Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль окружающей среды в существовании патогенных и потенциально-патогенных бактерий 8
Глава 2. Особенности строения клеточной стенки микобактерий 14
Глава 3 Липидные и углеводные компоненты микобактерий 19
Глава 4. Факторы адаптации бактерий 21
Глава 5. Дезинфицирующие средства, применяемые на практике при туберкулезной инфекции 25
Собственные исследования
Глава 6. Материалы и методы исследований 31
6.1. Изученные штаммы микобактерий, их характеристика, методы культивирования 31
6.2. Методы исследования развития популяций микобактерий с использованием световой и сканирующей электронной микроскопии 33
6.3. Методика изучения адгезии и колонизации клеток микобактерий на объектах окружающей среды для изучения в сканирующем электронном микроскопе 34
6.4. Методы изучения воздействия химических дезинфицирующих средств на популяции клеток микобактерий 35
Глава 7. Изучение морфологии клеток микобактерий в популяции с использованием методов световой и сканирующей электронной микроскопии 38
Глава 8. Изучение процессов адгезии и колонизации клеток микобактерии на объектах окружающей среды в сканирующем электронном микроскопе 43
Глава 9. Изучение морфологии и факторов выживания популяций M.avium в воде и жидком навозе 48
Глава 10. Изучение механизма действия диметилсульфоксида на популяции клеток микобактерии 53
Глава 11. Изучение дезинфицирующей активности йодеза и его композиций в отношении микобактерии 59
Глава 12. Изучение антагонистического воздействия B.subtilis штамма «ТНП-5» на популяции клеток микобактерии 66
Обсуждение 72
Выводы 80
Список литературы
- Особенности строения клеточной стенки микобактерий
- Изученные штаммы микобактерий, их характеристика, методы культивирования
- Методы исследования развития популяций микобактерий с использованием световой и сканирующей электронной микроскопии
- Изучение процессов адгезии и колонизации клеток микобактерии на объектах окружающей среды в сканирующем электронном микроскопе
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время все больше возрастает число неблагоприятных экологических факторов, способствующих развитию патогенных и потенциально-патогенных микроорганизмов.
Одним из факторов в распространении туберкулезной инфекции является циркуляция возбудителя в окружающей среде. По последним данным ряда исследователей (Dailloux М., 1999; Coven Jerry C.Rodegers,1999) показано, что патогенные и атипичные микобактерии (M.avhim, M.fortuitum, M.kansassi и др.) обитают в окружающей среде, чаще всего в воде, почве. Фундаментальные исследования в области изучения популяций патогенных бактерий с использованием методов сканирующей электронной микроскопии позволяют выявить особенности развития клеток микобактерии в популяции, процессы их адгезии и колонизации на объектах окружающей среды, а также факторы их выживания.
Исследование строения, роста и изменчивости популяций бактерий при их естественном развитии и воздействии биотических и абиотических факторов являются одним из малоизученных разделов экологии бактерий.
Широкое распространение туберкулезной инфекции среди животных и человека ставит проблему изыскания научно обоснованных и эффективных препаратов для дезинфекции животноводческих помещений и других объектов ветеринарно-санитарного надзора.
Охрана окружающей среды требует новых подходов к санации различных объектов, включающих продукты питания, корма, вода, сточные воды, почва и др. Биологические подходы к решению этой проблемы, включающие микробов-антагонистов, являются наиболее безопасными и персп ективными.
Изучение морфологии клеток микобактерий в популяции на объектах окружающей среды, позволяют получить объективную информацию об их строении, выживании, изменчивости в процессе роста при воздействии различных абиотических и биотических факторов.
Цель работы. Изучить морфологические особенности и факторы выживания Mycobacterium avium и Mycobacterium В-5 в объектах окружающей среды на популяционном уровне с использованием световой и сканирующей электронной микроскопии.
Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи.
Разработать методические подходы к исследованию популяций Mycobacterium avium и Mycobacterium В-5.
Изучить морфологию клеток М.avium и М.В-5 в популяции в условиях их естественного роста.
