Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 26
1.1 Классификация и номенклатура нетуберкулезных микобактерий 26
1.2 Экология М. аvium 27
1.3 Вирулентность М. avium 29
1.4 Микобактериоз 30
1.4.1. Эпидемиология и клинические проявления 30
1.4.2 Микробиологическая диагностика микобактериоза 33
1.4.3 Лекарственная чувствительность М. avium 34
1.5 Характеристика генома M. avium 35
1.5.1 Структура генома 35
1.5.2 Молекулярная эволюция и геномный полиморфизм 37
1.5.3 Механизмы генетического обмена 39
1.6 Геноидентификация M. avium 41
1.7 Генотипирование M. avium 42
1.7.1 VNTR- и MATR-типирование 44
1.7.2 IS1245- и IS1311- RFLP-типирование 45
Собственные исследования 49
ГЛАВА 2. Генотипическая характеристика M. avium 49
2.1 Генодентификация клинических изолятов микобактерий 49
2.1.1 Видовая идентификация 49
2.1.2 Определение подвида M. avium путем детекции инсерционных элементов IS900 и IS901 50
2.2 Оценка аллельного полиморфизма штаммов M. avium subsp. hominissuis с использованием вариабельных локусов VNTR и MATR 51
2.2.1 Генотипирование штаммов MAH с использованием восьми локусов VNTR 51
2.2.2 Оценка дискриминирующей способности 8 локусов VNTR 54
2.2.3 Генотипирование штаммов MAH с использованием 15 локусов MATR 54
2.2.4 Оценка дискриминирующей способности 15 локусов MATR 57
ГЛАВА 3. Оптимизация схемы генотипирования mah с учетом аллельного полиморфизма локусов VNTR и MATR 60
ГЛАВА 4. Характеристика полиморфизма клинических изолятов M. avium subsp. hominissuis на основе инсерционной последовательности is1245 65
Заключение 69
Выводы 76
Практические рекомендации 77
Переспективы дальнейшей разработки темы 77
Список использованных сокращений 78
Список литературы
- Экология М. аvium
- Молекулярная эволюция и геномный полиморфизм
- Определение подвида M. avium путем детекции инсерционных элементов IS900 и IS901
- Оценка дискриминирующей способности 8 локусов VNTR
Экология М. аvium
Автором составлен план исследования, проведен аналитический обзор литературы, сформирована выборка изолятов микобактерий, выполнен весь объем молекулярно-генетических исследований. Культивирование и идентификация микобактерий, в том числе с использованием тест-системы GenoType Mycobacterium (Hain Lifescience, Германия), проведены совместно с Т.Ф. Оттен и В.Ю. Журавлевым - сотрудниками отдела лабораторной диагностики ФГБУ «Санкт Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России (СПбНИИФ). Лимитированное ДНК-секвенирование проведено совместно с А.Б. Комиссаровым (ФГБУ НИИ гриппа Минздрава РФ). Автор провела анализ, статистическую обработку и систематизацию полученных лично данных, сформулировала выводы и практические рекомендации. Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Изоляты микобактерий, полученные от больных микобактериозом, принадлежали к M. avium subspecies hominissuis. 2. Клинические изоляты M. avium subspecies hominissuis, полученные от больных микобактериозом, были неоднородны по 8 локусам VNTR и 15 локусам MATR. 3. Для дифференциации клинических изолятов M. avium subspecies hominissuis и установления генетического родства между ними оптимальна схема типирования по 14 локусам MATR и VNTR с последующим анализом кластеров методом IS1245-RFLP.
Степень достоверности и апробация результатов
Результаты исследования полиморфизма ДНК 90 клинических изолятов M. avium, в частности локусов VNTR и MATR, полученные с использованием современных высокочувствительных и специфичных молекулярно-генетических методов, воспроизводимы. Экспериментальные данные подвергнуты обработке и систематизации с помощью методов описательной статистики, пакетов компьютерных программ и информационных баз данных и представлены в виде таблиц и графических изображений.
