Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Биологические свойства грибов рода candida и особенности их взаимодействия с микроорганизмами (обзор литературы)
1.1. Факторы патогенности грибов рода Candida 10
1.2. Факторы персистенции грибов рода Candida 18
1.3. Антибиотикорезистентность грибов рода Candida 21
1.4. Взаимодействие бактерий и грибов рода Candida 26
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 34
2.1. Выделение и идентификация грибов рода Candida 34
2.2. Методы определения факторов патогенности грибов рода Candida 35
2.3. Методы определения факторов персистенции грибов рода Candida 39
2.4. Методика определения способности грибов рода Candida к биопленкообразованию 42
2.5. Метод определения чувствительности грибов рода Candida к антимикотикам 43
2.6. Методика обнаружения генов, кодирующих резистентность к антимикотикам грибов рода Candida 44
2.7. Выделение и идентификация бактерий рода Lactobacillus spp. и Enterococcus spp. 46
2.8. Методика обнаружения генов, кодирующих факторы вирулентности бактерий рода Enterococcus spp. 48
2.9. Методика совместного культивирования грибов рода Candida и бактерий родов Lactobacillus spp. и Enterococcus spp. 50
2.10. Методы статистической обработки результатов 50
ГЛАВА 3. Видовой состав и биологические свойства грибов рода candida, выделенных из разньгх биотопов тела человека в норме 51
3.1. Видовой состав грибов рода Candida, выделенных в норме 51
3.2. Биологические свойства грибов рода Candida, выделенных в норме 51
ГЛАВА 4. Видовой состав и биологические свойства грибов рода candida, выделенных из разньгх биотопов тела человека при инфекционно воспалительных заболеваниях и дисбиозе 59
4.1. Видовой состав грибов рода Candida 59
4.2. Биологические свойства грибов рода Candida 61
4.3. Факторы персистенции грибов рода Candida
ГЛАВА 5. Антибиотикорезистентность грибов рода candida, выделенных из разных биотопов тела человека при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе
ГЛАВА 6. Сравнительная характеристика биологических свойств грибов рода candida, выделенных из разных биотопов
ГЛАВА 7. Изучение особенностей межмикробных взаимодействий грибов рода candida и бактерий родов lactobacillus иenterococcus
Заключение 114
Выводы 128
Библиографический указатель
- Антибиотикорезистентность грибов рода Candida
- Методы определения факторов персистенции грибов рода Candida
- Биологические свойства грибов рода Candida, выделенных в норме
- Биологические свойства грибов рода Candida
Введение к работе
Актуальность проблемы
Дрожжеподобные грибы рода Candida, являясь комменсалами, обитающими в пищеварительном или/и дыхательном и урогенитальном трактах, на поверхности кожи, могут вызывать развитие заболеваний (Мамедова Л.Р. Караев З.О., 2010; Кузьмина Д.А. с соавт., 2011). Грибы рода Candida в биотопах тела человека выживают в условиях постоянного воздействия факторов врожденного и адаптивного иммунитета, используя механизмы супрессии/нейтрализации компонентов антимикробной защиты макроорганизма. Так, у грибов, выделенных при дисбактериозе кишечника, вагинальном кандидозе и хронических инфекционно-воспалительных заболеваниях придатков матки выявлены антилизоцимная, антикомплементарная, антилактоферриновая активности (Валышев А.В. с соавт. 2003; Рафикова Л.М., 2009), а у грибов, колонизирующих полость рта, – антиинтерфероновая активность (Четвертнова Г.А., 2008).
Вместе с тем среди Candida spp. встречаются штаммы, устойчивые к современным антимикотикам. Устойчивость Candida spp. к противогрибковым препаратам может проявляться на разных уровнях: генетическом, клеточном, популяционном и видовом. С распространением заболеваемости кандидозом и широким использованием противогрибковой терапии проблема устойчивости Candida spp. приобретает все большую значимость.
Присутствуя в биоценозе, грибы рода Candida взаимодействуют с другими видами условно-патогенных микроорганизмов и представителями нормофлоры. В микробных ассоциациях между разными видами микроорганизмов возникают неоднозначные взаимоотношения, что может оказать существенное влияние, как на колонизацию слизистой, так и на течение инфекционного процесса (Долгушина В.Ф. с соавт., 2004; Karagozov I. et al., 2004). В подобных ситуациях многими исследователями (Семенов А.В., 2009; Вахитов Т.Я., 2007; Barefoot S.F. et al., 1994; Mearns-Spragg A. et al., 1998; Yan L. et al., 2003; Dubuis C., Haas D., 2007) существенным признается определение у выделенных культур факторов патогенности и персистенции и оценка характера взаимоотношений, складывающихся между сочленами микробных сообществ в том или ином биотопе.
