Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 26
1.1 Классификация и номенклатура нетуберкулезных микобактерий 26
1.2 Экология М. аvium 27
1.3 Вирулентность М. avium 29
1.4 Микобактериоз 30
1.4.1. Эпидемиология и клинические проявления 30
1.4.2 Микробиологическая диагностика микобактериоза 33
1.4.3 Лекарственная чувствительность М. avium 34
1.5 Характеристика генома M. avium 35
1.5.1 Структура генома 35
1.5.2 Молекулярная эволюция и геномный полиморфизм 37
1.5.3 Механизмы генетического обмена 39
1.6 Геноидентификация M. avium 41
1.7 Генотипирование M. avium 42
1.7.1 VNTR- и MATR-типирование 44
1.7.2 IS1245- и IS1311- RFLP-типирование 45
Собственные исследования 49
ГЛАВА 2. Генотипическая характеристика M. avium 49
2.1 Генодентификация клинических изолятов микобактерий 49
2.1.1 Видовая идентификация 49
2.1.2 Определение подвида M. avium путем детекции инсерционных элементов IS900 и IS901 50
2.2 Оценка аллельного полиморфизма штаммов M. avium subsp. hominissuis с использованием вариабельных локусов VNTR и MATR 51
2.2.1 Генотипирование штаммов MAH с использованием восьми локусов VNTR 51
2.2.2 Оценка дискриминирующей способности 8 локусов VNTR 54
2.2.3 Генотипирование штаммов MAH с использованием 15 локусов MATR 54
2.2.4 Оценка дискриминирующей способности 15 локусов MATR 57
ГЛАВА 3. Оптимизация схемы генотипирования mah с учетом аллельного полиморфизма локусов VNTR и MATR 60
ГЛАВА 4. Характеристика полиморфизма клинических изолятов M. avium subsp. hominissuis на основе инсерционной последовательности IS1245 65
Заключение 69
Выводы 76
Практические рекомендации 77
Переспективы дальнейшей разработки темы 77
Список использованных сокращений 78
Список литературы
- Эпидемиология и клинические проявления
- Молекулярная эволюция и геномный полиморфизм
- Оценка аллельного полиморфизма штаммов M. avium subsp. hominissuis с использованием вариабельных локусов VNTR и MATR
- Генотипирование штаммов MAH с использованием 15 локусов MATR
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Микобактериоз — инфекционное заболевание животных и человека, возбудителями которого являются более 20 видов кислотоустойчивых медленно-и быстрорастущих убиквитарных нетуберкулзных (НТМБ) (Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005; Макарова М.В., 2009). Несмотря на спорадический характер заболевания, в последнее десятилетие отмечен рост пораженности населения микобактериозом легких, что связывают, в основном, с распространенностью иммуносупрессивных состояний. У 20% больных СПИД, несмотря на профилактическое лечение, в течение года развивается диссеминированная форма инфекции с неблагоприятным прогнозом (Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005; Литвинов В.И. и др., 2008).
Среди НТМБ наиболее часто встречаются медленнорастущие бактерии
Mycobacterium avium complex (МАС), представленные видами M. avium и M. intracellulare. Эти микроорганизмы - типичные обитатели окружающей среды, способные выживать в почве, воде, аэрозолях, системах водоснабжения и в биопленках (Falkinham J. et al., 2002; Yamazaki Y. et al., 2006), являются оппортунистическими патогенами диких и домашних животных (свиней и др.), птиц и человека (Turenne C. et al., 2002).
Наиболее актуальным возбудителем микобактериоза человека является M. avium. Согласно современным представлениям, вид M. avium включает несколько подвидов, ассоциированных с определенным кругом хозяев, экологическими и географическими характеристиками штаммов, которые имеют специфические геномные паттерны. Так, M. avium subsp. hominissuis (MAH) вызывает заболевания у людей (в т.ч., у ВИЧ-инфицированных) и свиней; M. avium subspp. avium (MAA), silvaticum (MAS) и paratuberculosis (MAP) поражают в основном птиц, диких и домашних животных (Rindi L. et al., 2002; Turenne C. et al., 2002).
Степень разработанности темы исследования
Трудоемкость методов идентификации и генотипирования микобактерий отчасти объясняет относительно небольшое число зарубежных и отсутствие отечественных публикаций, посвященных оценке биоразнообразия M. avium. Лишь недавно для видовой идентификации M. avium стали использовать методы, основанные на гибридизации с ДНК-зондами (например, тест-система GenoTypeMycobacterium CM/AS, Hain Lifescience). Для изучения геномного полиморфизма M. avium за рубежом до настоящего времени используют различные инсерционные последовательности (Insertion Sequence, IS) - мобильные элементы, в частности IS1245. Метод IS1245-RFLP-типирования позволяет проводить тонкую дифференциацию штаммов путем оценки количества и взаимного расположения фрагментов рестрикции в паттернах IS1245 (Van Soolingen D. et al., 1998; Inagaki T. et al., 2009; Johansen T. et al., 2005). Недостатками данного метода являются длительность и трудоемкость анализа, особые требования к качеству и количеству бактериальной ДНК, сложность интерпретации результатов при
оценке мультибендовых паттернов рестрикции, что существенно ограничивает применение данного метода в эпидемиологических исследованиях. В последнее десятилетие генотипирование M. avium осуществляют с использованием метода VNTR (Variable Number Tandem Repeats) - типирования для оценки аллельного полиморфизма восьми локусов VNTR (TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TR10, TR32) (Thibault V. et al., 2007). Учитывая относительно невысокую вариабельность большинства из указанных локусов для типирования штаммов M. avium subspecies hominissuis, японские исследователи предложили схему, которая включает 15 локусов MATR (Mycobacterium Avium Tandem Repeats): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 (Inagaki T. et al., 2009).