Диссертация апробирована на заседании Ученого совета Федерального бюджетного учреждения науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» (протокол № 5 от 21 мая 2014 г.).
Основные результаты исследований доложены и обсуждены на Российских и международных конференциях: «Health and environment: environmental problems and infectious diseases», 19 марта 2012 г., г. Осака, Япония; 34th congress European society of mycobacteriology, 30 июня-03 июля 2013 г., г. Флоренция, Италия; международная конференция «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций», 5-7 июня 2013 г., Санкт-Петербург; 8-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика», 18-20 марта 2014 г., Москва; научно-практическая конференция «От эпидемиологии к диагностике инфекционных заболеваний: подходы, традиции, инновации», 23-25 апреля 2014 г., Санкт-Петербург; 35th congress European society of mycobacteriology, 29 июня-02 июля 2014 г., г. Вена, Австрия.
Публикации По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Структура и объем диссертации
Основной текст диссертации изложен на 99 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций и приложения. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 15 рисунками. Список литературы содержит 94 источников, в том числе 5 -отечественных и 89 - зарубежных авторов. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Классификация и номенклатура нетуберкулезных микобактерий Микобактерии - неподвижные, аэробные, грамположительные палочки, которые характеризуются кислото- и щелочеустойчивостью при окраске карболовым фуксином, высоким содержанием липидов в клетке и, особенно, в клеточной стенке. Воска, входящие в ее состав, содержат растворимые в хлороформе миколовые кислоты с длинными разветвленными цепями (от 60 до 90 атомов углерода). Содержание Г+Ц в молекуле ДНК составляет 62 - 70 % [50, 77].
Микобактерии относят к единственному роду Mycobacterium семейства Mycobacteriaceae. В настоящее время род Mycobacterium включает более 130 видов, подвидов и комплексов, и их число продолжает расти [27, 50].
Исторически сложилось подразделение микобактерий на типичные (классические возбудители туберкулеза человека и животных) и «атипичные» микобактерии, которые различают по морфологическим и физиологическим свойствам [1, 2, 3, 4, 85].
К «типичным» представителям рода микобактерий относят бактерии Mycobacterium tuberculosis complex. Данная группа включает возбудителей туберкулеза человека и животных (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum и др.). Несмотря на различия фенотипических характеристик и вариабельность круга «хозяев» среди млекопитающих, они представляют один из наиболее ярких примеров генетической гомогенности (99,7–99,9% гомологии) и консерватизма важнейших структурных генов, включая гены, кодирующие многие внутриклеточные энзимы, 65-kD протеин теплового шока, 16-kD антиген и другие белки [77, 78].
Для «атипичных микобактерий» в 90-е годы ХХ столетия был предложен более нейтральный термин – «нетуберкулезные микобактерии» (НТМБ). К НТМБ относят сапрофитные и условно-патогенные виды. НТМБ обитают в почве и воде, за что получили название убиквитарных (вездесущих) микобактерий, которые относительно контагиозны и слабопатогенны для лабораторных животных [21, 28, 55].
В настоящее время восемь видов медленно растущих НТМБ – M. avium, M. intracellulare, M. chimaera, M. colombiense, M. arosiense, M. bouchedurhonense, M. marseillense и M. timonense – относят к Mycobacterium avium complex (МАС) [15]. Еще E. Runyon (1943 г.) установил, что речь идет о комплексе родственных микобактерий, среди которых имеются вирулентные (М. avium), способные вызывать заболевания, и авирулентные (М. intracellulare), которые, как было показано впоследствии, также могут быть вирулентными для животных и человека [4].
Ранее считалось, что один из типичных представителей МАС - М. avium – является возбудителем «птичьего» туберкулеза (отсюда и наименование возбудителя) и редких заболеваний других животных. Типовой штамм М. avium АТСС 25291 был выделен от больной курицы [88]. В качестве потенциального возбудителя болезней человека М. avium стали рассматривать несколько десятилетий назад [31].