Изучить морфологию клеток микобактерий в популяции и факторы их выживания на объектах окружающей среды (частицы комбикорма, зерна сои, скорлупа яиц, кожа кур, вода, жидкий навоз).
Изучить механизм действия некоторых дезинфицирующих средств на популяции М.avium и М.В-5.
Изучить антагонистическое воздействие B.subtilis штамма «ТНП-5» на популяции микобактерий.
Научная новизна. На основании экспериментальных исследований с использованием методов световой микроскопии изучено формирование микроколоний в монослойной культуре. С использованием сканирующей электронной микроскопии изучена морфология Mycobacterium avium и
Mycobacterium В-5 в популяции на объектах окружающей среды (частицы комбикорма, зерна сои, скорлупа яйца, кожа кур, вода, жидкий навоз).
Установлено, что клетки М.avium при наличии трех основных факторов - питательный субстрат, температура (+22-26) и влажность (60-70%) - способны адгезироваться к поверхностям тест-объектов с последующей колонизацией и образованием покровов на поверхности колоний.
Изучена морфология и факторы выживания популяции Mycobacterium avium в воде и жидком навозе. Показано, что в жидкой среде
патогенные микобактерии формируют гидрофобные микроколонии,
закрытые покровами. Питательный субстрат и длительность пребывания
микобактерии в жидкой среде определяют характер формирования покрова и
способность клеток к адаптации в виде перехода в гетероморфизм с
проявлением L-трансформации.
"' С использованием новой методики по определению бактерицидного
действия химических дезинфицирующих средств на популяции микробных клеток и методов сканирующей электронной микроскопии изучен механизм действия композиционного состава «йодез+катапол» на клетки
Ф микобактерии. Установлено, что устойчивость М.В-5 аналогична таковой
Mycobacterium avium.
Изучен механизм действия микроба-антагониста B.subtilis, штамм «ТНП-5» на популяции клеток М.В-5.
0 Практическая значимость работы. В работе применяли новые
методические подходы и методики для исследования M.avmm и В-5 на популяционном уровне с применением методов световой и сканирующей электронной микроскопии.
*
*Г
Разработан композиционный состав на основе йодеза и катапола, оказывающий бактерицидное действие на микобактерии. Положительный эффект новой композиции подтвержден актом комиссионной проверки в соответствии с приказом по ВНИИВСГЭ за №40 от 30.10.02 г. и утвержден 2.11.2002 г. Материалы исследований включены в «Методические рекомендации по ускоренному методу определения бактерицидной активности химических дезинфицирующих средств на популяции микробных клеток» ( п.2.4; 2.6; 2.7 ), утвержденный РАСХН 23.01.2003г.
В эксперименте показан положительный эффект действия БАВ микроба-антагониста B.subtilis, штамм «ТНП-5» на M.avium и В-5.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Особенности строения клеточной стенки микобактерий
В изучении тонкой структуры бактерий электронно-микроскопическое исследование является незаменимым, т.к. оно позволяет выявить структуру отдельных органоидов клетки.
Клеточная стенка ограничивает микобактерию снаружи, обеспечивает стабильность ее размеров и формы, механическую и осмотическую защиту. Клеточная стенка является сложной структурой, как по строению, так и по химическому составу и состоит из трех слоев,
Общая толщина клеточной стенки у медленно растущих микобактерий составляет 20 нм. У сапрофитных микобактерий клеточная стенка вплотную прилегает к цитоплазматической мембране. Электронно-плотный внутренний слой имеет толщину 18 нм, средний прозрачный для электронов слой - 2 нм и размеры наружного слоя варьируются от 2 до 7 нм у разных клеток.
Н.Н. Шабанов и И.Д. Гришаев (1971) при изучении ультратонкого строения атипичных микобактерий птичьего вида, обнаружили на поверхности клеточной стенки осмиофильный материал в виде электронно-плотного вещества (толщиной 300-500 нм), в некоторых клетках имеющий вид осмиофильных нитей из липополисахаридов толщиной 50-120 нм (126).
Аналогичные данные были получены и другими учеными , которые обнаружили на поверхности клеточной стенки как у типичных, так и у атипичных микобактерий фибриллярный осмиофильный слои, который равномерно окружал всю клетку и имел толщину от 50 до 120 нм (88,130).
