Изучение способности грибов С. albicans к формированию биопленок 40
2.4 Изучение взаимного влияния микробных культур 42
2.4.1 Метод совместного культивирования 42
2.4.2 Метод отсроченного антагонизма 43
2.4.3 Формирование смешанных биопленок 43
2.5 Методы статистической обработки 45
ГЛАВА III Динамическая характеристика видового состава и чувствительности грибов рода candida кантимикотическим препаратам 46
3.1 Многолетняя динамика инфицированности влагалища женщин репродуктивного возраста грибами рода Candida 46
3.2 Внутригодовая динамика инфицированности влагалища женщин репродуктивного возраста грибами рода Candida 48
3.3 Видовой спектр грибов рода Candida, изолированных из влагалища женщин в 2005 - 2009 гг. 49
3.4 Состав микробных ассоциаций, изолированных из вагинального отделяемого 53
3.5 Динамика чувствительности грибов рода Candida к антимикотическим препаратам 54 CLASS ГЛАВА IV Биологические свойства штаммов грибов с. albicans, изолированных из вагинального отделяемого женщин репродуктивного возраста CLASS
4.1 Микроскопические исследования 57
4.2 Культуральное исследование вагинального секрета 61
4.3 Морфометрическая характеристика штаммов С. albicans 63
4.4 Влияние абиотических факторов на функциональные характеристики С. albicans 66
4.4.1 Морфологическая трансформация (дрожжевая-гифальная форма) 67
4.4.2 Фосфолипазная активность 70
4.4.3 Продукция протеаз 74
4.5 Пленкообразующая способность С. albicans, колонизирующих вагинальный биотоп
4.5.1 Характеристика пленкообразующей способности С. albicans 78
4.5.2 Влияние абиотических факторов на пленкообразование
у грибов 82
4.5.2.1 Влияние состава питательных сред на формирование биопленок у штаммов С. albicans 81
4.5.2.2 Влияние условий культивирования (температуры и рН питательной среды) на формирование биопленок С. albicans 83
ГЛАВА V Особенности взаимотношений грибов С. Albicans и бактерий 8 7
5.1 Изучение взаимного влияния С. albicans и бактерий методом совместного культивирования 87
5.2 Изучение взаимного влияния С. albicans и бактерий методом отсроченного антагонизма 91
5.3 Формирование смешанных биопленок грибами С. albicans и условно патогенными бактериями, изолированными из вагинального биотопа 94
Заключение 99
Выводы 107
Список литературы
- Таксономия, морфологические и культуральные свойства грибов рода Candida
- Микробиологическое исследование образцов вагинального секрета
- Внутригодовая динамика инфицированности влагалища женщин репродуктивного возраста грибами рода Candida
- Культуральное исследование вагинального секрета
Введение к работе
Актуальность проблемы. За последние десятилетия техногенные воздействия на современные экосистемы, внедрение в медицинскую практику достижений фармакологии привели к значительным изменениям как биоценоза самого человека, так и этиологической структуры инфекционной патологии. На смену традиционным возбудителям пришли условно патогенные микроорганизмы, ранее сравнительно редко проявлявшие свои болезнетворные свойства (Бухарин О.В. и соавт., 2007, 2009; Mark Cichocki, R.N., 2009). Такие микроорганизмы отличают более выраженные адаптивные способности, а наряду с высокой природной резистентностью к антимикробным препаратам - относительно быстрое развитие приобретаемой, в том числе дозозависимой устойчивости. В этом одна из глобальных причин роста грибковых заболеваний, которыми сегодня, по данным Всемирной организации здравоохранения, страдает каждый пятый житель планеты. В ряду возбудителей микозов грибы рода Candida занимают одну из ведущих позиций (Кубась В.Г., 2004; Шелковая Н.Г., 2007; Calderone R.A., 2009). Эти микромицеты могут быть причиной широкого спектра заболеваний - от неопасных поражений слизистой оболочки до жизнеугрожающих инвазивных процессов в любых органах. Среди всех микотических поражений организма второе место (после онихомикоза) приходится на кандидомикоз кожи и слизистых оболочек, до 20% случаев которого составляет урогени-тальная локализация процесса. Только в США ежегодно регистрируется 13 миллионов случаев вульвовагинального кандидоза (Kent H.L., 1999). При этом наиболее важной современной тенденцией следует признать возрастание роли мочеполовых путей в качестве первичного источника грибковых инфекций, в том числе у реанимационных больных с канди-демией (Блинов Н.П., 2004; Pfaller М.А., 1996).