Молекулярная эволюция и геномный полиморфизм
Разработана научно обоснованная схема типирования российских штаммов M. avium subsp. hominissuis, основанная на идентификации возбудителя по 14 локусам VNTR-MATR с последующим анализом кластеров методом IS1245-RFLP, позволяющая проводить мониторинг одного из наиболее актуальных возбудителей микобактериоза человека в России.
Впервые изучена информативность (дискриминирующая способность) 23 локусов VNTR и MATR для типирования российских штаммов M. avium subspecies hominissuis.
Установлено, что аллели 3 в локусе MATR-16 и 2 в локусе TR10 (MATR-9), имеющие делеции, являются маркерами российских изолятов M. avium subspecies hominissuis.
Впервые последовательности ДНК клинических штаммов Mycobacterium avium subspecies hominissuis депонированы в GenBank: а) последовательности локуса TR10, содержащие два идентичных интактных тандемных повтора 55 п.н. (accession no. JQ935977.1) и внутреннюю делецию размером 15 п.н. в первом из двух повторов (accession no. JQ918769.1); б) последовательность локуса МАTR-16, содержащая делецию двух нуклеотидов во втором повторе и внутреннюю делецию 28 п.н. в третьем повторе (accession no. KF479191).
Теоретическая и практическая значимость исследования
Установлено, что российская популяция M. avium subspecies hominissuis, представленная в данной работе изолятами больных микобактериозом людей, неоднородна по маркерам геномного полиморфизма VNTR, MATR и IS1245, что позволяет оценить этиопатогенетическую роль штаммов различных генотипов в развитии микобактериоза на территории Российской Федерации.
Показано, что распространенность VNTR- и MATR-типов M. avium subspecies hominissuis неодинакова у штаммов возбудителя различного географического происхождения, что вносит существенный вклад в характеристику глобальной популяции микроорганизма данного вида.
С учетом информативности маркеров геномного полиморфизма разработана научно обоснованная схема типирования российских штаммов M. avium subspecies hominissuis по 14 локусам VNTR-MATR с последующим анализом кластеров методом IS1245-RFLP, позволяющая установить генетическое родство между штаммами при проведении молекулярно-эпидемиологических исследований микобактериоза и мониторинга популяции возбудителя.
В лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера создана и поддерживается коллекция ДНК 90 клинических штаммов M. avium subspecies hominissuis. Создана компьютерная база данных, содержащая профили VNTR-, MATR- и IS1245-RFLP-типирования 90 клинических штаммов M. avium subspecies hominissuis.
Материалы исследования изданы в виде Информационно-методического письма «Молекулярно-генетическая характеристика клинических штаммов Mycobacterium avium subspecies hominissuis – возбудителя микобактериоза человека» (утверждено директором ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера А.Б. Жебруном и директором ФГБУ НИИ фтизиопульмонологии П.К. Яблонским 18 апреля 2014 г.) и используются в научно-исследовательской работе лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (Акт о внедрении от 21 мая 2014 г.).
Методология и методы исследования
Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Предметом исследования явилась характеристика геномного полиморфизма M. avium – возбудителя микобактериоза человека. Анализ научной литературы, посвящённой оценке молекулярных маркеров, используемых для дифференциации штаммов M. avium subsp. hominissuis, проведён на основе формально-логических методов исследования.
Работа выполнена в формате сравнительного открытого исследования с использованием микробиологических, молекулярно-генетических, аналитических и статистических методов.
Материал исследования Изучены 120 чистых культур НТМБ, выделенных в период с 2008 г. по 2011 г. в в ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России (СПбНИИФ) от жителей Санкт-Петербурга и Ленинградской области. Все 120 изолятов были идентифицированы как представители M. avium complex. Девяносто (из 120) штаммов, идентифицированные до вида M. avium, получены от больных микобактериозом легких (включая 27 ВИЧ-инфицированных), 18 - выделены от пациентов с подозрением на туберкулез. Эпидемиологические связи между случаями заболевания не установлены.