Неполнота сведений о генетической структуре российской популяции M. avium subspecies hominissuis, отсутствие простых и чувствительных молекулярно-генетических методов и схем геноидентификации и типирования возбудителя ограничивают исследования в области эпидемиологии микобактериоза в нашей стране.
Цель исследования: генотипическая характеристика штаммов M. avium,выделенных от человека, с использованием комплекса молекулярных маркеров.
Задачи исследования:
-
Провести геноидентификацию клинических изолятов микобактерий с использованием молекулярно-генетических методов анализа полиморфизма фрагментов рестрикции гена hsp65 (PRA- hsp65) и ПЦР-детекции инсерционных элементов IS900 и 901.
-
Изучить геномный полиморфизм изолятов M. avium, выделенных от различных групп больных микобактериозом (включая ВИЧ-инфицированных), с использованием комплекса методов анализа полиморфизма локусов VNTR, MATR и IS1245-RFLP-типирования.
-
Установить распространенность и оценить генетическое родство штаммов M. avium различных генотипов.
-
Оценить дискриминирующую способность полиморфных локусов VNTR и MATR.
-
Разработать схему генотипирования российских штаммов M. avium.
Научная новизна исследования
Впервые на основе анализа полиморфизма фрагментов рестрикции гена hsp65 и инсерционных элементов IS901 и IS900 с использованием методов, основанных на ПЦР, проведена идентификация и определена принадлежность к подвиду hominissuis 90 чистых культур M. avium, выделенных от больных микобактериозом легких (в т.ч., ВИЧ-позитивных) на территории Северо-Запада России.
Получены новые знания о структуре популяции M. avium subspecies hominissuis на Северо-Западе России на основе исследования геномного полиморфизма штаммов возбудителя, выделенных от больных микобактериозом, с помощью комплекса молекулярно-генетических методов (VNTR-, MATR-типирования и IS1245-RFLP-типирования).
Разработана научно обоснованная схема типирования российских штаммов M. avium subsp. hominissuis, основанная на идентификации возбудителя по 14 локусам VNTR-MATR с последующим анализом кластеров методом IS1245-RFLP, позволяющая
проводить мониторинг одного из наиболее актуальных возбудителей микобактериоза человека в России.
Впервые изучена информативность (дискриминирующая способность) 23 локусов VNTR и MATR для типирования российских штаммов M. avium subspecies hominissuis.
Установлено, что аллели 3 в локусе MATR-16 и 2 в локусе TR10 (MATR-9), имеющие делеции, являются маркерами российских изолятов M. avium subspecies hominissuis.
Впервые последовательности ДНК клинических штаммов Mycobacterium avium subspecies hominissuis депонированы в GenBank: а) последовательности локуса TR10, содержащие два идентичных интактных тандемных повтора 55 п.н. (accession no. JQ935977.1) и внутреннюю делецию размером 15 п.н. в первом из двух повторов (accession no. JQ918769.1); б) последовательность локуса МАTR-16, содержащая делецию двух нуклеотидов во втором повторе и внутреннюю делецию 28 п.н. в третьем повторе (accession no. KF479191).
Теоретическая и практическая значимость исследования
Установлено, что российская популяция M. avium subspecies hominissuis, представленная в данной работе изолятами больных микобактериозом людей, неоднородна по маркерам геномного полиморфизма VNTR, MATR и IS1245, что позволяет оценить этиопатогенетическую роль штаммов различных генотипов в развитии микобактериоза на территории Российской Федерации.
Показано, что распространенность VNTR- и MATR-типов M. avium subspecies hominissuis неодинакова у штаммов возбудителя различного географического происхождения, что вносит существенный вклад в характеристику глобальной популяции микроорганизма данного вида.
С учетом информативности маркеров геномного полиморфизма разработана научно обоснованная схема типирования российских штаммов M. avium subspecies hominissuis по 14 локусам VNTR-MATR с последующим анализом кластеров методом IS1245-RFLP, позволяющая установить генетическое родство между штаммами при проведении молекулярно-эпидемиологических исследований микобактериоза и мониторинга популяции возбудителя.
В лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера создана и поддерживается коллекция ДНК 90 клинических штаммов M. avium subspecies hominissuis. Создана компьютерная база данных, содержащая профили VNTR-, MATR- и IS1245-RFLP-типирования 90 клинических штаммов M. avium subspecies hominissuis.
Материалы исследования изданы в виде Информационно-методического письма
«Молекулярно-генетическая характеристика клинических штаммов Mycobacterium
avium subspecies hominissuis – возбудителя микобактериоза человека» (утверждено
директором ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера А.Б. Жебруном и
директором ФГБУ НИИ фтизиопульмонологии П.К. Яблонским 18 апреля 2014 г.) и
используются в научно-исследовательской работе лаборатории молекулярной
микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (Акт о внедрении от 21 мая 2014 г.).
Методология и методы исследования
Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное
применение методов научного познания. Предметом исследования явилась
характеристика геномного полиморфизма M. avium – возбудителя микобактериоза человека. Анализ научной литературы, посвящнной оценке молекулярных маркеров, используемых для дифференциации штаммов M. avium subspecies hominissuis, проведн на основе формально-логических методов исследования. Работа выполнена в формате сравнительного открытого исследования с использованием микробиологических, молекулярно-генетических, аналитических и статистических методов.