В настоящее время накоплен большой фактический материал по взаимодействию грибов рода Candida и представителей нормофлоры. Однако вопрос об изменении биологических свойств данных микроорганизмов при инфекции остается недостаточно изученным.
В этой связи, известный интерес представляет, с одной стороны, изучение особенностей видового состава и комплекса биологических характеристик грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека в норме, при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиотических состояниях, а с другой – особенностей межмикробных взаимодействий микроорганизмов-симбионтов в условиях грибково-бактериальных ассоциаций.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования является сравнительное изучение видового состава и биологических свойств грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека в норме, при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиотических состояниях, а также особенностей их взаимодействий с бактериями-доминантами и ассоциантами.
Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи:
1. Изучить видовой состав грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека в норме, при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе.
2. Оценить комплекс биологических свойств грибов рода Candida (факторы патогенности, персистентные характеристики, способность к образованию биопленок, антибиотикорезистентность).
3. Изучить молекулярно-генетические механизмы патогенности и резистентности грибов рода Candida к антимикотическим препаратам.
4. Изучить особенности межмикробных взаимодействий грибов рода Candida с бактериями-доминантами и ассоциантами.
Научная новизна
Проведен сравнительный анализ видового разнообразия грибов рода Candida в различных биотопах тела человека (ротовая полость, кишечник, репродуктивный тракт) в норме и при патологических состояниях (дисбиозы, острая и хроническая инфекционно-воспалительная патология). Установлено увеличение количества видов грибов при патологических состояниях по сравнению с нормой, доминирующим видом является C.albicans.
Впервые охарактеризован широкий спектр биологических свойств грибов рода Candida spp., включающий факторы патогенности, факторы персистенции, способность к образованию биопленок и антибиотикорезистентность, на фенотипическом уровне и с использованием молекулярно-генетических исследований. На основе полученных данных охарактеризованы биопрофили грибов рода Candida, выделенных при инфекционно-воспалительных заболеваниях из разных биотопов и дисбиозе кишечника. Показано, что экспрессия персистентных свойств у грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека, экологически детерминирована и проявляется в соответствии с уровнем факторов естественной резистентности в биотопе.
Установлена важная патогенетическая роль персистентных характеристик грибов Candida в развитии инфекционно-воспалительных заболеваний: они широко распространены среди штаммов, выделенных из всех исследованных биотопов, при этом выраженность исследуемых признаков выше при хроническом течении инфекционно-воспалительных заболеваний по сравнению с острым течением.
Проведенными молекулярно-генетическими исследованиями у C.albicans установлено наличие генов секретируемых аспартат протеиназ (SAP1-4, SAP6-7, SAP9-10) и генов антибиотикорезистентности (MDR1, FLU1, CDR1) как у грибов, выделенных у здоровых лиц, так и при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе.
При изучении межмикробных связей индигенной и ассоциативной микрофлоры кишечника и репродуктивного тракта при дисбиозе и инфекционно-воспалительных заболеваниях с C.albicans установлено преимущественное подавление факторов персистенции C.albicans под действием индигенной микрофлоры и их повышение под действием ассоциантов.
Практическая ценность
Полученные данные расширяют теоретические представления о биологических свойствах грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека в норме, при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника, а также характере межмикробных взаимодействий.
Полученные результаты о распространенности и выраженности факторов персистенции у грибов рода Candida, могут быть использованы при прогнозировании течения инфекционно-воспалительных заболеваний.
Выявленные особенности регулирующего воздействия индигенной микрофлоры (лактобактерии, энтерококки) на факторы персистенции грибов рода Candida могут быть использованы в качестве дополнительных критериев отбора эффективных пробиотиков с целью коррекции дисбиозов кишечника и влагалища.
Определен спектр антимикотиков в отношении грибов рода Candida, изолированных из разных биотопов тела человека при инфекционно-воспалительных заболеваниях. Полученные данные могут быть использованы при выборе эффективных препаратов для эмпирической терапии больных кандидозом.
Положения, выносимые на защиту
1. Различные биотопы тела человека характеризуются особенностями видового состава грибов рода Candida в норме, при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника, а выраженность биологических свойств у данных микроорганизмов является информативным критерием их экотопной принадлежности.
2. Качественный спектр биологических свойств и количественные параметры факторов персистенции у грибов рода Candida определяют направление развития инфекционного процесса.
3. Межмикробные бактериально-грибковые взаимодействия при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника характеризуются преимущественным подавлением факторов персистенции C.albicans под действием представителей индигенной микрофлоры и стимуляцией – под влиянием ассоциативных бактерий.