К числу важнейших медико-социальных проблем относится инфекционная патология репродуктивной системы женщины, в структуре которой грибковые поражения играют весьма существенную роль. Однако, статистически достоверной информации о распространенности вагинального кандидоза практически нет, так как в большинстве случаев заболева-
ниє не выделяется из прочих дисбиотических процессов, часто регистрируемых во влагалищном биотопе сексуально активных женщин. Согласно кооптированным данным (Анкирская A.M. и соавт, 2009), частота выделения грибов в популяции женщин групп повышенного риска увеличилась с 3-4% в 60-70-е годы прошлого до 17-20% в начале XXI века. Грибы Candida albicans составили 83,7-86%, ne-albicans виды - 14-16,3% без выраженной тенденции к росту или снижению. Более 90% грибов С. albicans и С. parapsilosis сохранили чувствительность к имидазолам и триазолам. Среди "проблемных" видов (С. glabrata, С. krusei) нечувствительные штаммы в основном имели дозозависимую чувствительность, которая может быть преодолена увеличением курсовой дозы препарата. Однако есть сведения, указывающие на более значительные изменения и в видовой структуре возбудителей кандидозной инфекции влагалища, и в их устойчивости к антимикотическим препаратам (Веселов А.В. и соавт., 2005, 2008; Meis J., et al, 2000; Pappas P.G., et al, 2004; Seidler M, 2006; Shuford J., 2007).
Вагиниты, обусловленные сочетанным воздействием не менее двух факторов, например бактериального вагиноза и кандидозного вульвоваги-нита, встречаются достаточно часто, составляя от 10 до 30% всех случаев инфекционных заболеваний влагалища. Результат взаимного влияния возбудителей трудно предсказуем, но в большинстве случаев клиническая картина искажается, что затрудняет диагностику и выбор адекватной терапии (Байрамова Г.Р.и соавт., 2001; Мирзабалаева А.К. и соавт., 2004; Бебнева Т.Н., 2006; Fidel P.L. et al, 2004; Linda О., Eckert, 2006). Более того, до настоящего времени не разработаны четкие рекомендации, позволяющие оценить роль изолируемых из вагинального содержимого грибов рода Candida, колонизация слизистых которыми у практически здоровых людей колеблется от 15 до 40% и может возрасти до 80% на фоне какой-либо патологии в условиях длительной госпитализации. Считается, что Candida-яяфешщя может выступать в роли маркера общего дисбактерио-за (Сергеев А.Ю., 2000). Присутствуя в биоценозе, они взаимодействуют с другими видами условно-патогенных микроорганизмов и представителями нормофлоры, изменяя факторы персистенции и вирулентности последних (Бухарин О.В., 2002; Morales D.K., HoganD.A. 2010). В микробных ассоциациях между разными видами возбудителей возникают неоднозначные взаимоотношения, что может существенно повлиять на характер инфекционного процесса (Долгушина В.Ф. и соавт., 2004; Karagozov I.
et al., 2004; Zhou X. et al., 2004, Mijac V.D. et al., 2006). В настоящее время нет единого мнения о том, какой вклад вносят различные микроорганизмы в формирование избыточной грибной колонизации слизистых оболочек (Хомич Ю.С. и соавт., 2006). До сих пор открытым остается и вопрос об антагонистической активности дрожжевых грибов в отношении условно патогенных бактерий (Перунова Н.Б., 2006). В контексте вагинальных инфекций практически отсутствуют систематизированные сведения о пленкообразующей способности грибов Candida и формировании ими, в том числе, смешанных с условно патогенными бактериями биопленок (Валышев А.В. и соавт., 2009).
