Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Патогенетическая роль синегнойнои инфекции 7
1.1. Распространение синегнойнои инфекции, ее источники 7
1.2. Формы проявления синегнойнои инфекции у разных видов животных 11
1.3. Ассоциативные формы синегнойнои инфекции 13
Глава 2. Биологические свойства возбудителя синегнойнои инфекции 15
2.1. Морфологические и культуральные свойства 15
2.2. Биохимические свойства возбудителя синегнойнои инфекции . 19
2.3. Серологическое типирование штаммов синегнойнои палочки.. 21
2.4. Чувствительность к антибактериальным препаратам 24
Глава 3. Факторы патогенности синегнойнои палочки и их роль в развитии инфекционного процесса. Определения вирулентности на лабораторных животных 28
ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
Глава 1. Материалы и методы 35
1.1. База исследований 35
1.2. Объекты исследований и выделение P.aeruginosa 35
1.3. Методы идентификация P.aeruginosa 36
1.3.1. Методы определения рода культур 36
1.3.2. Методы определения вида культур 38
1.3.3. Методы внутривидового определение типа культур 40
1.4. Методы определения чувствительности синегнойнои палочки к антибактериальным препаратам и бактериофагу . 41
1.5. Методы определения факторов патогенности синегнойнои палочки (экзотоксин А, протеолитические ферменты, внеклеточная слизь, адгезивная способность, вирулентность для
лабораторных животных) 42
Глава 2. Результаты исследований
2.1. Инфицированность животных, контаминированность кормов и объектов внешней среды P.aeruginosa в Краснодарском крае 46
2.2. Частота выделения P.aeruginosa в ассоциациях с другими микроорганизмами 51
2.3. Биологические свойства изолятов P.aeruginosa, выделенных из различных объектов 52
2.3.1. Морфологическая характеристика полученных изолятов... 53
2.3.2. Родовая идентификация изолятов P.aeruginosa 56
2.3.3. Видовая идентификация выделенных культур 59
2.3.4. Биохимическая и протеолитическая активность синегнойной палочки 66
2.3.5. Серологическая характеристика P.aeruginosa 70
2.4. Чувствительность синегнойной палочки к антибиотикам и бактериофагу 77
2.5. Факторы патогенности синегнойной палочки 86
2.5.1. Определение продукции экзотоксина А 87
2.5.2. Определение протеолитической активности P.aeruginosa 90
2.5.3. Определение экстрацеллюлярной (внеклеточной слизи) у штаммов синегнойной палочки 92
2.5.4.Определение адгезивной активности P.aeruginosa 94
2.5.5. Определение вирулентности на лабораторных животных.. 98
ГЛАВА 3. Обсуждение результатов исследования 101
Выводы 118
Практические предложения 120
Список литературы 121
Приложения 141
- Распространение синегнойнои инфекции, ее источники
- Морфологические и культуральные свойства
- Инфицированность животных, контаминированность кормов и объектов внешней среды P.aeruginosa в Краснодарском крае
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ. В последнее время особую актуальность приобрели так называемые факторные болезни, в этиологии которых участвуют различные условно патогенные микроорганизмы. Особое значение в этом плане принадлежит Pseudomonas aeruginosa. Это связано с её чрезвычайной устойчивостью ко многим антибактериальным препаратам и длительным переживанием во внешней среде. Этот микроорганизм, ранее считавшийся условно патогенным, сегодня приобретает ведущее значение в развитии как местных, так и генерализованных гнойно-воспалительных процессов у людей и животных [16, 18, 60, 61, 89, 105, 112, 118, 124, 174]. В связи с этим, ряд авторов считают, что P.aeruginosa перестала быть условно патогенным микроорганизмом и предлагают выделить синегнойную инфекцию в самостоятельную нозологическую единицу не только в заболевании пушных зверей, но и других животных и птицы. [4, 15,22,33,39,57].
Несмотря на многочисленность материалов по данной проблеме, тем немение, многие элементы синегнойной инфекции изучены не достаточно, и прежде всего это касается особенностей биологии возбудителя, обуславливающего заболевания у сельскохозяйственных и домашних животных. До сих пор отсутствуют сравнительные характеристики культуральных, антигенных и патогенных свойств P.aeruginosa, без чего невозможно рассматривать этот микроорганизм как потенциально опасный для теплокровных, который в процессе приспособительных процессов, сапрофитный образ существования сменил на паразитический.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Целью работы ставилось изучение биологических свойств P.aeruginosa, выделенной от животных, из кормов и объектов внешней среды в Краснодарском крае.