Для контроля использовали ДНК эталонных и коллекционных штаммов, представленных СПбНИИФ: M. avium subsp. avium ATCC 35712, IWGMT49 и M. avium subsp. paratuberculosis K10.
Культивирование микобактерий
Культивирование микобактерий осуществляли в лаборатории СПбНИИФ общепринятым методом на среде Левенштейна-Йенсена [Приказ Минздрава РФ от 21.03.2003 № 109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации"]; видимый рост культур медленнорастущих микобактерий наблюдали в течение 21 дня.
Идентификацию клинических изолятов микобактерий и дифференциацию бактерий Mycobacterium avium complex (MAC) от остальных видов НТМБ осуществляли с использованием биохимических тестов [1, 3, 4] (Таблица 1).
Определение подвида M. avium путем детекции инсерционных элементов IS900 и IS901
В результате исследований, проведенных J. Philalay с соавт. (2004) обнаружено, что два гена – pks12 (Маа1979) и Maa2520 – принимают участие в формировании МЛУ штаммов М. avium. В результате инсерционной мутации локуса Maa2520 получены мутантные штаммы, чувствительные к ципрофлоксацину, кларитромицину, пенициллину и рифампицину. Они не образовывали лекарственно-устойчивых колоний, по сравнению с их диким предшественником, и являлись чувствительными к минимальной ингибирующей концентрации (МИК) данных антибиотиков. Ген Maa2520 кодирует гипотетические белки клеточной стенки, которые имеют высокую степень гомологии с белками M. tuberculosis и M. leprae, и, возможно, выполняют роль ее стабилизаторов [67].
Мутации в гене pks12 (Маа1979) М. avium приводят не только к увеличению лекарственной чувствительности ко всем вышеперечисленным препаратам (что, возможно, является результатом увеличения проницаемости клеточной стенки), но также изменению морфологии колоний (шероховатый тип). Продукт гена pks12 (ген поликетидсинтазы) штамма М. avium 104 на 87% гомологичен таковому микобактерий туберкулеза, у которых кодирует поликетиды, необходимые для синтеза фтиоцеролдимикоцерозата (DIM) – одного из основных компонентов клеточной стенки M. tuberculosis, обеспечивающих проницаемость [67].
Молекулярная эволюция и геномный полиморфизм
Экспрессия ключевых антигенов и факторов вирулентности, которые необходимы для выживания микроорганизма во внешней среде и в организме хозяина, опосредована инсерциями/делециями и инверсиями участков генома [17].
Единичные нуклеотидные замены (англ., Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) – наиболее распространенный тип геномных перестроек, обуславливающий генетическое разнообразие микроорганизма. В результате исследования 10 конститутивных генов (housekeeping) “домашнего хозяйства” (recF, sodA, aspB, gnd1, lipT, pepB, gnd2, est, hsp65, groEL1) четырех подвидов M. avium методом MLSA (Multilocus Sequence Analysis) установлено, что изоляты MAH имеют наибольшее количество нуклеотидных замен (синонимичных и несинонимичных) в данных генах. Различные варианты рекомбинационных событий между аллелями в геноме MAH привели к формированию гетерогенности популяции в целом [71].
Сравнительный анализ геномов M. avium subsp. hominissuis 104 и M. avium subsp. paratuberculosis К-10 показал наличие протяженных делеций LSPs (Large Sequence Polymorphisms), которые обуславливают различия между геномами данных подвидов. Изначально выявлено 14 регионов LSPs (LSPA1- LSPA14), присутствующих в геноме MAH 104, но не характерных для MAP К-10. Впоследствии в геноме MAH 104 было обнаружено еще 11 LSPs, которые отсутствовали у MAP К-10 [17, 76].
Изучение геномного полиморфизма, основанное на выявлении филогенетически информативных маркеров SNPs и LSPs, позволило взглянуть на фундаментальные основы генетического разнообразия М. avium и установить филогенетическое родство между подвидами М. avium [36, 71, 88].