Материалы и методы
Объектом исследования были 120 чистых культур M. avium complex, выделенных в
2008-2011 гг. в ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России (СПбНИИФ) от жителей Санкт-Петербурга и Ленинградской области. Девяносто (из 120) штаммов, идентифицированные до вида M. avium, получены от больных микобактериозом легких (включая 27 ВИЧ-инфицированных), 18 - выделены от пациентов с подозрением на туберкулез. Эпидемиологические связи между случаями заболевания не установлены.
Микробиологический метод. Культивирование микобактерий осуществляли в лаборатории СПбНИИФ общепринятым методом на среде Левенштейна-Йенсена в течение 21 дня (Приказ № 109 Минздрава РФ от 23.03.2010); идентификацию чистых культур микобактерий проводили с использованием биохимических тестов (Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005).
Молекулярно-генетические методы. ДНК из исследуемых культур микобактерий, а также из эталонных и коллекционных штаммов M. avium subsp. avium ATCC 35712, IWGMT49 и M. avium subsp. paratuberculosis K10, предоставленных СПбНИИФ, выделяли согласно (van Embden et al. 1993). Геноидентификацию чистых культур микобактерий до вида и подвида проводили с использованием тест-системы GenoTypeMycobacterium CM/AS Hain Lifescience (Германия); методов анализа полиморфизма фрагментов рестрикции гена hsp65 (PRA–hsp65) (Chimara E. et al., 2008) и детекции инсерционных элементов IS900 и IS901 (Turenne C. et al., 2007).
Праймеры для ПЦР синтезированы в ООО «Синтол», г. Москва. Амплификацию ДНК IS900 и IS901 методом ПЦР осуществляли в термоциклере Bio-Rad С1000 Thermal Cycler (США). Общий объем реакционной смеси составил 25 мкл: по 1 мкл прямого и обратного праймеров (конечная конц. 200 мкМ/л), dNTPmix - 3,5 мкл (конечная конц. 200 мкМ/л), 10хПЦР-буфер – 5 мкл, MgCl2 – 1,5 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л), Taq-полимераза (Силекс, Москва) – 0,2 мкл (1 ед.), деионизированная вода – до 25 мкл; 1 мкл ДНК. Условия проведения ПЦР для амплификации IS901: 5 мин – 95 C, 35 циклов: 45 сек. – 95 С, 45 сек – 63 С, 45 сек – 72 С, 10 мин – 72 С; для амплификации IS900: 5 мин – 95 C, 35 циклов: 45 сек. – 95 С, 45 сек – 65 С, 45 сек – 72 С, 10 мин – 72 С.
Аллельный полиморфизм штаммов M. avium subsp. hominissuis изучали методом VNTR-типирования по 8 вариабельным локусам TR: TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TR10, TR32 (Thibault et al., 2007) и методом MATR-типирования по 15 вариабельным локусам MATR-: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 (Inagaki et al., 2009). Общий объем реакционной смеси для TR 292, X3, 25, 47, 3, 7 и MATR-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 13, 14, 15 составил 25 мкл: по 1 мкл прямого и обратного (конечная конц. 200 мкМ/л) праймеров, dNTPmix - 3,5 мкл (конечная конц. 200 мкМ/л), 5хПЦР-буфер – 5 мкл, MgCl2 – 1,5 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л) TaqF-полимераза (ИнтерЛабСервис, Москва) – 0,2 мкл (1 ед), вода – до 25 мкл. Общий объем реакционной смеси для TR10, TR32 и MATR-11, MATR-12, MATR-16 составил 30 мкл: по 1 мкл прямого и обратного (конечная конц. 200 мкМ/л) праймеров, dNTPmix - 4 мкл (конечная конц. 200 мкМ/л), 10хПЦР-буфер – 5 мкл, MgCl2 – 2 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л), Taq-полимераза (Силекс, Москва) – 0,2 мкл (1 ед.), диметил сульфоксид (DMSO) – 3 мкл, вода – до 30 мкл.
Условия проведения ПЦР для амплификации локусов TR47, MATR-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16: 5 мин – 95 C, 35 циклов: 30 сек. – 95 С, 30 сек – 62 С, 45 сек – 72 С, 10 мин – 72 С; для локусов TR 10, TR 32 и MATR-9: 5 мин – 95 C, 35 циклов: 30 сек. – 95 С, 30 сек – 57 С, 45 сек – 72 С, 10 мин – 72 С; для локусов TR292, TRX3, TR25, TR3, TR7: 5 мин – 95 C, 35 циклов: 30 сек. – 95 С, 30 сек – 58 С, 45 сек – 72 С, 10 мин – 72 С. Продукты ПЦР разделяли в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. В гель вносили маркеры молекулярной массы 100 bp DNA Ladder (ООО «Интерлабсервис», г. Москва) и 50 bp (GE Healthcare, США). Результаты визуализировали с помощью системы документации гелей «GelDoc» (BioRad, США). Число тандемных повторов в локусах рассчитывали, исходя из молекулярных масс ампликонов (Thibault V.C. et al., 2007; Inagaki T. et al., 2009). MATR- и VNTR-профиль каждого штамма записывали в виде набора цифр, соответствующих числу повторов в локусах, в следующем порядке: TR (292, X3, 25, 47, 3, 7, 10, 32) и MATR (-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -11, -12, -13, -14, -15, -16). Генотипирование изолятов M. avium методом IS1245-RFLP проводили согласно стандартному протоколу van Embden et al. (1993). Для ДНК-секвенирования продукты амплификации локусов TR10 и MATR-16 с праймерами 10F и 16F очищали с использованием набора реагентов GFX PCR DNA и Gel Band purification kit (GE Healthcare Life Sciences, США). Реакцию лимитированного секвенирования проводили с использованием Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Kits (PE Biosystems, version 2.0) и 4 пмоль соответствующего праймера. Капиллярный электрофорез выполняли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100 (Life Technologies, США).