Для решения указанной цели были поставлены следующие задачи: - установить величину инфицированности животных и птиц и контаминирован-ность кормов и объектов внешней среды P.aeruginosa; - выяснить частоту встречаемости P.aeruginosa в ассоциации с другими микро организмами;
изучить морфологические, культуральные и антигенные свойства P.aeruginosa, выделенной из различных биообъектов и объектов внешней среды;
- определить патогенные свойства и вирулентность различных по происхождению штаммов синегнойной палочки;
- установить чувствительность штаммов синегнойной палочки к антибиотикам и бактериофагу.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые в Краснодарском крае установлена величина инфицированности различных видов животных, птиц, кормов и объектов внешней среды P.aeruginosa. Определена особенность морфологических и куль-туральных свойств различных штаммов P.aeruginosa. Установлена антигенная структура циркулирующих среди животных штаммов P.aeruginosa, определены доминирующие О-типы микроорганизма и его патогенность. Впервые проведён широкий микробиологический мониторинг распространения антибиотикорези-стентных и антибиотикочувствительных вариантов P.aeruginosa.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Результаты работы позволили установить распространение P.aeruginosa среди животных, в кормах и объектах ветеринарного надзора, установлены виды бактерий, являющиеся наиболее частыми ассоциантами синегнойной палочки. Серотипированием установлена эпизо-отологйческая значимость отдельных О-антигенных вариантов P.aeruginosa. Результаты изучения патогенных и вирулентных свойств показали опасность штаммов P.aeruginosa, выделенных не только от животных, но и из кормов и внешней среды. Данные антибиотикограмм позволили установить круг антибиотиков, которые целесообразно использовать при синегнойной инфекции. На основании проведённых исследований появилась возможность прогнозировать появление болезни, проводить эпизоотологический мониторинг и разработать эффективные средства и методы профилактики и лечения. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на научной конференции УГАВМ (г. Троицк, 2005г.), на заседаниях учёного Совета КНИВИ, а так же на тематических семинарах врачей-бактериологов проводимых на базе ФГУ «Краснодарская МВЛ» (2003-2006 г).
ПУБЛИКАЦИИ. По результатам исследований опубликовано 4 работы, в том числе «Методические рекомендации по диагностике, профилактике и лечению псевдомоноза сельскохозяйственных животных», утверждённые РАСХН, Москва, 2003г.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
- частота выявления P.aeruginosa в Краснодарском крае;
- морфо-культуральные и антигенные свойства различных по происхождению штаммов P.aeruginosa;
- патогенность и чувствительность синегнойной палочки к антибактериальным препаратам и бактериофагу.
ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 141 странице текста компьютерного исполнения, включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждения, выводы, практические предложения, списка литературы и приложения. Текст диссертационной работы иллюстрирован 27 таблицами, 2 рисунками. Список литературы включает 188 автора, в том числе 121 отечественных и 67 иностранных.
Распространение синегнойнои инфекции, ее источники
Псевдомоноз (синегнойная инфекция) - инфекционное заболевание, вызываемое Pseudomonas aeruginosa. Из рода Pseudomonas этот вид является самым известным и наиболее изученным. Первые исследования биологических свойств этого микроорганизма и возможной его роли в патологии теплокровных были проведены еще в XIX столетии [175].
Возбудитель псевдомоноза - Pseudomonas aeruginosa (Bacillus Pyocyaneus -синегнойная палочка) впервые обнаружена в 1862 году A/ Lucke, который впервые описал нагноение раны, у человека, вызванное синегнойной палочкой, при этом он отметил характерное сине-зеленое окрашивание повязок. В чистой культуре синегнойная палочка была выделена C.Gessard в 1882 году и названа В.Руосуапеа (палочка синего гноя). G.Gruber в 1887 году обнаружил этот микроорганизм в отделяемом из уха, а двумя годами позже A.Charrin продемонстрировал его патогенность для животных. В 1894 году Migula описал новый род Pseudomonas и в 1895 году предложил включить в этот род Bac.Pyocyaneus как Pseudomonas aeruginosa, что было официально утверждено номенклатурным комитетом Международного общества микробиологов в 1952 году (цит. по Берджи, 1980), однако название «синегнойная палочка» часто используется до настоящего времени. В последнем определителе Берджи [83] этот микроорганизм отнесен в отдел Cracillicutes, группу 4, семейство Pseudomonadaceae, к роду Pseudomonas и виду Pseudomonas aeruginosa.