У штаммов микобактерий туберкулеза с высоким содержанием липидов в клеточной стенке и на её поверхности связывают с наличием корд-фактора. Корд-фактор - это фактор вирулентности, который дает возможность дифференцировать патогенные микобактерии от атипичных. И.И. Румачик (1998) установил отсутствие корд-фактора у атипичных бактерий (97).
Клеточная стенка состоит из липополисахаридно-мукопептидного комплекса, фибриллы которого содержат миколовую кислоту (13,129,131).
Пептидогликан микобактерии представляет собой двухмерную сеть, которая обеспечивает жесткость (регидность) клеточной стенки. Пептидогликан - биополимер, состоящий из полисахаридных цепей, связанных короткими (из трех-четырех аминокислот) пептидами. С пептидогликаном ковалентно связан полисахарид арабиногалактан, к которому в свою очередь присоединяются молекулы миколовых кислот. В результате в клеточной стенке образуется своеобразный каркас - химический комплекс миколовая кислота-арабиногалактан-пептидогликан, составляющий основу клеточной оболочки микобактерии (рис. 1).
За клеточной стенкой располагается цитоплазматическая мембрана, имеющая трехслойную структуру. Цитоплазма микобактерий заполнена рибосомами и полирибосомами. Очень часто в ней видны вакуоли и включения различной величины (волютин). Подобные включения выявлены и у атипичных микобактерий, причем количество и размеры их строго специфичны для каждого вида .
Нуклеоид ограничен цитоплазмой в виде осмиофильных нитей ДНК. У микобактерий хорошо развиты мембранные структуры, которые часто обнаруживают связь с цитоплазматической мембраной. Деление клетки может осуществляться простой перетяжкой на две равновеликие части, а так же путем врастания перегородки внутрь, в результате чего разделение клеток происходит постепенно.
Цепи миколовых кислот контактируют с расположенными ближе к поверхности клетки сложными липидами - микозидами, сульфолипидами, корд-фактором (48,90).
У микобактерий формируется защитный чехол, предохраняющий клетки от лизосомйльных ферментов, макрофагов, дезинфектантов, химиопрепаратов. Защитный чехол в целом представляет собой многослойную липофильную структуру с ярко выраженной гидрофобностью, которая обусловливает адаптивные свойства микробов (21,68).
Установлено, что у атипичных форм микобактерий развита сеть мембранных структур. Она выполняет дыхательную функцию, так как в ней локализованы ферменты дыхательной цепи и, кроме этого, участвует в делении нуклеоидов, в синтезе материалов клеточной стенки и в генетической трансформации (23).
По данным литературы, морфологическая изменчивость микобактерий выражается появлением мелких, тонких или утолщенных палочек с зернами в цитоплазме или без них (4).
В зависимости от морфологии колоний различают основные диссоцианты бактерий: R ( rough) - имеет шероховатый тип колоний, .у S (smooth)- гладкий, М (mucoid)- слизистый, I (intermedius)- промежуточный вариант,
У М. smegmatis наблюдаются S-колонии двух типов: выпуклые и остроконечные с неровной поверхностью. У М. fortuitum выявлены два типа шероховатых вариантов - R1 и R2, между которыми имеются серологические различия. Таким образом, по морфологии колоний бактерий на плотных питательных средах можно определить соотношение диссоциантов в популяции (63).
Многие бактерии изменяют свои морфологические свойства в связи с нарушением экологического баланса. При микроскопировании мазков из посевов после окраски методом Циль-Нильсона находили тонкие палочки, короткие, толстые, которые красились в красный цвет (120,41). При выделении L-форм микобактерий из внешней среды общим морфологическим признаком являлась шарообразная форма клеток, которые были способны к реверсии после обработки проб по методу В.С.Федосеева и восстановлению в первоначальную форму при культивировании на питательных средах (123).