Модель эволюционного развития четырех подвидов М. avium основана на оценке вариабельности генома MAH по сравнению с геномами MAA, MAP и MAS. Перестройки протяженных участков (LSPs), замены отдельных нуклеотидов (SNPs), обуславливающие эволюцию генома, привели к селективному разделению микроорганизмов с учетом их адаптационной способности к широкому кругу хозяев. Полагают, что предковым является клон MAH, от которого берут начало две ветви независимых друг от друга эволюционных событий: одна ветвь ведет к формированию «птичьих» подвидов MAA и MAS, другая – к подвиду MAP (крупный рогатый скот и овечий тип) (Рисунок 4) [71]. Рисунок 4 - Модель эволюционного развития М. avium (Rindi L. et al., 2013).
Секвенирование области ITS гена 16S-23S rRNA выявило восемь SNPs-секвоваров MAH (Mav-A – Mav-H). Примечательно, что существует зависимость между SNPs-секвоварами штаммов MAH и вирулентностью: так, секвовар Mav-A выделяли как от больных микобактериозом, так и от источников окружающей среды и животных, в то время как секвовар Mav-B выделяли исключительно от больных СПИД с диссеминированной формой инфекции. Оба секвовара являлись продуцентами большего количества гемолизина по сравнению с секвоварами остальных типов. Напротив, MAP, MAS и MAA, принадлежали к единому секвовару Mav-A [60, 71, 88].
Горизонтальный перенос генов (Horizontal Gene Transfer, HGT) – динамический процесс, являющийся важным механизмом эволюции генома прокариот. Поступление чужеродной ДНК в клетку посредством конъюгации, трансдукции и трансформации позволяет микроорганизму приобретать новые свойства, которые, зачастую, дают виду селективные преимущества при воздействии жестких условий окружающей среды. Ярким примером является обмен генетическим материалом, например, генами резистентности к антибиотикам и детерминантами вирулентности [62].
Известно, что у таких видов как M. tuberculosis, M. bovis и M. leprae способность к горизонтальному обмену генетической информацией и рекомбинации, контролируемой геном recA, до сих пор дискутируется, однако в настоящее время получены убедительные данные о возможности горизонтального переноса генов у НТМБ. Так, анализ нуклеотидных последовательностей кластера GPL (высоко консервативный 5 -регион, располагающийся между генами mtfB и gtfB) штаммов М. avium различных серотипов (2151, 724, 104) выявил мозаичную структуру этого участка у штамма М. avium 2151: одна часть идентична последовательности М. avium 724, а другая – М. avium 104. Подобная идентичность блоков GPL М. avium 2151, 724 и 104 может свидетельствовать о горизонтальной передаче и гомологичной рекомбинации участков ДНК [48]. Однако механизм обмена хромосомной ДНК (конъюгация, трансформация, трансдукция) у М. avium остается неясным [68].
Известно, что у М. avium, М. intracellulare и М. scrofulaceum имеются родственные плазмиды, которые способны к самостоятельной репликации. Так, среди плазмид М. avium и М. intracellulare обнаружена конъюгативная плазмида pVT2, что свидетельствует о возможности конъюгативного пути передачи ДНК в популяциях МАС. Описана конъюгативная плазмида pMA100, в состав которой входил интактный инсерционный элемент IS1245. Данная плазмида была выделена из смешанной культуры М. avium-М. kansasii, полученной от ВИЧ-позитивного пациента. В результате RFLP-анализа выявлено наличие IS1245 у штаммов М. kansasii, что свидетельствует о способности плазмиды pMA100 к межвидовому переносу IS1245 от М. avium к М. kansasii. В экспериментах in vitro был подтвержден конъюгативный перенос плазмиды pMA100 не только между М. avium и М. kansasii, но и между М. avium и M. bovis BCG Moreau [68, 69].