Статистическая обработка результатов проведена с использованием программного обеспечения и информационных баз данных. Расчеты зависимости между переменными (частота признака) проводили с использованием таблицы 2х2 для ввода данных пакета программ EpiCalc 2000 version 1.02. Статистически значимыми считали различия при доверительном интервале 95% (р<0,05). Степень родства между штаммами M. avium оценивали с использованием алгоритма Neighbor Joining (NJ) и графически отображали в виде дендрограммы, построенной с учетом полиморфизма локусов MATR-VNTR
(URL. Профили (паттерны) штаммов (наборы фрагментов рестрикции хромосомной ДНК, содержащих участок нуклеотидной последовательности IS 1245) анализировали с использованием пакета программ BioNumerics5.1 (Applied Maths, Бельгия). Степень родства между штаммами М. avium subsp. hominissuis графически отображали в виде дендрограммы, построенной с использованием иерархического алгоритма связывания UPGMA (Unweighted Pair Group Method of Averages) на основе расчета коэффициента сходства Дайса (Dice coefficient) по формуле:
t>D" n,+nB , где nав – число общих фрагментов рестрикции ДНК у штаммов А и В; nА -число фрагментов у штамма А; nв - число фрагментов у штамма В. Для количественной оценки вариабельности локусов и дискриминирующей способности схем MATR-VNTR-и IS72^5-RFLP-типирования рассчитывали индекс разнообразия Хантера-Гастона (Hunter Gaston Diversity Index (HGDI)) (Hunter P. et al., 1988) (URL). Уровень дискриминации методов рассчитывали по формуле: HGDI=l-l/N*(N-l)IJ_1n * (п - 1), где N - общее число штаммов в выборке, s - число типов выявленных данным методом, п - число штаммов относящихся к j-тому типу. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакетов программ Sequence Scanner vl.0 (Life Technologies, США) и Unipro UGENE 1.12 (Россия).
Личное участие автора в получении результатов. Автором составлен план исследования, проведен аналитический обзор литературы, сформирована выборка изолятов микобактерий, выполнен весь объем молекулярно-генетических исследований. Культивирование и идентификация микобактерий, в том числе с использованием тест-системы GenoType Mycobacterium (Hain Lifescience, Германия), проведены совместно с Т.Ф. Оттен и В.Ю. Журавлевым - сотрудниками отдела лабораторной диагностики ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России (СПбНИИФ). Лимитированное ДНК-секвенирование проведено совместно с А.Б. Комиссаровым (ФГБУ НИИ гриппа Минздрава РФ). Автор провела анализ, статистическую обработку и систематизацию полученных данных, сформулировала выводы и практические рекомендации.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Изоляты микобактерий, полученные от больных микобактериозом, принадлежали кМ avium subspecies hominissuis.
-
Клинические изоляты М. avium subspecies hominissuis, полученные от больных микобактериозом, были неоднородны по 8 локусам VNTR и 15 локусам MATR.
-
Для дифференциации клинических изолятов М. avium subspecies hominissuis и установления генетического родства между ними оптимальна схема типирования по 14 локусам MATR и VNTR с последующим анализом кластеров методом IS7245-RFLP.
Степень достоверности и апробация результатов.
Результаты исследования полиморфизма ДНК 90 клинических изолятов М. avium, в частности локусов VNTR и MATR, полученные с использованием современных высокочувствительных и специфичных молекулярно-генетических методов,
воспроизводимы. Экспериментальные данные подвергнуты обработке и систематизации с помощью методов описательной статистики, пакетов компьютерных программ и информационных баз данных и представлены в виде таблиц и графических изображений.
Диссертация апробирована на заседании Ученого совета Федерального бюджетного
учреждения науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт
эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» (протокол № 5 от 21 мая 2014 г.).
Основные результаты исследований доложены и обсуждены на Российских и
международных конференциях: «Health and environment: environmental problems and
infectious diseases», 19 марта 2012 г., г. Осака, Япония; 34th congress European society of
mycobacteriology, 30 июня-03 июля 2013 г., г. Флоренция, Италия; международная
конференция «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций», 5-7 июня 2013 г.,
Санкт-Петербург; 8-я Всероссийская научно-практическая конференция с
международным участием «Молекулярная диагностика», 18-20 марта 2014 г., Москва; научно-практическая конференция «От эпидемиологии к диагностике инфекционных заболеваний: подходы, традиции, инновации», 23-25 апреля 2014 г., Санкт-Петербург; 35th congress European society of mycobacteriology, 29 июня-02 июля 2014 г., г. Вена, Австрия.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 4 статьи опубликованы в рецензируемых научных изданиях журналах, 1 – в других изданиях, 6 – в материалах конференций.
Структура и объем диссертации. Основной текст диссертации изложен на 99 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложений. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 15 рисунками. Список литературы содержит 94 источника, в том числе 5 - отечественных и 89 - зарубежных авторов.