Сложный механизм взаимодействия различных субклеточных элементов микобактерий туберкулеза лежит в основе жизнедеятельности целого микроорганизма. Изменение условий существования микобактерий отражается на состоянии этих механизмов и вызывает изменение в структуре и метаболизме возбудителя (8,53 )
Изученные штаммы микобактерий, их характеристика, методы культивирования
Экспериментальная работа по теме диссертации проводилась нами в 2001-2003 г.г. в лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГЭ. Общая схема исследований представлена на рис.2.
В опытах использовали паспортизированные штаммы микобактерий. Mycobacterium avium, штамм № 61-97, получен из ВГНКИ ветпрепаратов в 2001 г., музейный, патогенен для кроликов и кур. Mycobacterium В-5 из музея культур ВНИИВСГЭ, не патогенен для лабораторных животных, устойчив к нагреванию при 60С в течении 60 минут. Для изучения антагонистической активности использовали культуру Bacillus subtilis штамм «ТНП-5», выделенный из мерзлотных почв Якутии (Н.П.Тарабукина,2000). Тест-культуры микобактерий В-5 культивировали на мясопептонном агаре и на среде Левенштейна-Йенсена, Тест-культуры Mycobacterium avium культивировали на среде Левенштейна-Йенсена. Среду готовили по общепринятой методике. Периодичность пересевов на питательных средах-один раз в 2-3 месяца.
Культуры микобактерий В-5 культивировали 2-3 суток, М. avium -7-8 суток при 37С. Все использованные в работе культуры бактерий " обладали типичными культурально-биохимическими свойствами. Изучение антагонической активности В. subtil is штамм «ТНП-5» проводили на тест-культуре микобактерий сапрофитного штамма В-5.
В опытах использовались вегетативные клетки B.subtilis. Для получения вегетативных клеток культуру высевали в МПБ или МПА и инкубировали при температуре 37С в течении 24 часов.
СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ. Для изучения монослойной культуры микобактерий использовали стерильный целлофан, предварительно нарезанный по размеру предметного стекла. Подготовленные кусочки целлофана укладывали на поверхность плотной питательной среды МПА, не допуская сморщивания и образования пузырьков воздуха под ним. Посев культуры микобактерий на поверхности целлофана проводили с помощью препаровальной иглы методом укола в трех точках. Посевы культивировали в термостате при температуре 37С. Через 24, 48 и 72 часа участок целлофана с выросшей культурой снимали с поверхности питательной среды и помещали в чашки Петри. Фиксацию и одновременно окраску клеток осуществляли парами 1%-ой осмиевой кислоты (OsO+) в течении 1-2 минут при комнатной температуре. По истечении времени фиксации кусочки целлофана, с выросшими клетками микобактерий укладывали на предметные стекла, накрывали покровным стеклом и изучали в световом микроскопе.
Для изучения роста единичных клеток и формирования микроколоний можно применять метод укола препаровальной иглой на тонкий прозрачный слой плотной питательной среды. Для этой цели на стерильное нагретое предметное стекло наносили стерильной пипеткой 0,2-0,3 мл теплого агара и равномерно распределяли по всей поверхности стекла. После застывания среды методом укола наносили минимальное количество клеток микобактерий. Стекло помещали в чашку Петри на влажную фильтровальную бумагу для создания влажной камеры и помещали в термостат. После подращивания проводили фиксацию и окраску клеток парами 1% -ной осмиевой кислоты как указано выше.
СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ (СЭМ). Мембранные фильтры с выросшими на них колониями микобактерий снимали с питательной среды и проводили фиксацию парами 25%-ного глутарового альдегида, затем обезвоживали в парах пропиленоксида или ацетона. Образцы препаратов напыляли платиной 20 минут на установке «Hitachi-E-102» и просматривали на электронном микроскопе со сканирующей приставкой «Hitachi-8010» (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ и инструментальном увеличении 1-10 тыс.