Апробация работы. Материалы работы были доложены и обсуждены на VI и VII всероссийской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009; 2012); всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2009); всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009); научно-практической конференции «Экология. Природные ресурсы. Рациональное природопользование. Охрана окружающей среды» (Москва, 2009); всероссийской научно-практической конференции по медицинской микологии «Микозы и микоаллергозы, нозокомиальные грибковые инфекции» (Санкт-Петербург, 2010); V научно-практической конференции с международным участием «Студенты и аспиранты в науке – 2011» (Оренбург, 2011); межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Оренбург, 2011); всероссийской научно-практической конференции по медицинской микологии «Микозы и микоаллергозы. Новые технологии в микробиологической диагностике» (Санкт-Петербург, 2011); I молодежной научной школе-конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011); Российской научно-практической конференции «Медико-социальные аспекты формирования вторичных иммунодефицитных состояний у жителей Южно-Уральского региона» (Оренбург, 2011); III Междисциплинарной конференции молодых ученых УрО РАН (Оренбург – Бузулук, 2012).
Фрагменты работы были представлены на областных конкурсах научно-исследовательских работ и отмечены премией Правительства Оренбургской области (2011) и премией Губернатора Оренбургской области (2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 9 публикаций в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертационной работы
Текст диссертации изложен на 165 страницах машинописи, содержит введение, 8 глав собственных исследований, заключение, выводы, указатель литературы, включающий 130 отечественных и 60 иностранных источников и приложение.
Связь работы с научными программами. Представленные данные являются составной частью тем открытого плана НИР ИКВС УрО РАН «Формирование и функционирование микробных симбиозов в живых системах» (№ гос. регистрации 01.2010.67427) и «Эндогенные инфекции как проявление нарушения ассоциативного симбиоза» (№ гос. регистрации 01.2010.67429).
Антибиотикорезистентность грибов рода Candida
Большое число работ посвящено изучению устойчивости грибов рода Candida, выделенных при разных нозологических формах, к антимикотикам (Goldman R.C., 1995; Pearson М.М. et.al, 2003; Karkowska J. et al., 2009; Man-junath P., 2009; Nagappan V. et al., 2010; Tschemer M. et al, 2011).
В.Г. Арзуманян с соавт. (2010) изучена лекарственная устойчивость у дрожжей, выделенных из мокроты больных с различными бронхолегочными заболеваниями. Установлено, что на протяжении 10 лет происходило снижение чувствительности к препаратам азольного ряда - кетоконазолу, клотри-мазолу, флуконазолу и итраконазолу. В то же время повысилась чувствительность дрожжевых культур к пимафуцину.
Исследование антимикотикочувствительности дрожжеподобных грибов С. albicans, С. glabrata, С. tropicalis, Candida spp,, выделенных из биотопов больных острой лейкемией показало, что 92,3% штаммов, выделенных из зева, чувствительны к амфотерицину В и клотримазолу, 84,6% к нистатину. 80,0% культур, изолированных из носовой полости, проявляли чувствительность к амфотерицину (Рыбальская А.П. с соавт., 2008).
Показатели уровней активности исследуемых антимикотиков по отношению к С. albicans, выделенных у пациентов с угревой болезнью, распределились в следующем порядке: флуконазол, итраконазол, кетоконазол, клотримазол, амфотерицин. Все штаммы редких видов кандид обнаруживали 100%-ную чувствительность к амфотерицину. Штаммы С. parapsilosis и С. tropicalis имели высокую чувствительность к флуконазолу, итраконазолу, кетоконазолу, флуконазолу, штаммы С. glabrata и С. krusei - к кетоконазолу и итраконазолу, С. ciferrii - к итраконазолу. Самым неактивным в отношении всех видов дрожжеподобных грибов оказался нистатин (Рахманова С.Н. с соавт., 2009).
В работе Е.Б. Авалуева с соавт. (2010) показана эффективность нере-зорбируемого в кишечнике препарата натамицин (Пимафуцин), используемого для деконтаминации Candida spp. и коррекции кандидозного дисбиоза с оценкой его влияния на поп-albicans виды Candida. С.Д. Митрохин (2003) провел анализ чувствительности штаммов Candida spp. к противогрибковым препаратам и показал, что среди видов С. albicans, С. tropicalis и С. pseudotropicalis не обнаружено штаммов, резистентных к антимикотикам. По данным исследований Т.А.Желтиковой, A.M. Глушаковой (2010) среди выделенных культур Candida к амфотерицину В, флуконазолу, кетоконазолу, миконазолу, нистатину резистентны лишь 1,8 -9,2% штаммов.