До последнего времени при определении этиологии неспецифических инфекций решающее значение придавалось численности обнаруженных условно патогенных микроорганизмов в пораженном органе, а в случае микстинфекции - установлению количественных соотношений между ассоциантами (Бухарин О.В. с соавт., 1998, 2002). Вместе с тем, в подобных ситуациях многими исследователями (Семенов А.В, 2009; Ва-хитов Т.Я., 2007 Barefoot S.F. et al., 1994, Mearns-Spragg A. et al., 1998, Yan L. et al., 2003, Dubuis C, Haas D., 2007) более существенным признается определение у выделенных культур факторов патогенности и оценка характера взаимоотношений, складывающихся между сочленами микробных сообществ в том или ином биотопе. Особое внимание при этом уделяется продукции ряда ферментов (Odds F.C., 2008; Bernardo S.M., 2008; Gaillardin С, 2010), уровень которой может колебаться в широких пределах в зависимости от условий, существующих в макроорганизме и создаваемых in vitro, что приводит к искажению истинной картины, характеризующей вклад изолируемых штаммов в инфекционный процесс. Отсутствие стандартов по набору изучаемых параметров и условиям их определения для грибов рода Candida делает необходимым накопление и обобщение максимально большего количества наблюдений в этой области для выработки четких критериев, позволяющих однозначно охарактеризовать патогенность штамма, разграничивая кандидоз и кандидоносительство.
Цель настоящего исследования: совершенствование лабораторной диагностики вагинальной кандидозной инфекции на основе изучения видового состава, биологических особенностей изолируемых грибов рода Candida, а также характера их взаимоотношений с сопутствующей микрофлорой.
Основные задачи исследования:
Изучить частоту встречаемости грибов рода Candida в составе микрофлоры влагалища женщин репродуктивного возраста в период 2005-2009 гг.
Оценить видовой спектр и чувствительность к антимикотическим препаратам изолируемых грибов рода Candida в динамике.
Определить особенности микроскопической картины при изучении нативного материала, а также морфологических и культуральных свойств штаммов Candida, изолируемых из вагинального биотопа.
Изучить основные факторы патогенности грибов (морфологическая трансформация, фосфолипазная и протеолитическая активность), пленкообразование и влияние абиотических факторов (длительность инкубации, рН, Т) на их проявление.
Проследить особенности взаимодействия основных представителей условно патогенной грибковой и бактериальной флоры влагалища.
Научная новизна исследования. На основе комплексного анализа фенотипических характеристик обоснован новый подход к определению этиологической значимости грибов рода Candida, изолируемых при микробиологическом исследовании вагинального содержимого. Показаны отличия морфологических и биохимических свойств штаммов в зависимости от их роли в биотопе (комменсал - возбудитель инфекционного процесса), что позволяет систематизировать изоляты по их способности колонизировать, либо вызывать инфекционный процесс в макроорганизме на этапе скрининга. Впервые изучено влияние абиотических факторов на проявление патогенных свойств «вагинальными» культурами С. albicans. Подобраны условия (состав среды для культивирования, рН, температура инкубации) для проведения экспериментов in vitro, наиболее приближенные к жизнедеятельности грибов в макроорганизме. Впервые установлено разнонаправленное изменение пленкообразующей активности С. albicans под влиянием абиотических факторов и бактериальных метаболитов, а также интенсивности формирования смешанных биопленок в зависимости от взаимоотношений, складывающихся между микроорганизмами-ассоциантами (антагонизм - нейтрализм - синергизм).
Теоретическая и практическая значимость. Выработан новый подход к оценке этиологической значимости Candida spp. при их обнару-
жении в исследуемом материале, учитывающий биологические особенности изолятов и условия их культивирования. Предложен новый способ оценки взаимоотношений между микроорганизмами, населяющими вагинальный биотоп, с учетом изменения их пленкообразующей активности при совместном культивировании. Это позволит врачу практического звена здравоохранения адекватно интерпретировать получаемые результаты микробиологического обследования и оценивать состояние микробиоценоза влагалища женщин репродуктивного возраста.