Методы исследования развития популяций микобактерий с использованием световой и сканирующей электронной микроскопии
Для изучения адгезии и колонизации клеток микобактерий на объектах окружающей среды в сканирующем электронном микроскопе тест-объекты (частицы комбикорма, зерна сои) автоклавировали, скорлупу яиц, кусочки кожи кур тщательно промывали теплой кипяченой водой. Обработанные тест объекты помещали на предметные стекла в чашки Петри на увлажненный стерильный бумажный фильтр для создания влажной камеры. Отдельные колонии микобактерий с плотной питательной среды суспензировали в физиологическом растворе на электровстряхивателе до получения гомогенной взвеси, концентрация клеток составляла 1 млрд/мл по оптическому стандарту мутности. Полученной взвесью орошали тест объекты. Длительность эксперимента составляла 3-4 суток при температуре +22-+26. Контролем к опытам служили тест-объекты, не контаминированные микобактериями. Для исследования в СЭМ фиксацию препаратов проводили в растворе 4%-го глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН 7,0) и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50, 70, 96 и 100). Образцы препаратов готовили для исследования в сканирующем электронном микроскопе по методике, описанной в главе 6.2.
Для экспериментального исследования морфологии и выживания клеток M.avium в жидком навозе и воде в стерильную колбу на 100 мл вносили 50 мл стерильной воды и 20 гр. нативного навоза. Для контроля в другую колбу вносили 50 мл стерильной воды. Концентрация клеток M.avium составляла 109 кл/мл. Опыт сопровождали контролями. Температурный режим хранения тест-культур был +22-26С, срок наблюдения 12 месяцев. Отбор проб проводили каждые 3 месяца. Пробы жидкого навоза фильтровали через стерильный бумажный фильтр и наносили дозаторной пипеткой в количестве 0,5 мкл в центр мембранных фильтров «Владипор» №2, помещенных на поверхность среды Левенштейна-Йенсена. Чашки термостатировали при 37С. Через 48-72 часа учитывали рост культуры на поверхности фильтров. Для идентификации M.avium мазки из выросшей культуры окрашивали по Цилю-Нильсену. Для изучения морфологии клеток в популяции готовили препараты для световой и сканирующей электронной микроскопии по описанным методикам.
Методы изучения воздействия химических дезинфицирующих средств на популяции клеток микобактерий
Разработанные во ВНИИВСГЭ методы исследования строения колоний бактерий с использованием мембранных фильтров, щадящей фиксации и обезвоживания тест-объектов позволили при исследовании в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) получать объективную информацию о строении поверхностей колоний, выявлять межпопуляционные связи клеток, их изменчивость в процессе естественного роста и развития, а также объективно оценивать действие биотических и абиотических факторов.
В качестве тест-объектов были взяты штаммы микобактерий В-5 (сапрофитный) и M.avium (патогенный). В опытах использовали 2-3 суточные культуры М.В-5 и 5-7 суточные культуры M.avium, выращенные на среде Левенштейна-Йенсена. Для исследования культуру микобактерий суспензировали в физиологическом растворе на электровстряхивателв до получения концентрации 1 млрд/мл по оптическому стандарту мутности. Затем к 4,5 мл взвеси микобактерий добавляли испытуемый препарат в количестве 0,5 мл. По истечению времени воздействия препаратов на клетки микобактерий готовили десятикратные разведения бактериальной взвеси на физиологическом растворе. В чашки Петри на слой питательной среды раскладывали мембранные фильтры «Владипор» №2 и дозаторной пипеткой по 0,5 мкл наносили взвесь клеток из различных концентраций (10 , 10 , 10 , 10 ) обработанных препаратом, таким образом, чтобы капли находились в центре фильтра и не растекались за его пределы. Капли подсушивали и помещали чашки Петри в термостат крышкой вниз и термостатировали при 37С. Опыт сопровождался контрольными высевами взвеси тест-культуры на физиологическом растворе. Для получения достоверного результата действия препарата на культуру микобактерий чашки Петри оставляли в термостате 10 суток. Учет опыта осуществляли по наличию видимого роста культуры микобактерий на фильтрах в разных разведениях в сравнении с контролем. После учета результатов опыта мембранные фильтры снимали с поверхности питательной среды и готовили препараты для СЭМ.
В качестве дезинфицирующих средств в опытах использовали препарат йодез, на который имеется наставление по применению, утвержденное Департаментом ветеринарии в 1999 г. (№13-7-1729) и катапол, утвержденный Минзравом РФ (регистрационный номер 91/146/7).