Проведена сравнительная оценка чувствительности клинических штаммов дрожжеподобных грибов рода Candida, выделенных из фекалий и влагалища, к противогрибковым препаратам. Чувствительность кишечных и влагалищных изолятов к полиенам составила: нистатину - 25% и 46%; амфотерицину В - 7% и 15% соответственно; имидазолам: клотримазолу -76,4% и 84,6%; кетоконазолу - 23,8% и 41,6% соответственно. Отмечена высокая резистентность штаммов, выделенных как при кандидозе кишечника, так и кандидозе влагалища, к флуконазолу и итраконазолу: чувствительность к флуконазолу составила в первом случае 6% и 18,2% во втором, к итраконазолу - 3,6% и 0 соответственно (Захарова Е.А. с соавт., 2006).
Проведенный обзор литературы показал, что данные об отношении грибов рода Candida к антимикробным препаратам носят противоречивый характер. Однако, среди Candida spp. нередко встречаются штаммы, устойчивые к современным антимикотикам. С распространением заболеваемости кандидозом и широким использованием противогрибковой терапии проблема устойчивости Candida spp. приобретает все большую значимость.
Как свидетельствуют многочисленные исследования различных авторов, развитие инфекционного процесса зависит не только от особенностей инфицируемого организма и инфекта, но в значительной степени от качественного и количественного состава «сочленов» микробного сообщества, которое формируется в колонизируемом биотопе. В.А. Дробковой (2009) изучен характер взаимоотношений между С. albicans и условно-патогенными бакте риями, изолированными от женщин с вагинальным дисбиозом. Все исследованные штаммы грамотрицательных бактерий (Е. coli, К. pneumoniae, P. mi-rabilis) проявляли в отношении С. albicans антагонистическую активность различной интенсивности, наиболее активными были штаммы P. mirabilis. Грибы, в свою очередь, не оказывали влияния на развитие грамотрицатель-ной микрофлоры, лишь однажды был зарегистрирован бактериостатический эффект в отношении Е. coli. Отмечено замедление роста культур S. aureus и С. albicans при совместном культивировании, тогда как в половине случаев коагулазоотрицательные стафилококки и С. albicans не оказывали влияния на рост друг друга. Антагонистическую активность проявляли 22,2% штаммов стафилококков. Влияние изолятов С. albicans на грамположительные микроорганизмы было разнонаправленным. Автором сделан вывод о том, что характер взаимоотношений между C.albicans и условно-патогенными бактериями оценивается неоднозначно и требует дальнейшего изучения.
Исследования, проведенные Н.Б. Перуновой с соавт. (2010), позволили определить характер ассоциативных взаимодействий бифидофлоры с дрожжевыми грибами, выделенными из кишечника, являющийся, преимущественно, антагонистическим. Причем, под влиянием фильтратов В. bifldum и B.longum отмечено снижение АЛА у штаммов Candida albicans по сравнению с контролем, тогда как экзометаболиты культур В. adolescentis не вызывали достоверных изменений изученных свойств.
При сокультивировании представителей бифидофлоры с метаболитами Candida albicans у всех трех видов бифидобактерий (В. bifidum, В. longum и В. adolescentis) в 67 - 83 % случаев наблюдалось достоверное снижение анти-лизоцимной активности. В свою очередь установлено, что экзометаболиты бифидобактерий способны влиять на интенсивность образования биопленок Candida albicans, причем изменение данного показателя носит разнонаправленный характер. Культуры В. bifidum обладали более высокой способностью ингибировать пленкообразование грибов, чем штаммы В. adolescentis (Иванова Е.В., 2010).
Методы определения факторов персистенции грибов рода Candida
Для выделения чистых культур лактобацилл и энтерококков из женского репродуктивного тракта вагинальное содержимое собирали из заднего свода влагалища тампоном и высевали на MRS-агар («Hi Media», Индия) и Enterococcosel-Agar (CONDA, Испания), рассев проводили бактериологической петлей методом секторных посевов в соответствии с рекомендациями Ю.М. Фельдман с соавт. (1984). Посевы на MRS-arape инкубировали 48 часов при 37С в микроаэрофильных условиях, на Enterococcosel-Agar - 24 часа при 37С.
Для выделения чистых культур энтерококков и лактобацилл из кишечника использовали метод серийных разведений (Методические рекомендации, 1991). Согласно которому, 1 грамм исследуемого материала разводили в 9 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия и 0,1 мл суспензии фекалий переносили стерильной пипеткой в пробирку с 9,9 мл изотонического раствора хлорида натрия, тщательно перемешивали. Таким образом получали разведение испражнений 10"3 и также готовили последующие разведения. Из разведений фекалий 10"3 - 10"5 суспензию засевали на чашки Петри со средой Enterococcosel-Agar и культивировали 24 часа при 37 С, а из разведения 10 5 по 0,1 мл - на чашки Петри со средой MRS и культивировали 48 часов при 37 С в микроаэрофильных условиях.