Результаты исследования могут быть использованы как один из критериев диагностики вульво-вагинального кадидоза и прогнозирования микотических осложнений при оценке репродуктивного здоровья женщин, прежде всего в период прегравидарной подготовки и при наступлении беременности.
Основные положения, выносимые на защиту:
В многолетней динамике (2005-2009гг.) наметилась стабилизация показателей инфицированности женщин репродуктивного возраста грибами рода Candida, в видовой структуре которых устойчиво доминируют представители С. albicans. При этом регистрируется множественная лекарственная устойчивость ne-albicans видов и увеличение дозозависимой чувствительности к флуконазолу среди С. albicans.
Биологические особенности Candida spp., вызывающих инфекционные процессы во влагалище, обусловливают необходимость комплексного подхода к оценке этиологической значимости изолируемых штаммов с учетом их количества, морфо-функциональных характеристик, набора факторов патогенности и влияния условий культивирования на их проявление.
О характере взаимоотношений, складывающихся в вагинальном биотопе между компонентами грибково-бактериальных ассоциаций, можно судить по результатам сравнительного анализа показателей, характеризующих интенсивность формирования ими моно- и смешанных биопленок in vitro.
Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены и обсуждены на V Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009), IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2010), заседании Пермского отделения Всероссий-
ского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Пермь, 2008, 2010), XII Международном конгрессе MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии (Москва, 2010).
Диссертация апробирована на расширенном заседании научного координационного Совета по микробиологии ГОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава» от 30 сентября 2010 г.
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Внедрение в практику. Результаты работы внедрены в практику ЦВ1111 МСЧ №9, применяются в работе бактериологических лабораторий МУЗ ГКБ №7, ГУЗ КПКД №1 «Фтизиопульмонология». Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А.Вагнера Росздрава № государственной регистрации темы 01.2.00709666.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 190 источников, из них 82 отечественных и 108 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 18 рисунками.
Список принятых сокращений: УПМ - условно патогенные микроорганизмы, МТ - морфологическая трансформация, ФЛА - фосфолипаз-ная активность, ПА - протеазная активность, ФЛ - фосфолипаза, ОП -оптическая плотность, ЦК - цитологический коэффициент.
Благодарности. Автор выражает благодарность заведующей бактериологической референс-лаборатории МУЗ ГКБ №7 Авдеевой Н.С. за предоставленные образцы и помощь в проведении микологических исследований.
Таксономия, морфологические и культуральные свойства грибов рода Candida
В настоящее время существует несколько вариантов классификаций грибов [53; 58; 106]. Род Candida включает более 150 видов грибов, которые в настоящее время относят к дейтеромицетам в связи с полным отсутствием половой стадии развития. Семь из этих видов: С. albicans, С. tropica/is, С. kmsei, С. kefyr, C.(Tornlopsis) glabrata, С. guilliermondii, С. parapsilosis - признаны с медицинской точки зрения наиболее важными болезнетворными микроорганизмами [112; 135; 159]. С.albicans является наиболее распространенным представителем рода, изолированным от человека, и известен как комменсал и как условно патогенный микроорганизм [112; 181]. Грибы рода Candida — дрожжевые (ранее их относили к дрожжеподобным) грибы, лишенные половой стадии жизненного цикла, с почкованием исключительно по голобластическому типу (в формировании дочерней клетки участвуют все слои материнской клеточной стенки) [46].