Эпидемиология и клинические проявления
Выделение хромосомной ДНК из чистых культур M. avium
Для выделения хромосомной ДНК из исследуемых культур M. avium и лабораторных штаммов ATCC35712 и IWGMT49, полную бактериологическую петлю материала вносили в микропробирки объемом 1,5 мл, содержащие 400 мкл буферного раствора 1хТЕ (10 мМ Tris, pH 8.0 и 1мМ EDTA). Бактериальная масса в пробирках обеззараживалась при 80 С на водяной бане в течение 0,5 час. Далее проводили дезинтеграцию клеток. Для этого в каждую пробирку добавляли 50 мкл лизоцима (10 мг/мл); смесь инкубировали при 37 С в течение 18-20 ч. Пробирки встряхивали на вортексе - 30 с, добавляли 70 мкл 10% SDS и 5 мкл протеиназы К (10 мг/мл), инкубировали при 65 С 30 мин, добавляли 100 мкл 5М NaCl и 100 мкл раствора СТАВ1/NaCl (4,1 г NaCl, 80 мл дистиллированной воды, 10 г СТАВ), предварительно прогретого на водяной бане при 65 С не менее 10 мин. Пробирки встряхивали на вортексе 30 с, инкубировали при 65 С 40 мин. Продукты денатурации белков и полисахариды образовывали стойкий комплекс со СТАВ, а ДНК оставалась в растворе. В каждую пробирку добавляли смесь хлороформа и изоамилового спирта (24:1) в соотношении: 1 объем содержимого пробирки к 1 объему смеси. После центрифугирования при 13200 об/мин в течение 20 мин при 6 С, содержимое пробирок расслаивалось. Прозрачную надосадочную жидкость, содержавшую ДНК, отбирали в новые пробирки и добавляли равный объем охлажденного до минус 18 С изопропанола. Пробирки выдерживали при минус 18 С 18-20 ч для осаждения ДНК в виде белых нитей.
Очистку ДНК проводили путем обработки 70% этанолом и
центрифугированием при тех же условиях (см. выше). Осадок ДНК растворяли в 20 мкл 1хТЕ и хранили при 4 С до года. Контроль выделения ДНК осуществляли путем электрофореза. Пробы ДНК (4 мкл) вносили в лунки 0,8% геля агарозы (0,8 г агарозы, 100 мл дистиллированной воды, 2,5 мкл 10% бромистого этидия). Электрофорез проводили в растворе 1хТВЕ (89 мМ Tris, 89 мM борной кислоты, 2,5 мМ EDTA) в течение 20 мин при постоянном напряжении 100 V. По окончании электрофореза гель помещали на трансиллюминатор. Присутствие ДНК в пробе оценивали визуально по наличию светящейся полосы в ультрафиолетовом излучении.
Полученную ДНК использовали для постановки ПЦР с целью детекции инсерционных элементов IS900 и IS901, MATR-VNTR-типировании, а также для IS1245-, IS1311-RFLP-типирования.
Гексадецил триметил аммония бромид (Cetyltrimethylammonium bromide, СТАВ), Sigma, USA Видовая геноидентификация микобактерий Ускоренное определение видовой принадлежности изолятов микобактерий проводили с помощью молекулярно-генетических методов. Метод PRA–hsp65 - анализ полиморфизма фрагментов рестрикции гена hsp65 (PCR-Restriction enzyme Analysis, PRA-hsp65) [12].
Амплификацию участка гена hsp65 . осуществляли в термоциклере Bio-Rad С1000 Thermal Cycler (США). Общий объем реакционной смеси составил 25 мкл. ПЦР смесь включала: по 1 мкл прямого (ACCAACGATGGTGTGTCCAT) и обратного (CTTGTCGAACCGCATACCCT) праймеров (конечная концентрация 200 мкМ/л), dNTPmix - 3,5 мкл (конечная концентрация 200 мкМ/л), 10хПЦР-буфер – 5 мкл, MgCl2 – 1,5 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л), Taq-полимераза (Силекс, Москва) – 0,2 мкл (1 ед.), стерильная дистиллированная вода – до 25 мкл. В смесь вносили по 1 мкл ДНК, полученной, как указано в п.2.3.
Условия проведения ПЦР для амплификации hsp65: 5 мин – 95 C, 35 циклов: 30 сек. – 95 С, 30 сек – 58 С, 30 сек – 72 С, 10 мин – 72 С.
При постановке ПЦР в качестве контроля применяли ДНК штаммов M. avium subsp. avium ATCC 35712 и M. avium paratuberculosis K10.
Участок гена hsp65, амплифицированный в ходе ПЦР, расщепляли с помощью эндонуклеаз BstEII и HaeIII. В микропробирки объемом 0,5 мл вносили по 10 мкл смеси, содержавшей 3 мкл раствора рестриктазы BstEII (GE Healthcare Life Sciences, США) и 7 мкл пробы ДНК. В микропробирки объемом 0,5 мл вносили по 15 мкл смеси, содержавшей 3 мкл раствора рестриктазы BstEII (GE Healthcare Life Sciences, США) и 12 мкл пробы ДНК. Пробирки инкубировали 3 часа при 37C, охлаждали, погружая в ледяную крошку на 10 мин.
Фрагменты рестрикции разделяли методом электрофореза. Для разделения фрагментов рестрикции BstEII использовали 1,5% агарозный гель, окрашенный бромистым этидием. Для определения «размера» продуктов амплификации в гель вносили маркеры молекулярной массы 100 bp DNA Ladder (ООО «Интерлабсервис», г. Москва). Для разделения фрагментов рестрикции HaeIII использовали 3% агарозный гель (агароза Metaphor (Cambrex Bio Science) и обычная агароза в соотношении 2:1), окрашенный бромистым этидием. Для определения «размера» продуктов амплификации в гель вносили маркеры молекулярной массы 50 bp (GE Healthcare, США). Результаты визуализировали с помощью системы документации гелей «GelDoc» (BioRad, США). Размеры фрагментов рестрикции сравнивали с опубликованными [12].
Гибридизация с ДНК-зондами (MLPA – Multiplex Ligation dependent Probe Amplification – мультиплексная амплификация лигированных зондов) с использованием тест-системы GenoTypeMycobacterium CM/AS, Hain Lifescience (Германия) (Рисунок 1).