Определяли принадлежность выделенных бактерий к родам Enterococcus и Lactobacillus общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимически свойств. Видовую идентификацию бактерий рода Lactobacillus проводили на основании определения ферментации углеводов с использованием углеводов и бульона с 0,3% бром крезолового зелёного (Определитель бактерий Берджи, 1997). Видовую иден тификацию бактерий рода Enterococcus проводили с помощью мультиплексной (мультилокусной) полимеразной цепной реакции по наличию видовых генов, кодирующих синтез супероксиддисмутазы (Jackson C.R. et al., 2004).
Для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) бактериальные ли-заты получали с помощью реагента «ДНК-экспресс» (Литех, Россия).
Для ПЦР-амплификации использовали известные праймеры (табл. 5). Синтез праймеров осуществлен компанией «Синтол» (г. Москва).
Для обнаружения генов, кодирующих синтез супероксиддисмутазы, в смесь для ПЦР добавляли 1 мкл каждого праймера соответствующей группы, осуществляли амплификацию фрагмента ДНК по протоколу: 1 цикл - 92 С 4 минуты; 30 циклов - 92 С в течение 30 секунд, 1 минута при 55 С, 1 минута при 72 С; 1 цикл элонгации при 72 С в течение 7 минут.
Продукты амплификации генов анализировали путем электрофоретиче-ского разделения в горизонтальном агарозном геле (1-2%), окрашенном бромистым этидием. В качестве маркеров использовали GeneRuler 1 kbp DNA Ladder и GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Feraientas, Литва). Плотность агарозного геля и маркеры молекулярного веса подбирали в зависимости от молекулярной массы продуктов амплификации. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете. Положительное заключение о наличии гена делали при обнаружении в дорожке специфической светящейся полосы определенной массы, которую устанавливали по линейке молекулярных масс. 2.8. Методика обнаружения генов, кодирующих факторы вирулентности бактерий рода Enterococcus spp. При помощи ПЦР анализа у вагиналышхи кишечных изолятов энтерококков определяли гены, кодирующие синтез известных факторов патогенносте: цитолизины - CylA, CylB, CylM, желатиназу - GelE , гиалуронидазу -HYL, поверхностные белки, участвующие в адгезии и инвазии - ESP, ASA (Semedo Т. et al., 2003; Vankerckhoven V. et al., 2004; Reviriego С et al., 2005). Для ПЦР-амплификации использовали известные праймеры, синтезированные компанией «Синтол» (г. Москва) (табл. 6).
Амплификацию проводили с 1 мкл лизата в термоциклере «Терцик» (ДНК технология, Россия) по следующему протоколу: 1 цикл - 92С, 3 мину ты; 5 циклов - 92С, 5 секунд; 59С, 5 секунд; 72С, 5 секунд; 25 циклов - 1 минута при 92С; 1 минута при 59С; 1 минута при 72С; последний цикл включал 20 секунд при 92С, 1 минута - 59С и элонгацию в течение 10 минут при 72С. Для обнаружения генов, кодирующих синтез HYL, ASA и ESP проводили мультиплексную ПЦР с 1 мкл лизата в термоциклере «Терцик» (ДНК технология, Россия) по следующему протоколу: 1 цикл - 95 С 15 минут; 30 циклов - 94 С, 56 С, 72 С по 1 минуте; последний цикл включал элонгацию в течение 10 минут при 72С.
Продукты амплификации генов анализировали путем электрофорети-ческого разделения в горизонтальном 1% или 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете. Положительное заключение о наличии гена делали при обнаружении в дорожке специфической светящейся полосы определенной массы, которую устанавливали по линейке молекулярных масс. В качестве маркеров молекулярных масс использовали GeneRuler 1 kbp DNA Ladder (Fermentas, Литва). 2.9. Методика совместного культивирования грибов рода Candida и бактерий родов Lactobacillus spp. и Enterococcus spp.
Исследовали взаимодействие грибов рода Candida и бактерий рода Lactobacillus spp. при совместном культивировании в жидкой питательной среде Brucella Broth Base - ВВВ («Hi Media», Индия), а с бактериями рода Enterococcus spp. в бульоне Шадлера («Hi Media», Индия) (Ермоленко Е.И., 2007).
Готовили взвесь суточных агаровых культур грибов рода Candida и бактерий (мутность 2 по шкале Мак Фарланда). По 0,05 мл взвеси грибов вносили в 5 мл жидкой культуральной среды и добавляли 0,05 мл бактериальной взвеси. Контролем роста служили пробы, в которые помещали бактерии и грибы отдельно. Инкубацию проводили при 37С в микроаэрофильных условиях в течение 24 часов. Затем высевали полученные культуры в объеме 0,01 мл на Сабуро и MRS-arap или Шадлер агар с 10 мкг/мл амфотерицина В. Посевы на Сабуро и Шадлер агаре инкубировали при 37 С 24 часа, а на MRS-агаре - при 48 часов при 37С в микроаэрофильных условиях.