Виды Candida spp. способны образовывать псевдомицелий, в то время как образование мицелиальных структур не является критерием принадлежности к роду; могут иметь или не иметь рудиментарные псевдогифы, но не исключается наличие истинных гиф; они не образуют меланина и каротиноидных пигментов, дают отрицательный тест с синим диазонием В (DBB), не имеют уреазной активности (кроме некоторых штаммов С. krusei), клеточный гидролизат не содержит ксилозы. Генетическая систематика основана на определенной последовательности молекулярного строения цепей ДНК, кодирующих рибосомальную РНК и ДНК генома митохондрий, кроме того от ближайших родственных грибов Candida spp. отличается по количеству пар нуклеотидов [46]. Грибы рода Candida имеют различие не только по морфологическим и биохимическим свойствам, но и, как следствие, особенности лабораторных способов выделения и диагностики, и, что наиболее важно - различную чувствительность к современным антимикотикам.
Дрожжевая фаза представлена клетками овальной, округлой или овально-вытянутой формы, относительно крупных размеров 1,5-8 х 1,5-14. Давно ведется поиск корреляций между вирулентностью штаммов С. albicans и их морфобиологическими свойствами. Есть указания на то, что наиболее вирулентные штаммы имеют мелкие, круглые клетки [57; 72J. В настоящее время хорошо изучена ультраструктура гриба: выявлена 5-6 слойная (до 8 слоев) клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, ядро, ограниченное ядерной мембраной, вакуоли, митохондрии, нитевидный компонент микрокапсулы, трабекулярные каналы клеточной стенки и другие компоненты клетки. Клеточная стенка многослойная, с делением на внешние и внутренние слои, и именно она значимо отличается по строению от клеточной стенки других высших эукариотов, определяя вирулентность грибов [31; 46; 116]. Единственной формой размножения является почкование, которое происходит путем отшнуровывания различно расположенных выпячиваний. Молодые отделяющиеся клетки, почкуясь, создают своеобразное расположение клеток - мутовки или вертициллы. Структуры, которые являются результатом незавершенного процесса отделения клеток от материнской, характеризуют нитчатую фазу — псевдомицелий.
За последние 20 лет получено много интересных новых данных о морфологии, изменчивости, антигенной структуре дрожжевых грибов, позволяющих углубить знания с точки зрения их патогенетических возможностей [29; 43; 64; 65; 117; 134]. Candida spp. являются аэробами, лучше растут на специальных средах с добавлением углеводов (глюкозы), но могут размножаться и на простых. Оптимальная температура роста грибов+22-37С. Патогенные для человека виды растут при 37С. Оптимум рН 5,6-6,5, но рост возможен и при более кислой реакции среды (рН = 2,5-3). В экспериментальных условиях доказано, что рН среды может существенно влиять на функциональное состояние С. albicans [134; 150]. Специальными средами для их выращивания являются глюкозо-пептонный агар, кукурузный питательный агар, среда Сабуро. Колонии на глюкозо-пептонной среде при + 25С через 24-48 часов роста - молочно-белые, беловато-кремовые с тусклым блеском; вначале гладкие, влажные, при дальнейшей инкубации могут стать морщинистыми. Грибы достигают начала стационарной фазы размножения в течение 48 часов, при этом все биохимические процессы достигают своего пика. Однако после 2 суток роста культура начинает «стареть», изменяя первоначальные свойства штамма [43]. На рисовом агаре у гриба образуются толстостенные хламидоспоры. Идентификацию грибов проводят учитывая совокупность морфологических и культуральных признаков (табл.1)[66]. Идентификационные признаки грибов Candida spp.: - форма вертицилл и расположение по отношению к псевдомицелию - так называемые типы роста (филаментация), - способность гриба ферментировать сахара с образованием кислоты и газа, - наличие хламидоспор - крупных спор, размером до 15 х 22 мкм, с двойной оболочкой и зернистой компактной протоплазмой (способностью образовывать хламидоспоры обладает наиболее патогенный и инвазивный вид - С. albicans).