Молекулярная эволюция и геномный полиморфизм
Горизонтальный перенос генов (Horizontal Gene Transfer, HGT) – динамический процесс, являющийся важным механизмом эволюции генома прокариот. Поступление чужеродной ДНК в клетку посредством конъюгации, трансдукции и трансформации позволяет микроорганизму приобретать новые свойства, которые, зачастую, дают виду селективные преимущества при воздействии жестких условий окружающей среды. Ярким примером является обмен генетическим материалом, например, генами резистентности к антибиотикам и детерминантами вирулентности [62].
Известно, что у таких видов как M. tuberculosis, M. bovis и M. leprae способность к горизонтальному обмену генетической информацией и рекомбинации, контролируемой геном recA, до сих пор дискутируется, однако в настоящее время получены убедительные данные о возможности горизонтального переноса генов у НТМБ. Так, анализ нуклеотидных последовательностей кластера GPL (высоко консервативный 5 -регион, располагающийся между генами mtfB и gtfB) штаммов М. avium различных серотипов (2151, 724, 104) выявил мозаичную структуру этого участка у штамма М. avium 2151: одна часть идентична последовательности М. avium 724, а другая – М. avium 104. Подобная идентичность блоков GPL М. avium 2151, 724 и 104 может свидетельствовать о горизонтальной передаче и гомологичной рекомбинации участков ДНК [48]. Однако механизм обмена хромосомной ДНК (конъюгация, трансформация, трансдукция) у М. avium остается неясным [68].
Известно, что у М. avium, М. intracellulare и М. scrofulaceum имеются родственные плазмиды, которые способны к самостоятельной репликации. Так, среди плазмид М. avium и М. intracellulare обнаружена конъюгативная плазмида pVT2, что свидетельствует о возможности конъюгативного пути передачи ДНК в популяциях МАС. Описана конъюгативная плазмида pMA100, в состав которой входил интактный инсерционный элемент IS1245. Данная плазмида была выделена из смешанной культуры М. avium-М. kansasii, полученной от ВИЧ-позитивного пациента. В результате RFLP-анализа выявлено наличие IS1245 у штаммов М. kansasii, что свидетельствует о способности плазмиды pMA100 к межвидовому переносу IS1245 от М. avium к М. kansasii. В экспериментах in vitro был подтвержден конъюгативный перенос плазмиды pMA100 не только между М. avium и М. kansasii, но и между М. avium и M. bovis BCG Moreau [68, 69].
Передача ДНК может происходить также в процессе трансформации, природная способность к которой была открыта у М. avium [68]. Обмен генетическим материалом между микобактериями может происходить и путем трансдукции посредством бактериофагов, которых у микобактерий известно более 250 [48]. Таким образом, существование различных механизмов горизонтального обмена генетическим материалом и функциональной гомологичной рекомбинации у НТМБ не вызывает сомнения, однако требует дальнейших доказательств в отношении М. avium.
Идентификацию наиболее часто встречающихся видов микобактерий осуществляют с помощью ДНК-стриповой технологии GenoTypeMycobacterium CM/AS (Hain Lifescience, Германия), AccuProbe (GenProbe, США) [4], однако, определение подвида М. avium представляло проблему ввиду 97% сходства геномов некоторых подвидов [17].
Генетическое разнообразие M. avium обусловлено полиморфизмом кодирующих и некодирующих последовательностей генома. Так, для геноидентификации М. avium и других видов НТМБ используют анализ полиморфизма структурных генов rpoB (контролирует синтез бета-субъединицы РНК-полимеразы), gyrB (ответственен за синтез бета-субъединицы фермента ДНК-гиразы), secA1 (кодирует белок Sec1, обеспечивающий транспорт белков через цитоплазаматическую мембрану), recA (принимает участие в процессах рекомбинации ДНК, индукции SOS-ответа и SOS-репарации), sodA (кодирует фермент супероксиддисмутазу), ген 16S rRNA (несет информацию о последовательности рибосомной РНК) и область ITS гена 16S-23S rRNA (транскрибируемая последовательность ДНК, разделяющая активные участки гена 16S-23S rRNA) [6, 26].
Также для видовой идентификации в качестве генетической мишени используют видоспецифический участок гена hsp65 - одного из основных факторов патогенности Mycobacterium, кодирующего белок теплового шока (heat shock protein) молекулярной массой 65kDa [18, 57].
Telenti A. и соавт. (1993 г.) предложили оригинальный метод рестрикционного анализа для идентификации микобактерий – PCR-restriction enzyme analysis (PRA)-hsp65. Амплифицированный в ходе ПЦР участок гена hsp65 обрабатывают рестриктазами BstEII и HaeIII; полученные фрагменты рестрикции анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле. Это позволяет идентифицировать виды микобактерий, отличающиеся друг от друга набором фрагментов рестрикции [83]. Однако недостатком данного метода является наличие идентичных профилей рестрикции данного участка у некоторых видов НТМБ, включая M. avium.
Для определения подвидов M. avium удобным инструментом является использование различных видоспецифических инсерционных элементов (IS901, IS900, IS1245). Принято считать, что специфические последовательности IS901 и IS900 имеются лишь в геномах штаммов MAA (IS901), MAP (IS900) и MAS (IS901), выделяемых от животных и птиц, но не МАН [11, 20, 24, 26, 49, 88]. Элемент IS1245 присутствует в геномах всех подвидов M. avium, за исключением MAP, и не характерен для M. intracellulare. Поэтому отсутствие продуктов амплификации инсерционных элементов IS901 и IS900 при наличии IS1245 может свидетельствовать о принадлежности изученных штаммов M. avium к подвиду hominissuis. Однако ряд зарубежных авторов отмечали наличие IS901 у некоторых изолятов MAH, выделенных от больных микобактериозом людей в Японии, Германии, Чехии и Франции [37, 63, 72, 79]. Таким образом, выявление мобильных элементов IS901 и IS900 для определения подвида M. avium представляется оправданным с учетом географического происхождения исследуемых штаммов микобактерий.