Синегнойная палочка настолько широко распространена в природе, что трудно сказать, из какого объекта исследования она не могла бы быть выделена.
Изучая обсеменность синегнойной палочкой объектов окружающей среды (1795 проб), ее присутствие было обнаружено в подземной питьевой воде (16,3%) случаев), воде открытых водоемов (10,5%»), пищевых продуктах (4,0% ), аптечном материале (1,3%), смывах (0,9%), испражнениях людей (9,4%) [27]. Синегнойная палочка была высеяна из сырой мороженной свинины, говяжьего мяса, фляжного молока, из готовых блюд на предприятиях общественного питания и из других пищевых продуктов [123].
Изучая пути распространения синегнойной инфекции на племенных станциях установлено, что оборудование станции было обсеменено P.aeruginosa в 66,6% случаев, поверхность кожи животного в области крупа 77,7%, предметы ухода за животными 66-70%, неиспользованная подстилка 40%, препуциальная слизь племенных быков 57,2%, сперма в 53,4% случаев [17, 54].
Авторы так же указывают на частое обсеменение синегнойной палочкой окружающей среды [32]. Тот факт, что бактерии рода Pseudomonas давно существует на земле и с течением времени не исчезают, подтверждают учёные, обнаружив их (по свойствам близким к P.aeruginosa) в ледниковой толще Антарктиды, возраст которой 2100-2500 лет [103].
P.aeruginosa способна выживать в почве, воде, на различных объектах внешней среды, в организмах животных, человека, рыб, пчел, в кормах [22, 53, 141] и вызывать инфекции у самых различных видов животных и растений [63, 139]. Некоторые авторы считают, что резервуаром и промежуточными хозяевами синегнойной палочки могут быть растения, у которых отмечаются различные типы поражений: разрастание тканей (на стеблях фасоли), мягкую и сухую гниль, изменение цвета растительной ткани (картофель, морковь, лук) [33].
Физиологические свойства и огромный метаболический потенциал синегнойной палочки хорошо согласуются с причислением этой псевдомонады к свободноживущим видам микроорганизмов [20]. Такое заключение опирается на способность этого вида синтезировать ряд вторичных метаболитов (синильную кислоту, пиоцины), подавляющих рост широкого круга микроорганизмов.
Вопрос о естественной среде обитания синегнойной палочки, обладающей громадным метаболическим потенциалом, сложен, нередко трудно определить, какая из сред ее обитания основная, дополнительная и (или) случайная. Принято считать, что синегноиная палочка часто выделяется из почвы, накопленная к настоящему времени информация недостаточна для отнесения ее к микроорганизмам, широко распространенным в почве. Еще более сложен вопрос о том, является ли этот вид псевдомонад свободноживущим, поскольку не исключена возможность ее заноса в почву с водой, из растений, а так же из кишечника животных и человека [171].
Получены интересные сведения о распространении P.aeruginosa в воде. В соответствии с обобщениями Rhame [173], она часто выделяется в сточных водах, в речной воде [10, 123, 128, 144, 151, 164]. Стоки боен содержат значительные количества этой псевдомонады.
В целом считается, что синегноиная палочка чаще выявляется в почве богатой органическими соединениями, из водных источников теплых климатических регионов. В регионах с холодным климатом синегноиная палочка не является нормальным обитателем поверхностных вод. А поступает в них из кишечника животных и человека.
Исходя из того, что в открытых водоемах, не сообщающихся со сточными водами, этот микроорганизм не выявляется, а обнаруживается только во время купального сезона, человек и животные контаминируют водные источники, являясь основным резервуаром микроорганизма [152].
Морфологические и культуральные свойства
Согласно данным, приводимым в руководствах по систематике бактерий и в различных публикациях, посвященных изучению биологических свойств си-негнойной палочки, последняя представляет собой палочковидный микроб, длина и ширина варьирует от 0,4-1,0 мкм до 0,8-2,5 мкм, что, вероятно связано с наблюдением в различные фазы роста бактерий [76, 126]. Учёные отмечают, что если в фазе логарифмического роста преобладали бактерии размером 0,4 х 1,0 мкм, то в стационарной фазе клетки уже имели размеры 0,6-0,7 х 1,2-2,2 мкм [74].