Микробиологическое исследование образцов вагинального секрета
На подсушенные чашки Петри с LB- агаром по их диаметру петлёй d = 3,5 мм (10) высевали двумя параллельными штрихами культуру С. albicans, посевы инкубировали в термостате при температуре 37 С в течении 6, 24, 48, 72 часов. Отступив от выросшей культуры на 2 мм, перпендикулярными штрихами подсевали тест-штаммы. Учет результатов проводили через 18, 24, 48, 72 ч совместного культивирования при 37С по величине зон угнетения роста тест-штаммов (измеряя эти зоны линейкой: от испытуемой культуры до начала роста тест-штамма в мм) 1-5 мм влияние отсутствует, 6-10 мм низкая антагонистическая активность, 10-15 мм средняя, более 16 мм высокая. Все эксперименты по изучению взаимного влияния микробных культур проводили в 4-х повторностях.
Суточные бульонные культуры грибов стандартизировали до 5 ед. по МФ, бактериальные до 0,5 по МФ и в разведении 1/100 инокулировали в лунки по 100 мкл каждого вида в 4-х повторах в сочетании С.albicans + E.coli, С. albicans + К. pneumoniae, С. albicans + P. aeruginose, С. albicans + S. aureus, С albicans + S. haemolyticus). Контролем служили лунки с бульонной культурой бактерий каждого вида (монопленки) и лунки со стерильным LB-бульоном. Закрытые планшеты выдерживали в термостате при 37С в течение 48 часов. Затем бульон из лунок аккуратно удаляли, и планшеты однократно промывали дистиллированной водой. Далее пленки окрашивали 200 мкл 0,1 % водного раствора генцианвиолета в течение 45 минут в темноте. После тщательного трехкратного отмывания лунок дистиллированной водой и высушивания планшетов определяли массивность пленок по интенсивности их окрашивания. Для этого краситель элюировали 96 % спиртом и определяли показатель оптической плотности (ОП) элюата, который соответствует уровню пленкообразования [77]. Количественным выражением массивности сформированных биопленок служили значения ОП58о, измеряемые на планшетном спектрофотометре Benchmark Plus (Bio-Rad, США). Затем сравнивали усредненные показатели оптической плотности элюата из смешанных биопленок с суммой показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур. Если наблюдали аддитивный эффект, т.е. показатель смешанной биопленки (ОП т1Х) достоверно не отличался от суммы показателей каждого тестируемого штамма (ОП1+ОП2) -регистрировали нейтральный характер, если показатель ОПт1Х ОП,+ОП2 -синергический характер, если показатель ОП тіх ОГІі+ОП2 -антагонистический характер в межмикробном взаимодействии. Для изучения влияния экзометаболитов тест-штаммов на формирование биопленок грибов культуральную жидкость отделяли фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм после 18-часового культивирования тест-культур. Для определения показателя пленкообразования в присутствии микробных метаболитов готовили смесь из 100 мкл суспензии С. albicans и 100 мкл культуральной жидкости тест-культуры. Дополнительным контролем служили лунки с бульонной культурой микроорганизмов каждого вида. 2.5 Методы статистической обработки
Статистическую обработку данных и графическое изображение результатов проводили с использованием программ Statistica 6,0 и Excel 2003, а также авторского [B.C. Шелудько, 2001] пакета прикладных электронных таблиц (ППЭТ) "Stat2000". Различие показателей оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента. Для оценки связи двух признаков рассчитывали величину статистического критерия % -квадрат, а силу связи признаков измеряли коэффициентом сопряженности (информативности) Пирсона.
Достоверность %2 оценивали по уровню значимости р, который в стандартных медицинских статистических исследованиях должен быть менее 0,05 [8; 20; 80].
Для определения наличия и степени зависимости двух количественных признаков использовался коэффициент корреляции R.
Оценка степени зависимости: при 0,00 R 0,30 - зависимости нет; 0,31 R 0,70 - зависимость умеренная; 0,71 R 1,00 - выраженная (при достоверности выборочного R р 0,05).