Оценка аллельного полиморфизма штаммов M. avium subsp. hominissuis с использованием вариабельных локусов VNTR и MATR
В настоящей работе с помощью набора стандартных биохимических тестов была установлена принадлежность 90 чистых культур медленнорастущих кислотоустойчивых микобактерий к Mycobacterium avium complex и осуществлена дальнейшая видовая идентификация M. avium с помощью ДНК-стриповой технологии (GenoTypeMycobacterium CM/AS, Hain Lifescience).
Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции участка гена теплового шока hsp65 подтвердил принадлежность к данному виду изученных изолятов нетуберкулезных микобактерий, полученных от различных групп эпидемиологически не связанных пациентов в Cанкт-Петербурге и Ленинградской области в 2008-2011 гг. При этом была выявлена однородность паттернов рестрикции BstEII, которые характеризовались наличием двух фрагментов (235 п.н. и 210 п.н.) у всех изолятов. Напротив, паттерны HaeIII были неоднородны за счет присутствия у 7% изолятов помимо двух типичных фрагментов (130 п.н. и 105 п.н.) дополнительного фрагмента (60 п.н.) рестрикции. Указанные размеры фрагментов рестрикции BstEII и HaeIII соответствовали опубликованным [18] для штаммов M. avium, выделенных от различных источников.
Анализ зарубежной литературы позволил оценить эффективность используемых в мировой практике методов и схем определения различных подвидов M. avium, в частности, основанных на выявлении инсерционных последовательностей IS901 и IS900 у штаммов различного географического происхождения. Большинство авторов считают, что данные специфические последовательности имеются лишь в геномах штаммов M. avium subspр. avium (IS901), paratuberculosis (IS900) и silvaticum (IS901), выделяемых от животных и птиц [11, 20, 26, 88]. Таким образом, отсутствие продуктов ПЦР-амплификации инсерционных элементов IS901 и IS900 свидетельствовало о принадлежности всех 90 изученных клинических изолятов M. avium к подвиду hominissuis (МАН). Вместе с тем, наличие IS901 у ряда изолятов M. avium subsp. hominissuis, выделенных от больных микобактериозом людей в Японии, Германии, Чехии и Франции, по-видимому, может свидетельствовать об общности источников заражения животных и человека [37, 63, 72, 79].
Таким образом, выявление мобильных элементов IS901 и IS900 для определения подвида M. avium представляется оправданным с учетом географического происхождения исследуемых штаммов микобактерий.
До настоящего времени биоразнообразие российской популяции M. avium subsp. hominissuis - одного из наиболее актуальных возбудителей микобактериоза человека в России – оставалось неизученным, поскольку не была разработана приемлемая схема идентификации и генотипирования штаммов микроорганизма.
В мировой практике используют несколько методов и схем генотипирования изолятов M. avium различных подвидов. В настоящее время наиболее распространенным методом является анализ аллельного полиморфизма различных наборов локусов VNTR, применяемый большинством авторов. Так, схема генотипирования M. avium на основе анализа аллельного полиморфизма 8 локусов (TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TR10, TR32) VNTR, предложенная Thibault et al. в 2007 г., несмотря на ограниченную дискриминирующую способность, достаточно широко используется за рубежом для характеристики популяций M. avium subsp. hominissuis и для эпидемиологической оценки случаев заболевания микобактериоза среди людей и животных во Франции [70, 84], Словении [64], Японии [40, 43], Финляндии [86].
VNTR-типирование по 8 локусам 90 клинических изолятов МАН, представленное в диссертационной работе, показало, что 8 из 17 VNTR-типов с идентичными 8-значными числовыми профилями (число повторов в локусах) были представлены кластерами Ma81- Ma88, в состав которых входило 90,0% штаммов, причем большинство из них было получено от больных микобактериозом – 80,2%. Следует учитывать, что однократное выделение штаммов различных VNTR-типов, не имеющее диагностического значения, может свидетельствовать о транзиторном носительстве возбудителя. Среди ВИЧ-позитивных больных микобактериозом (n=27) показатель кластеризации был еще выше – 88,8%. Так, наиболее крупный кластер (Ma84) с числовым профилем 22221128 включал 46 (51,1%) штаммов, в том числе 15 штаммов от ВИЧ-позитивных, что составляло более половины всех штаммов, полученных от данной группы пациентов.
Подобный высокий уровень кластеризации штаммов МAH с указанным числовым профилем в литературе не описан, однако имеются сообщения о кластеризации нескольких десятков штаммов других VNTR-типов [40, 64, 70, 84].
Учитывая, что заражение человека осуществляется, в основном, от источников окружающей среды, высокий уровень кластеризации изученных штаммов MAH при отсутствии установленной связи между случаями заболевания можно объяснить невысокой вариабельностью (индекс разнообразия HGDI 0-0,61) восьми локусов VNTR. В этой связи, наличие в составе VNTR-кластеров штаммов, выделенных от ВИЧ-позитивных больных микобактериозом, вряд ли можно рассматривать как показатель преимущественного распространения штаммов MAH определенных генотипов среди больных этой группы, особенно принимая во внимание отсутствие доказательств передачи возбудителя от человека к человеку.
Генотипирование штаммов MAH с использованием 15 локусов MATR
С целью оптимизации схемы типирования российских штаммов МАН был проведен анализ полиморфизма 15 локусов MATR (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16), недавно описанных Inagaki et al. [40].