Передача ДНК может происходить также в процессе трансформации, природная способность к которой была открыта у М. avium [68]. Обмен генетическим материалом между микобактериями может происходить и путем трансдукции посредством бактериофагов, которых у микобактерий известно более 250 [48].
Оценка дискриминирующей способности 8 локусов VNTR
Сравнительный анализ 8-локусных VNTR-профилей российских штаммов MAH с доступными данными зарубежных выборок показал различия популяций MAH в России, Франции, Словении и Японии [5]. Однако следует отметить, что VNTR-профили изолятов большинства российских кластеров MAH описаны и в Финляндии у изолятов MAH больных микобактериозом людей и у изолятов, полученных от свиней [86]. В то же время, 8-локусный профиль 25221128 (кластер Ma81) явно доминировал в Финляндии, тогда как наиболее распространенный профиль 22221128 (кластер Ma84), выявленный более, чем у половины российских изолятов, встречался менее, чем у 7% изолятов из Финляндии. Наблюдаемое родство изолятов упомянутых генотипов из России и Финляндии можно объяснить общностью источников MAH, обусловленной территориальной близостью Северо-Западного региона Российской Федерации (включая Санкт-Петербург) и Финляндии. Вместе с тем, рассмотренное межпопуляционное неравновесие может отражать возникновение и циркуляцию большинства филогенетически удаленных штаммов MAH на единой территории, включавшей указанные страны, более 100 лет назад, что не исключает возможности сравнительно недавнего формирования доминирующего российского кластера Ma84 (профиль 22221128) [79, 86].
Учитывая изложенное, а также и тот факт, что инфицирование человека осуществляется, в основном, от источников окружающей среды [43], высокий уровень кластеризации изученных 90 штаммов МАН при отсутствии явных эпидемиологических связей между случаями заболевания можно объяснить невысокой степенью вариабельности (HGDI 0,186 – 0,624) большинства из восьми локусов VNTR. При этом по числу повторов в локусах TR3 и TR7 штаммы вообще не различались, что согласуется с данными зарубежных исследователей [40, 84, 86]. С целью оптимизации схемы типирования российских штаммов МАН был проведен анализ полиморфизма 15 локусов MATR (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16), недавно описанных Inagaki et al. [40].
В результате 15-локусного MATR-типирования у 90 штаммов МАН было выявлено 35 вариантов профилей, что вдвое превышало таковое (n=17) при использовании 8-локусного VNTR-типирования (HGDI 0,714 и 0,806 соответственно).
Сравнение 15-локусных МАTR-профилей кластеров Ma151-9 изученных российских штаммов c опубликованными данными не выявило кластеризации штаммов M. avium subsp. hominissuis с аналогичными профилями в Японии при наличии кластризации штаммов генотипа 201222222232223, в нашем исследовании выявленного лишь в одном случае [40]. Наоборот, числовой профиль кластера Ma154 (224131342532443 ) российских штаммов был выявлен лишь у одного японского штамма M. avium subsp. hominissuis, причем локус MATR-16 (аллель 3) не был «усеченным».
Особый интерес представлял описанный впервые у 80,0% (из 90 изученных российских штаммов МАН) «усеченный» аллель (3) в локусе MATR-16, молекулярная масса которого, не соответствовала ожидаемым значениям. Секвенирование амплифицированного фрагмента MATR-16 штамма МАН 5122 (одного из представителей данной группы) выявило делецию двух нуклеотидов во втором повторе и внутреннюю делецию 28 п.н. в третьем повторе (GenBank accession no. KF479191).
Аллель 3в локусе MATR-16, так же как и аллель 2в локусе TR10 (MATR-9), выявленные у изученных российских изолятов M. avium subsp. hominissuis, не обнаружены у штаммов, выделенных от различных источников в других странах [40, 43, 64, 70, 84, 86]. Таким образом, данные аллели, по-видимому, являются маркерными для изученных российских штаммов M. avium subsp. hominissuis.