P.aeruginosa хорошо красятся анилиновыми красками [1, 14, 59, 67]. В мазках из чистой культуры бактерии просматриваются как одиночные, парные или в цепочках палочки. Они грамотрицательные, спор не образуют, подвижны, имеют один или два жгутика и различное число пилей - от 2 до 10. Пили представляют собой сократимые нити диаметром 6 нм и длиной 2,5 мкм. Они могут располагаться полярно или перитрихиально. Полярные пили возбудителя си-негнойной инфекции могут служить рецепторами различных фагов и способны сокращаться. В пилях идентифицированы 4 антигенных участка [1, 99, 126]. Некоторые авторы описали наличие у P.aeruginosa также 1-3 полярных, биполярных и боковых жгутиков. Наличие жгутиков, а, следовательно, и сам факт подвижности синегнойной палочки играет важную роль в идентификации этого вида, хотя из природных условий выделяются неподвижные изоляты различных штаммов P.aeruginosa [68].
По мнению одних авторов, клетки P.aeruginosa с выраженной слизистой капсулой, которая выявилась при окраске по Гинсу [26]. По мнению других, бактерии синегнойной палочки истинной капсулы не образуют, но продуцируют слизь, которая тонким слоем окружает бактериальную клетку. Эта слизеподобная капсула состоит из внутреннего (ригидного) слоя, тесно связанного с клеточной стенкой, и наружного, более тонкого, на поверхности которого расположено много шаровидных образований [1]. Встречаются так называемые му-коидные штаммы, которые в любых условиях культивирования образуют повышенное количество слизи [117]. У бактерий, выделенных на кровяном агаре, наблюдается наличие микрокапсулы, шириной до 115 нм [68].
Цитоплазма P.aeruginosa имеет гранулярное строение, выявляются беспорядочно расположенные вакуоли и включения.
Ультраструктура клеточной стенки и мембраны P.aeruginosa характерен для грамотрицательных микроорганизмов [157]. В структуре клеточной оболочки синегнойной палочки, при изучении на ультратонком срезе, обнаружены: наружная мембрана, пептидо-гликановый (муреиновый) слой и липо-протеиновый слой. Все три слоя непраницаемы для потока электронов. Между клеточной оболочкой и цитоплазматической мембраной существует промежуток - периплазматическое пространство [127].
Липополисахарид (ЛПС) - важная составная часть наружной мембраны P.aeruginosa, у возбудителя синегнойной инфекции выявлено около 20 О-серотипов. Поскольку О-серотиповая принадлежность служит стойким маркером, этот признак широко используется для типирования. У P.aeruginosa выявлены своеобразие химического состава внешней мембраны и особенности строения клеточной стенки. Эти важные особенности имеют существенное значение в биологии ее пластичности, в приспособлении к меняющимся условиям внешней среды и находят свое отражение в своеобразии ее паразитизма [20].
Клетки синегнойной палочки, выделенные из различных источников, отличаются друг от друга. Так, выделенные от больных, по сравнению с выделенными от здоровых и из окружающей среды, имели менее контурное строение клеточной стенки, а в цитоплазме их обнаружены осмиофильные гранулярные включения и везикулярные структуры [38].
Синегнойная палочка хорошо растет и развивается в аэробных условиях на обычных питательных средах [45]. Температурный оптимум роста 30-37С, но могут расти и в температурных интервалах от +5С и +42С [23, 67, 144]. Рост P.aeruginosa при +5С и +42С считается тестом, дифференцирующим эту бактерию от других видов псевдомонад [22, 144]. Синегнойная палочка считается строгим аэробом, но способна к росту в анаэробных условиях в присутствии глюкозы и нитратов, за счет расщепления последних ферментом глюкозогидро-геназой [182]. Ростовой диапозон рН среды от 5,45 до 8,62 [67].
Рост на обычном мясопептонном бульоне (МПБ) характеризуется помутнением его и образованием на поверхности серовато-серебристой пленки, а со временем и осадка на дне пробирки [1, 26, 56, 67].
На МПА, средах Эндо или Плоскирева можно различить 5 видов колоний: 1) плоские, неправильной формы; 2) колонии, напоминающие колонии E.Coli в S-форме; 3) складчатые («цветок маргаритки»); 4) слизистые и 5) карликовые или точечные [76]. По данным других авторов, на мясопептонном агаре (МПА) P.aeruginosa образует круглые, полупрозрачные колонии с ровными или слегка волнистыми краями. Поверхность их гладкая, влажная блестящая [67].