Полученные численные материалы были обработаны статистически с определением средних значений, среднего квадратического отклонения и средней ошибки средней. Достоверность различий сравниваемых показателей оценивалась по t-критерию Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990). Различия считали достоверными при уровне вероятности ошибки р 0,05.
Биологические свойства грибов рода Candida, выделенных в норме
Фекальные изоляты С. glabrata были абсолютно чувствительны к нистатину и клотримазолу, в 50±5,2% случаев - к флуконазолу и кетоконазолу; штаммы были резистентны к амфотерицину В и итраконазолу в 100% случаев, флуконазолу и кетоконазолу - в 50±5,2% случаев.
С. kefyr, выделенные из кишечника, в 100% случаев были чувствительны к нистатину и резистентны к амфотерицину В, в 67±5,4% случаев чувствительны к кетоконазолу и клотримазолу; 67±5,4% выделенных штаммов были резистентны к итраконазолу. Число штаммов С. kefyr, резистентных к флуконазолу и клотримазолу, составило 33±5,4%. Такое же количество штаммов было умеренно устойчиво к флуконазолу, итраконазолу и кетоконазолу.
Фекальные изоляты С. krusei были чувствительны только к клотримазолу (100%) и абсолютно резистентны к другим противогрибковым препаратам.
Наиболее выраженным подавляющим действием в отношении фекальных штаммов С. tropicalis обладали нистатин и клотримазол. Чувствительностью к указанным антибиотикам обладали 100% и 75±4,2% изученных штаммов соответственно. Кетоконазол и флуконазол оказывали подавляющее действие на 50±4,8% и 25±4,2% штаммов. С. tropicalis были абсолютно резистентны к амфотерицину В и устойчивы к итраконазолу (75±4,2%) и флуконазолу (50±5,2%), к кетоконазолу и клотримазолу - в 25±4,2% случаев. Изоляты были умеренно устойчивы к трем азоловым препаратам (флуконазол, итраконазол, кетоконазол) в 25±4,2% случаев.
Анализ антибиотикорезистентности, выделенных из репродуктивного тракта грибов рода Candida, показал, что наибольшим подавляющим действием в отношении вагинальных изолятов С. albicans обладали клотримазол (54±2,8%), нистатин и итраконазол (46±2,8%), в меньшей степени флуконазол (38±3,5%), кетоконазол и амфотерицин В (31 ±3,6%). Наибольшее количество резистентных штаммов было выявлено в отношении амфотерицина В (69±3,5%) и уменьшалось в ряду: нистатин (54±2,8%), клотримазол (46±2,8%), кетоконазол, флуконазол и итраконазол (по 38±3,5%). К кетокона золу умеренно устойчивые штаммы были выявлены в 31 ±3,5%, к флуконазо-лу - в 24±4,1% и к итраконазолу - в 16±2,3% случаев.
Штаммы С. glabrata были абсолютно резистенты к полиенам и азолам (итраконазол, кетоконазол). К флуконазолу выявлены резистентные (67±5,4%) и умеренно устойчивые (33±5,4%) штаммы. Вагинальные изоляты С. glabrata были чувствительны только к клотримазолу (67±5,4%).
С. krusei были чувствительны к нистатину в 100% случаев, абсолютно резистенты к кетоконазолу, клотримазолу и амфотерицину В и умеренно устойчивы к флуконазолу и итраконазолу (100%).
Штаммы С. albicans, выделенные из респираторного тракта, характеризовались высокой чувствительностью к нистатину (85±5,3%), количество чувствительных штаммов уменьшалось в ряду: флуконазол (66±4,7%), клот-римазол (59±4,4%), кетоконазол (51±4,1%), амфотерицин В (32±2,3%), итраконазол (28±2,0%). Наибольшее количество резистентных изолятов выявлено к амфотерицину В (68±4,7%), наименьшее - к нистатину (15±1,2%). Среди азоловых препаратов С. albicans были наиболее резистентны к итраконазолу (57±4,3%) и клотримазолу (41±3,8%), в меньшей степени - к кетоконазолу (34±2,5%) и флуконазолу (25±1,8%). Умеренно резистентных изолятов С. albicans из респираторного тракта к итраконазолу и кетоконазолу было 15±1,2%, к флуконазолу - 9±0,7%.