Все 90 российских изолятов MAH послужили для оценки дискриминирующей способности MATR- и VNTR-типирования, основанных на анализе отдельных локусов и их различных комбинаций. Всего было оценено 23 локуса: 8 локусов VNTR и 15 локусов MATR.
Идентичность последовательностей TRX3 и MATR-3 (HGDI 0,624), TR292 и MATR-2 (HGDI 0,272), TR10 и MATR-9 (HGDI 0,186), отмеченная также японскими исследователями [40, 43], позволила исключить дублирующие локусы (MATR-2, MATR-3 и MATR-9) и использовать комбинированную схему типирования, включающую 20 локусов (12 - MATR и 8 - VNTR), в ходе изучения полиморфизма 90 российских штаммов. Сопоставление значений индекса разнообразия Хантера-Гастона для каждого локуса показало высокую информативность (HGDI 0,1) 14 из них (TR292, TRX3, TR25, TR47, TR10, MATR-1, MATR-4, MATR-5, MATR-6, MATR-8, MATR-11, MATR-14, MATR-15, MATR-16).
Оптимизированная 14-локусная схема типирования не отличалась по дискриминирующей способности от 20-локусной (HGDI 0,821), но была более эффективной, чем 8-локусная VNTR- (HGDI 0,714) и 15-локусная MATR- (HGDI 0,806) схемы типирования российских штаммов МАН.
В результате типирования по 14 локусам MATR-VNTR у 90 штаммов МАН было выявлено 36 вариантов профилей. При этом подавляющее большинство (68,9%) штаммов входили в состав 8 кластеров, наиболее крупный (Ma146) включал 37 (41,1%) штаммов с числовым профилем 22222223145443.
Для окончательной оценки родства, штаммы MAH, входящие в состав кластеров согласно 14-локусной схеме MATR-VNTR типирования, были подвергнуты генотипированию с использованием высоко дискриминирующего метода IS1245-RFLP-типирования. У 59 штаммов MAH, входящих в кластеры MATR-VNTR, были получены мультибендовые профили рестрикции IS1245 удовлетворительного качества, причем, лишь девять (15,3%) из них входили в состав четырех кластеров RFLP. При этом два кластера Mav1 и Mav2 включали по два штамма MAH ВИЧ-позитивных пациентов; кластер Mav4 был представлен двумя штаммами больных микобактериозом, один из которых был ВИЧ-позитивным; Mav3 объединял три штамма MAH ВИЧ-негативных пациентов. Теоретически, результаты IS1245-RFLP-типирования штаммов MAH могут свидетельствовать о наличии общих источников и факторов передачи возбудителя в группах больных, чьи штаммы входили в состав кластеров, однако эпидемиологические исследования не выявили связей между случаями заболевания. Полученные данные согласуются с общепринятым мнением о роли объектов окружающей среды в качестве источника инфицирования (в том числе внутрибольничного) человека нетуберкулезными микобактериями.
Несмотря на достигнутый высокий уровень дискриминации (HGDI 0,996), основным недостатком метода IS1245-RFLP, по сравнению с MATR-VNTR типированием, явилась сложность компьютерной обработки мультибендовых паттернов рестрикции (более 20 фрагментов).
С другой стороны, данный метод позволил провести окончательную оценку геномного полиморфизма исследуемых штаммов MAH. В результате установлено, что из 59 штаммов MAH, входящих в кластеры MATR-VNTR, лишь девять входили в состав четырех кластеров RFLP. Таким образом, метод IS1245-RFLP-типирования может быть использован для тонкой дифференциации клинических изолятов MAH и доказательства общности источника и путей передачи возбудителя в эпидемиологических исследованиях.
Использование независимых генетических маркеров – тандемных повторов и инсерционных элементов, обладающих разной скоростью и механизмами эволюции, позволило провести комплексную оценку геномного полиморфизма исследуемых штаммов MAH, достигая различной степени их дискриминации в зависимости от задач исследования.