Внутригодовая динамика инфицированности влагалища женщин репродуктивного возраста грибами рода Candida
Полученные in vitro количественные показатели могут искаженно характеризовать процессы, происходящие в макроорганизме, завышая или снижая степень обсемененности исследуемого материала, поэтому при оценке этиологической роли УПМ наиболее перспективным считается определение у них факторов патогенносте. Ценность этого критерия повышается при выявлении не одного, а нескольких факторов и, особенно, в достаточно высокой дозе или активности. В то же время, методики для их выявления и оценки активности, либо отсутствуют, либо сложны и долговременны, что снижает возможность использования этого важного критерия в клинической практике. Вместе с тем, в специальной литературе имеются указания на то, что проявление патогенных свойств микроорганизма в значительной степени зависят от условий, складывающихся в том или ином биотопе. Общеизвестно, что при возникновении и развитии патологических процессов во влагалище существенное значение имеет рН вагинального секрета. При развитии в нижних отделах урогенитального тракта воспалительного процесса, рН влагалищной среды смещается до 7,0 и выше. Для сравнительной оценки влияние рН (рЫ = 7,0 и рН = 4,0) были проанализированы штаммы С. albicans обеих групп. Другим параметром, позволяющей дифференцировать потенциально патогенные штаммы от сапрофитов внешней среды является температура культивирования. Зависимость проявления биологических свойств изучали с учетом убиквитарности этих микроорганизмов, в 2-х температурных режимах (Т = 25С и 37 С).
Значительная доля исследованных нами штаммов - 93,8 % - при культивировании на специальных средах (HiMedia, М 113, Chlarnydospore Agar, рН = 5,6) проявляла способность к филаментации (рис. 9).
Однако проявление этого признака происходило в разные сроки и зависело от температуры культивирования: при Т = 37С через 24 часа только 2 штамма образовывали псевдомицелий, через 48 часов половина культур, через 72 часа 70 %. При инкубации Т = 25С процесс филаментации регистрировали лишь у одного штамма через 48 часов, а к последнему дню эксперимента менее 50 % культур переходили в гифальную форму.
Наиболее существенное влияние на процесс морфологической трансформации грибов оказывали такие параметры, как рН среды и температура культивирования тестируемых штаммов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при Т = 37С способность к морфологической трансформации и переход в гифальную форму при pH = 7,0 регистрировали у 98,8 ± 1,2 % исследованных изолятов, в то время как на средах с рН = 4,0 их доля составила 71,6 ± 5,0 % (рис. 10). рн=7,0 Рис. 10 Влияние рН среды на процессы филаментации при Т = 37С
Степень выраженности влияния этого фактора сохранялась и при Т = 25С (58,0 ± 5,5 % и 39,5 ± 5,4 % культур соответственно), хотя понижение температуры в свою очередь тормозило процессы трансформации. Сроки перехода изолированных культур из дрожжевой формы в гифальную также зависели от перечисленных параметров. Так, образование псевдомицелия на средах с рН = 7,0 регистрировали через 24 часа только у каждого двадцатого штамма, через 48 часов — более чем у половины, а через 3-е суток почти все изученные культуры формировали гифы (р 0,05). Напротив, при Т = 25С и при тех же значениях рН среды на третьи сутки менее половины вагинальных штаммов грибов были способны к филаментации. При рН = 4,0 формирование псевдомицелия происходило значительно медленнее: при Т = 37С через 48 часов переход в гифальную форму наблюдали только у 2 штаммов, через 72 часа — лишь у каждого 5-6, а по завершению экспериментальных наблюдений гифальные элементы обнаруживали у 72 % грибковых культур (р 0,05); при Т = 25С на 6 сутки инкубации менее 40 % вагинальных штаммов были способны к филаментации. Сравнительный статистический анализ представленных данных показал достоверность различий при культивировании грибов на средах с рН = 7,0 и с рН = 4,0 при разных температурных режимах.
Как и можно было ожидать, штаммы С. albicans, изолированные при различных состояниях, в значительной степени различались по изучаемому свойству (табл. 12).