С. glabrata, выделенные из респираторного тракта, были чувствительны только к нистатину и клотримазолу в 66±5,4% случаев, абсолютно резистентны к итраконазолу и амфотерицину В. Количество резистентных штаммов С. glabrata к флуконазолу и кетоконазолу составило 66±5,4%, к нистатину и клотримазолу - 34±5,4%. Умеренно устойчивые изоляты С. glabrata к флуконазолу и кетоконазолу выявлены в 34±5,4% случаев.
Штаммы С. kefyr, изолированные из респираторного тракта, были чувствительны к нистатину (100%) и клотримазолу (50±5,2%), резистентны к флуконазолу, итраконазолу и амфотерицину В (100%), к кетоконазолу и клот римазолу - в 50±5,2% случаев. Умеренно устойчивые штаммы выявлены только к кетоконазолу (50±5,2%).
Штаммы С. tropicalis, выделенные из респираторного тракта, были чувствительны только к нистатину (100%), абсолютно резистентны к флукона-золу, кетоконазолу, клотримазолу и амфотерицину В. К итраконазолу штаммы были умеренно устойчивы.
С. albicans, выделенные из ротовой полости, чувствительны к нистатину (95±5,1%), кетоконазолу (40±3,1%), в меньшей степени к флуконазолу (20±1,2%), клотримазолу и амфотерицину В (по 5±0,8%). Максимальное количество резистентных штаммов выявлено к амфотерицину В (95±5,1%) и клотримазолу (95±5,1%) и уменьшалось в ряду: итраконазол (40±3,1%), флу-коназол (35±2,5%), кетоконазол (25±1,3%), нистатин (5±0,8%). К итраконазолу, флуконазолу и кетоконазолу было 55±4,3%, 45±3,2% и 35±2,5% умеренно устойчивых штаммов, соответственно.
Штаммы С. glabrata, выделенные из ротовой полости, были чувствительны к трем антимикотикам - нистатину (75±2,1 %), флуконазолу и клотримазолу (25±2,1%). К амфотерицину В все штаммы были резистентны (100%), к клотримазолу - 75±2,1%, итраконазолу - 50±4,5%, флуконазолу, кетоконазолу и нистатину - по 25±2,1%. Количество умеренно устойчивых штаммов к кетоконазолу составило 75±2,1%, к флуконазолу и итраконазолу -по 50±4,5%.
При изучении чувствительности к антимикотикам штаммов, выделенных при разных формах течения инфекционного процесса, установлено, что изо-ляты Candida, выделенные при остром течении инфекционно-воспалительного процесса, в 85±2,6% случаев чувствительны к нистатину, чувствительность штаммов к другим антимикотикам убывала в ряду: флуко-назол (63±3,5%), клотримазол (60±3,6%), кетоконазол (51 ±3,7%), итраконазол (35±3,5%), амфотерицин В (19±2,9%). Максимальное количество резистентных штаммов выявлено к амфотерицину В (81±2,9%) и значительно меньше к итраконазолу (50±3,7%), клотримазолу (40±3,6%), кетоконазолу (34±3,7%), флуконазолу (25±3,2%). Умеренно устойчивые штаммы были выявлены к трем антимикотическим препаратам: итраконазолу, кетоконазолу -в 15±1,6%, флуконазолу - в 12±1,3% случаев (рис.22).
Биологические свойства грибов рода Candida
Вагинальные изоляты поп-albicans видов характеризуются высокими значениями АЛА, АЛфА, sIgA-протеазной активности, оральные изоляты -высокой АОА и sIgA-протеазной активностью, выделенные из респираторного тракта - высоким MP, а фекальные - низкими и средними значениями выраженности изученных свойств.
Выявлены различия в структурах корреляционных связей между признаками у С. albicans и поп-albicans видов, выделенными из разных биотопов тела человека. Так, для С. albicans из респираторного тракта и кишечника характерно наличие положительной корреляционной связи между АЛА и способностью к биопленкообразованию. У фекальных и оральных изолятов С. albicans отмечается положительная корреляция между sIgA-протеазной активностью и другими факторами персистенции. У поп-albicans видов из кишечника, репродуктивного и респираторного тракта выявлено наличие положительной корреляционной связи между антилизоцимной и slgA-протеазной активностью.
Таким образом, проведенные исследования позволили охарактеризовать различия биопрофилей грибов рода Candida в зависимости от занимаемого биотопа, что позволяет их дифференцировать по распространенности и уровню выраженности признаков. Следует отметить, что все штаммы, выделенные при патологических состояниях, обладали набором факторов перси-тенции и патогенности, включающим два-три признака. Полученные нами результаты подтверждаются исследованиями И.Э. Ляшенко (1995), которая описала биопрофили нозовариантов эшерихий, выделенных при кишечном дисбиозе, эшерихиозе, хроническом пиелонефрите, и показала возможность дифференциации этих патологических состояний по уровню выраженности признаков. При выполнении этой работы было установлено, что все кишечные палочки, выделенные при различных патологических состояниях, обладали комплексом факторов персистенции. О.Л. Карташовой с соавт. (2009) выявлены различия в частоте распространения и уровне выраженности антилактоферриновой и sIgA-протеазной активности изолятов S.aureus, выделенных от транзиторных и резидентных бактерионосителей. Более высокие значения данных свойств, а также комбинация обоих признаков были характерны для штаммов золотистых стафилококков, выделенных со слизистой носа резидентных бактерионосителей.