На среде Левина колонии синегнойной палочки имеют малиновое окрашивание различной насыщенности. На среде Плоскирева - серое, тусклорозоватое, переходящее на 4-5 сутки в светло-коричневое. Колонии становятся вязкими, трудно снимаются с поверхности агара.
Инфицированность животных, контаминированность кормов и объектов внешней среды P.aeruginosa в Краснодарском крае
Из исследуемых 350 культур все они оказались подвижными. 193 (55,1%) изучаемых штамма через 24 ч и 256 (73,1%) штамма через 48 ч давали характерный рост с образованием водорастворимого фенозинового пигмента пио-цианина на среде с N-цепилпиридинием хлорида. В тоже время, на этой среде было выявлено 94 (26,9%) беспигментных штамма, хотя при дальнейшем исследовании 266 (76%) культур выращенных на МПБ продуцировали пиоцианин, что подтверждалось в пробе с хлороформом. Наибольшей пигментообра-зующей активностью на среде с N-ЦПХ через 24 ч отличались штаммы, изолированные из патматериала от пушных зверей (68%), материала от крупного рогатого скота (в среднем 61%), птицы (в среднем 64%), патматериала от собак и кошек (56%) и материала от свиней (в среднем 55%). Меньшее количество изо-лятов, продуцирующих пиоцианин на данной среде, выделяли из объектов внешней среды (16%) и корма (40%). Через 48 ч, в среднем, 85% штаммов изолированных из материала от крупного рогатого скота и 80% из патматериала от пушных зверей, а так же из корма обладали большей пигментообразующей активностью. У культур выделенных из материала от свиней и птицы, в среднем, у 72% отмечалась активность к пиоцианинообразованию. Наименьшее количество изолятов продуцирующих пиоцианин мы выделили из объектов внешней среды (24%о).
Цитохромоксидазный тест, в 100% случаев был положительный. Все культуры обладали аргинидегидролазной активностью, но одновременно они не продуцировали лизин- и орнитиндекарбоксилазу. При изучении отношения выделенных культур к глюкозе установлено, что через 24 ч 84 % штаммов, через 48 ч 100% усваивали её через окисление. Ни в одном случае не было зафиксировано утилизации сахара по средствам брожения, что позволяет дифференцировать бактерии рода Pseudomonas не только от бактерий рода Aeromonas, но и от бактерий группы кишечной палочки. Между тем, сахаролитическая способность у различных штаммов неодинакова. Наиболее выраженными окислительными способностями обладали культуры, изолированные из абортплодов 59 %), смывов из влагалища 23 (92%) свиноматок, объектов внешней среды 23 (92 %), спермы хряков-производителей, патматериала от свиней, смывов из влагалища коров 22 (88%), которые окисляли глюкозу уже через 24 ч. Количество культур изолированных от крупного рогатого скота и кормов через это же время способных окислять глюкозу было на 8-10 % меньшим.
Результаты таблицы свидетельствуют, что данная система тестов и результаты позволяют с уверенностью отнести все культуры исследуемых штаммов си-негнойной палочки к микроорганизмам рода Pseudomonas, т.к. все исследуемые клоны микроорганизмов подвижны, цитохромоксидазный тест у них положительный. Все культуры окисляли глюкозу в аэробных условиях и большинство 256 (73,1%) штаммов давали характерный рост с образованием пиоцианина на селективной среде с N-цетилпиридинием хлоридом. Все эти данные характерны для бактерий рода Pseudomonas.
Для подтверждения принадлежности 350 культур псевдомонад к виду aeruginosa они были проверены по таким тестам, как: 1) характер роста на обычном мясо-пептонном бульоне; 2) рост на ацетамидном агаре; 3) пигменто-образование; 4) термофильность; 5) восстановление нитратов в нитриты; 6) наличие фермента каталазы; 7) определение гемолитических свойств синегнойной палочки. Результаты опытов представлены в таблице 8, из которой видно, что на МПБ все изученные культуры образовывали характерную серовато-серебристую пленку, на дне пробирки выпал слизистый осадок. Зачастую тяжелая пленка с поверхности бульона опускалась на дно пробирки и тогда поверхность МПБ была чистой.