Культуральное исследование вагинального секрета
В последнее время наблюдается все более широкое распространение смешанных инфекций влагалища. Известно, что между микробными компонентами при формировании биопленок существуют многообразные метаболические взаимоотношения, при которых взаимодействие имеет либо односторонний характер, либо наблюдается взаимное положительное влияние компонентов биопленок друг на друга [65].
Учитывая, что устойчивые ассоциации грибов с грамотрицательными и грамположительными бактериями часто выделяются при кандидозной инфекции влагалища, была проведена серия специальных экспериментов по формированию ими смешанных биопленок.
Для исследования характера отношений между грибами и бактериями нами предложен и апробирован метод, основанный на сравнительной оценке интенсивности пленкообразования моно- и смешанными культурами (Приоритетная справка № 2010127885 от 06.07.2010). Согласно предлагаемой нами методике, сравнивали между собой усредненные показатели оптической плотности элюата из биопленок смешанных и монокультур. Если наблюдали аддитивный эффект, т.е. показатель смешанной биопленки (ОП miv) достоверно не отличался от суммы показателей каждого тестируемого штамма (ОП і+ОП 2) -регистрировали нейтральный характер, если показатель ОПтіх ОП]+ОП2 -синергический характер, если показатель ОП т{х ОП]+ОП2 -антагонистический характер в межмикробном взаимодействии. В табл.26 в качестве примера приведены результаты исследования двух типичных для каждой группы наблюдения представителей С. albicans при взаимодействии с рядом референс-штаммов из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича, поскольку наиболее часто в составе микробных ассоциаций обнаруживали представителей именно этих таксонов. Интересно отметить, что в наших наблюдениях при изучении формирования смешанных пленок грамположительными и грамотрицательными бактериями с исследуемыми штаммами С. albicans, были выявлены все три типа взаимодействия: индифферентный (нейтрализм), стимулирующий (синергизм) и ингибирующий (антагонизм) с преобладанием синергичных отношений. Как следует из таблицы 26, степень их выраженности колебалась в широких пределах, проявляясь незначительными, а, зачастую, и достоверно значимыми отличиями величины пленкообразования у разных штаммов грибов.
Характер взаимоотношений нашел отражение и при микроскопическом изучении сформировавшихся пленок. На рис. 15 а, б видно, что филаментирующие формы грибов инициируют формирование смешанной биопленки.
Изображения смешанных бактериально-грибковых пленок, полученные при инструментальном увеличении 100x1,36x10 Бластоспоры чаще «ведут» себя индифферентно (рис. 15 в), либо проявляют антагонизм в отношении бактерий-ассоциантов (рис. 15 г). Интересно было проследить изменение пленкообразующей активности С. albicans не только под влиянием клеток тестируемых штаммов при совместном культивировании, но и их культуральной жидкости, лишенной клеточных компонентов. В табл. 26 в качестве примера приведены типичные результаты сравнительной оценки интенсивности пленкообразования при совместном культивировании штамма С. albicans с фильтратами культуральных сред (LB-бульона) бакгерий-ассоциантов после суточной экспозиции в термостате при 37С.
Как следует из представленных данных, штаммы грибов по-разному реагировали на добавление культуральных сред, содержащих метаболиты различных тест-культур. Более того, нередко разнонаправленным оказывался эффект взаимодействия тестируемых штаммов грибов и бактерий между собой по сравнению с изменением интенсивности пленкообразования С. albicans в присутствие бактериальных метаболитов. Однотипная реакция и значительное усиление пленкообразования у штаммов отмечено лишь в случае их культивирования с продуктами метаболизма P. aeruginosa. Известно, что синегнойная палочка является «сильным» антагонистом и активным продуцентом экстрацеллюлярных продуктов с высокой биологической активностью. Возможно, «уход в пленку» является проявлением защитной реакции С. albicans. Установлено определяющее значение клеточных компонентов тест-культур грамположительных бактерий, поскольку при выращивании С. albicans в присутствии их бесклеточных фильтратов не наблюдалось значимого изменения уровня пленкообразования у грибов. В то же время в результате совместного культивирования штаммов были прослежены разнонаправленные эффекты.