В результате 15-локусного MATR-типирования у 90 штаммов МАН было выявлено 35 вариантов профилей, что вдвое превышало таковое (n=17) при использовании 8-локусного VNTR-типирования (HGDI 0,714 и 0,806 соответственно).
Сравнение 15-локусных МАTR-профилей кластеров Ma151-9 изученных российских штаммов c опубликованными данными не выявило кластеризации штаммов M. avium subsp. hominissuis с аналогичными профилями в Японии при наличии кластризации штаммов генотипа 201222222232223, в нашем исследовании выявленного лишь в одном случае [40]. Наоборот, числовой профиль кластера Ma154 (224131342532443 ) российских штаммов был выявлен лишь у одного японского штамма M. avium subsp. hominissuis, причем локус MATR-16 (аллель 3) не был «усеченным».
Особый интерес представлял описанный впервые у 80,0% (из 90 изученных российских штаммов МАН) «усеченный» аллель (3) в локусе MATR-16, молекулярная масса которого, не соответствовала ожидаемым значениям. Секвенирование амплифицированного фрагмента MATR-16 штамма МАН 5122 (одного из представителей данной группы) выявило делецию двух нуклеотидов во втором повторе и внутреннюю делецию 28 п.н. в третьем повторе (GenBank accession no. KF479191).
Аллель 3в локусе MATR-16, так же как и аллель 2в локусе TR10 (MATR-9), выявленные у изученных российских изолятов M. avium subsp. hominissuis, не обнаружены у штаммов, выделенных от различных источников в других странах [40, 43, 64, 70, 84, 86]. Таким образом, данные аллели, по-видимому, являются маркерными для изученных российских штаммов M. avium subsp. hominissuis. Все 90 российских изолятов MAH послужили для оценки дискриминирующей способности MATR- и VNTR-типирования, основанных на анализе отдельных локусов и их различных комбинаций. Всего было оценено 23 локуса: 8 локусов VNTR и 15 локусов MATR.
Идентичность последовательностей TRX3 и MATR-3 (HGDI 0,624), TR292 и MATR-2 (HGDI 0,272), TR10 и MATR-9 (HGDI 0,186), отмеченная также японскими исследователями [40, 43], позволила исключить дублирующие локусы (MATR-2, MATR-3 и MATR-9) и использовать комбинированную схему типирования, включающую 20 локусов (12 - MATR и 8 - VNTR), в ходе изучения полиморфизма 90 российских штаммов. Сопоставление значений индекса разнообразия Хантера-Гастона для каждого локуса показало высокую информативность (HGDI 0,1) 14 из них (TR292, TRX3, TR25, TR47, TR10, MATR-1, MATR-4, MATR-5, MATR-6, MATR-8, MATR-11, MATR-14, MATR-15, MATR-16).
Оптимизированная 14-локусная схема типирования не отличалась по дискриминирующей способности от 20-локусной (HGDI 0,821), но была более эффективной, чем 8-локусная VNTR- (HGDI 0,714) и 15-локусная MATR- (HGDI 0,806) схемы типирования российских штаммов МАН.
В результате типирования по 14 локусам MATR-VNTR у 90 штаммов МАН было выявлено 36 вариантов профилей. При этом подавляющее большинство (68,9%) штаммов входили в состав 8 кластеров, наиболее крупный (Ma146) включал 37 (41,1%) штаммов с числовым профилем 22222223145443.
Для окончательной оценки родства, штаммы MAH, входящие в состав кластеров согласно 14-локусной схеме MATR-VNTR типирования, были подвергнуты генотипированию с использованием высоко дискриминирующего метода IS1245-RFLP-типирования. У 59 штаммов MAH, входящих в кластеры MATR-VNTR, были получены мультибендовые профили рестрикции IS1245 удовлетворительного качества, причем, лишь девять (15,3%) из них входили в состав четырех кластеров RFLP. При этом два кластера Mav1 и Mav2 включали по два штамма MAH ВИЧ-позитивных пациентов; кластер Mav4 был представлен двумя штаммами больных микобактериозом, один из которых был ВИЧ-позитивным; Mav3 объединял три штамма MAH ВИЧ-негативных пациентов. Теоретически, результаты IS1245-RFLP-типирования штаммов MAH могут свидетельствовать о наличии общих источников и факторов передачи возбудителя в группах больных, чьи штаммы входили в состав кластеров, однако эпидемиологические исследования не выявили связей между случаями заболевания. Полученные данные согласуются с общепринятым мнением о роли объектов окружающей среды в качестве источника инфицирования (в том числе внутрибольничного) человека нетуберкулезными микобактериями.
Несмотря на достигнутый высокий уровень дискриминации (HGDI 0,996), основным недостатком метода IS1245-RFLP, по сравнению с MATR-VNTR типированием, явилась сложность компьютерной обработки мультибендовых паттернов рестрикции (более 20 фрагментов).
С другой стороны, данный метод позволил провести окончательную оценку геномного полиморфизма исследуемых штаммов MAH. В результате установлено, что из 59 штаммов MAH, входящих в кластеры MATR-VNTR, лишь девять входили в состав четырех кластеров RFLP. Таким образом, метод IS1245-RFLP-типирования может быть использован для тонкой дифференциации клинических изолятов MAH и доказательства общности источника и путей передачи возбудителя в эпидемиологических исследованиях.
Использование независимых генетических маркеров – тандемных повторов и инсерционных элементов, обладающих разной скоростью и механизмами эволюции, позволило провести комплексную оценку геномного полиморфизма исследуемых штаммов MAH, достигая