Изучение процессов адгезии и колонизации клеток микобактерии на объектах окружающей среды в сканирующем электронном микроскопе
Изучение популяций микобактерий в окружающей среде позволяет получить объективную информацию об особенностях развития клеток и их выживании в объектах окружающей среды. Однако, в свете современных представлений о существовании бактерий эти исследования должны І проводится не на уровне отдельных клеток, чему были посвящены монографии В.Д.Тимакова, Г.Я.Каган (1973), СППрозоровского, Л.Н.Кац, Г.Я.Каган (1981), а на уровне микробной популяции как единого живого организма. Исследования строения бактерий в популяции, их изменчивость в процессе развития, взаимодействие клеток в колониях при воздействии биотических и абиотических факторов окружающей среды на популяционном уровне в настоящее время ограничены.
Целью настоящих исследований было изучение способности популяций микобактерий к выживанию и развитию на объектах окружающей среды, таких как частицы комбикорма, зерна сои, скорлупа куриных яиц, ш кожа кур.
Исследование в сканирующем электронном микроскопе контрольных образцов препаратов из частиц комбикорма показало, что они имели гладкую поверхность и не содержали сторонних бактерий. В препаратах частиц комбикорма после контаминирования их микобактериями М. avium наблюдали адгезию единичных клеток (рис. 13), а так же образование микроколоний, с поверхности закрытых массивным слоистым покровом (рис. 14).
Исследование контрольных образцов препаратов зерен сои показало, что они имеют различную величину и гладкую поверхность (рис. 15). Исследование опытных препаратов в СЭМ выявило на частицах зерен сои адгезию единичных клеток M.avium. В отдельных участках наблюдали образование микроколоний, закрытых с поверхности слоистым покровом. На периферии покровов выявлялись концевые отделы палочковидных клеток (рис. 16).
Контрольные образцы наружной стороны скорлупы яйца имели выраженную ячеистую структуру со множеством пор (рис. 17). После контаминации объектов была выявлена адгезия отдельных палочковидных клеток, некоторые из которых находились в стадии деления (рис. 18).
Процесс колонизации микобактериями скорлупы яйца сопровождался формированием межклеточного матрикса и покровов на поверхности клеток (рис. 19).
Ш Поверхность контрольных образцов кожи кур имела характерную складчатую поверхность (рис. 20). В опытных образцах выявлена адгезия единичных клеток микобактерий с последующим формированием колоний, закрытых с поверхности покровами (рис. 21).
Проведенные исследования показали, что наличие трех основных т факторов - питательного субстрата, влажности объекта (50-60%) и температуры окружающей среды (+22-26) обеспечивают клеткам микобактерий возможность адгезироваться к поверхностям биологических объектов с последующей их колонизацией и, следовательно, интенсивным размножением, что может привести к накоплению клеток микобактерий в среде обитания. Существование патогенных микроорганизмов в окружающей среде, адаптированных к ее условиям в различных экосистемах, давно признано рядом исследователей (Терских 1958, Беляков 1964, Сомов 1979, Литвин 1976,1986).
Наибольший интерес в эпизоотологии туберкулеза представляет вопрос о существовании, росте и развитии популяции микобактерий в сточных водах, почве, растительном субстрате и других объектах окружающей среды.
Данные литературы за последнее время (1999-2001 г.г.) свидетельствуют о том, что заболевание людей и животных инфекционными болезнями обычно происходит при контакте с инфицированными объектами окружающей среды (вода, почва, растительные субстраты и т.д.). По данным ВОЗ 85% случаев заболевания сальмонеллезом людей связано с водными источниками.
Исследованиями Кисленко В.Н. показано, что микобактерий туберкулеза, переходя от теплокровного организма в резко отличающиеся условия окружающей среды, приобретают широкую экологическую адаптацию. При этом многие патогенные туберкулезные бактерии проходят сапрофитическую фазу существования в объектах окружающей среды и чаще всего в воде (Dailaux М., et all, 1999). В этой связи существует опасность инфицирования патогенными микобактериями объектов окружающей среды.