Проведенный нами сравнительный анализ биопрофилей позволил также определить информативную значимость изученных показателей для установления степени экологической детерминации признаков грибов.
Показано, что уровень экспрессии персистентных свойств у грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека, экологически детерминирован и проявляется в соответствии с интенсивностью их контакта с уровнем соответствующих факторов естественной резистентности в биотопе.
Результаты исследования способности грибов рода Candida к инактивации лактоферрина показали, что вагинальные штаммы характеризуются наиболее выраженными значениями АЛфА, что может сказываться на снижении бактерицидных свойств вагинального секрета, одним из факторов защиты которого является лактоферрин (Valenti P., Antonini G., 2005). Эти данные подтверждают принцип экологической детерминированности факторов персистенции микроорганизмов (Бухарин О.В., 1999).
Высокий уровень sIgA-протеазной активности у грибов, выделенных из респираторного тракта, может быть связан с их выживанием в условиях высокой концентрации секреторного IgA в данном биотопе (Тотолян А.А., 1999).
Значительное внимание исследователей в последнее время направлено на изучение взаимодействия симбионтов в микросимбиоценозе при инфекции. Представители нормальной микрофлоры подавляют адгезию (Коршунов В.М., 1990; Kennedy M.J., 1985), мицелиальную трансформацию (Kacz-marski W., 1989) и образование ростовых трубок у грибов (Ayger Р., 1977), а также оказывают на них антагонистическое действие (Явнова Е.В., Перунова Н.Б., 2008; Bernhardt Н., Wellmer А., 1995; Bernhardt Н., Knoke М., 1997).
Изучение межбактериальных взаимодействий симбионтов в ассоциативном симбиозе при инфекции выявило два существенных момента: подавление факторов персистенции патогенов под действием анаэробной индиген-ной микрофлоры и повышение персистентного потенциала патогенов и условно-патогенных микроорганизмов под действием ассоциантов-симбионтов при формировании патобиоценозов и бактерионосительства (Бухарин О.В. с соавт., 2011). Установлено также, что при инфекции меняется персистент-ный потенциал микроорганизмов, что немаловажно для развития инфекционного процесса.
При выделении грибов рода Candida из кишечника и репродуктивного тракта нами параллельно было выделено по 10 штаммов фекальных энтерококков и лактобацилл, из репродуктивного тракта - 7 штаммов бактерий рода Enterococcus spp. и 10 штаммов Lactobacillus spp. Все выделенные лакто-бациллы были идентифицированы на основании морфологических, тинкто-риальных, биохимических свойств как L. acidophilus (5 штаммов), L. planta-гит (4 штамма), L. casei (4 штамма) и L. fermentum (7 штаммов). Выделенные энтерококки были идентифицированы с помощью мультиплексной (мультилокусной) полимеразной цепной реакции по наличию видовых генов, кодирующих синтез супероксиддисмутазы (Jackson C.R. et al., 2004), как Е. faecalis (12 штаммов) и Е. faecium (5 штаммов). Изучение факторов патогенносте энтерококков проводили на фенотипическом уровне по способности продуцировать желатиназу и гемолизировать эритроциты и на молекулярно-генетическом с помощью ПНР с детекцией в агарозном геле с определением генов адгезии и колонизации (asa, esp), токсигенности (cylA, В, М), пенетра-ции и повреждения тканей (hyl, gelE). В результате было выявлено, что все фекальные изоляты Е. faecium не проявляли патогенности на фенотипическом и молекулярно-генетическом уровнях, все выделенные штаммы Е. faecalis обладали широким спектром детерминант вирулентности и проявляли желатиназную активность.
Таким образом, лактобациллы на основании видовой принадлежности, высокой экспрессии продукции перекиси водорода и энтерококки, не обладающие факторами патогенности на фенотипическом и молекулярно-генетическом уровнях, были отнесены к представителям доминантной микрофлоры и непатогенным ассоциантам кишечника и репродуктивного тракта человека соответственно, а остальные изоляты - к группе патогенных ассоци-антов (Бондаренко В.М., Суворов А.Н., 2007; Бухарин О.В., 2006, 2007, 2012).
