Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 7
Глава 1. Семейство Sm и Sm-подобных белков 7
Глава 2. Пространственная структура Sm/Sm-подобных белков 8
2.1. Первичная структура Sm-подобных белков 9
2.2. Четвертичная структура Sm/Sm-подобных белков 12
2.2.1. Белок AF-Sm2 может быть гексамером и гептамером 16
2.2.2. Октамерный белок Lsm3 21
2.2.3. Бактериальные белки Hfq – гексамеры 22
2.2.4. Некоторые Sm-подобные белки эукариот существуют в виде мономеров 23
2.3. Динамика четвертичной структуры Sm/Sm-подобных белков 24
2.4. Образование фибрилл 27
Глава 3. Функции Hfq в клетке 32
3.1. Hfq имеет две РНК-связывающие поверхности 33
3.2. Взаимодействие Hfq с малыми регуляторными и матричными РНК 41
3.3. Взаимодействие Hfq с белками 49
3.4. Функции Hfq в нуклеоиде 50
ЧАСТЬ II. Методическая 52
Глава 4. Материалы и методы 52
4.1. Методы генной инженерии и микробиологии 52
4.1.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле 52
4.1.2. Получение плазмид с необходимыми мутациями 52
4.1.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 53
4.1.4. Очистка фрагментов ДНК 54
4.1.5. Получение компетентных клеток 54
4.1.6. Трансформация клеток 54
4.1.7. Выделение плазмидной ДНК 55
4.2. Биохимические методы при работе с белками 55
4.2.1. Экспрессия генов hfq дикого типа и его мутантных форм 55
4.2.2. Выделение белка Hfq дикого типа и его мутантных форм 55
4.2.3. Тепловая коагуляция термолабильных белков 55
4.2.4. Гидрофобная хроматография 56
4.2.5. Ионообменная хроматография 56
4.2.6. Аналитическая гель-фильтрация 56
4.2.7. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН 57
4.2.8. Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях 57
4.2.9. Кристаллизация белков Hfq 58
4.3. Определение стабильности белка Hfq дикого типа и его мутантных форм 58
4.3.1. Измерение спектров кругового дихроизма 58
4.3.2. Термофлуоресцентный анализ 59
4.3.3. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия 60
4.4. Определение и уточнение структур белков и комплексов белка Hfq с
нуклеотидами 61
ЧАСТЬ III. Результаты и их обсуждение 62
Глава 1. Получение генетических конструкций мутантных белков Hfq 62
Глава 2. Выделение белка Hfq дикого типа и его мутантных форм 62
Глава 3. Влияние произведенных замен на стабильность и олигомерное состояние
белка Hfq 65
3.1. Влияние произведенных замен на стабильность вторичной структуры
белка Hfq 65
3.2. Влияние произведенных замен на экспонированность гидрофобных областей на поверхности белка 68
3.3. Влияние произведенных замен на стабильность мутантных белков 70
3.4. Влияние произведенных замен на олигомерное состояние белка Hfq 73
Глава 4. Кристаллизация мутантных белков 78
4.1. Использование метода термофлуоресцентного анализа для поиска условий кристаллизации мутантных форм белка Y55A, D40A и YKHA/RGDT PaeHfq. 80
Глава 5. Определение структур белков Hfq 83
Глава 6. STRONG Анализ полученных данных по стабильности и кристаллических структур
белков Hfq STRONG 84
Глава 7. Проверка ATФазной активности белка 89
Глава 8. Кристаллизация препаратов Hfq с рибонуклезидтрифосфатами 91
Глава 9. Определение структур полученных комплексов 93
9.1. Структура комплекса Hfq c ATФ и с его нерасщепляемым аналогом ADPNP 95
9.2. Структура комплекса Hfq c ЦTФ 97
9.3. Структура комплекса Hfq c УTФ 100
9.4. Hfq не формирует устойчивых комплексов с ГТФ 101
Глава 10. Сравнение полученных нами структур комплексов Hfq- рибонуклезидтрифосфатов с известными структурами комплексов HfqолигоРНК 104
Глава 11. Модель связывания белка Hfq с РНК 107
Заключение 111
Выводы 112
Список использованной литературы 113
- Белок AF-Sm2 может быть гексамером и гептамером
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
- Выделение белка Hfq дикого типа и его мутантных форм
- Использование метода термофлуоресцентного анализа для поиска условий кристаллизации мутантных форм белка Y55A, D40A и YKHA/RGDT PaeHfq.
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Регуляция экспрессии генов (процесса преобразования наследственной информации от гена в белок или нетранслируемую РНК) определяет состояние и функцию каждой живой системы (клетки или организма). Важную роль в регуляции экспрессии генов играют взаимодействия белков с ДНК и РНК, которые определяют скорость и направление происходящих процессов. Структурно-функциональные исследования белков-регуляторов транскрипции и трансляции, а также детализация их взаимодействий со специфически узнаваемыми участками ДНК и РНК, имеет большую значимость для понимания регуляции экспрессии генов во всех живых организмах.
В качестве объекта исследования выбран белок Hfq, который в бактериальных клетках играет роль глобального регулятора экспрессии генов. Он выполняет свои функции, изменяя трансляционную активность и время жизни матричных РНК, кодирующих более 40 белков E.coli.
Цель и задачи исследования.
Основными целями работы были: определение структурной единицы белка Hfq, ответственной за его термостабильность, и поиск нового способа локализации РНК-связывающих участков на поверхности белка. Для достижения целей были поставлены следующие задачи: 1) Выделить мутантные формы белка Hfq с заменами Q8A, N28A, D40A и Y55A. 2) Определить степень олигомеризации полученных белков. Оценить стабильность белков. 3) Получить кристаллы мутантных форм белка Hfq. Проанализировать влияние произведенных замен на структуру и стабильность белка Hfq. 4) Получить и закристаллизовать комплексы белка Hfq c изолированными рибонуклеотидтрифосфатами (ATP, CTP, GTP, UTP). 5) Определить структуры полученных комплексов. Провести анализ обнаруженных сайтов связывания рибонуклеотидтрифосфатов. 6) Сравнить
положение рибонуклеотидтрифостфатов в полученных нами структурах с положением соответствующих нуклеотидных остатков в известных структурах комплексов Hfq с олигоРНК.
Научная новизна и практическая ценность исследования.
Исследован вклад недоступных растворителю водородных связей, образованных консервативными аминокислотными остатками, в термостабильность белка Hfq из мезофильной бактерии P. aeruginosa. Впервые была измерена термостабильность белка Hfq (Тпл.=120С при рН=7) и предложена модель плавления белка Hfq, в которой единицей, определяющей термостабильность белка, является его мономер. Полученные результаты могут использоваться для повышения термостабильности белков, содержащих Sm фолд или близкие ему по структуре OB и SH3 фолды.
Разработан и успешно использован новый подход к локализации участков связывания одноцепочечных участков РНК (оцРНК) на поверхности белка при помощи рентгеноструктурного анализа. Впервые показано, что ЦТФ, УТФ и АТФ взаимодействуют с Hfq в сайтах связывания одноцепочечных участков РНК, причем ориентация оснований и рибозы в нуклеотид-белковых и в РНК-белковых комплексах совпадают. Показано, что белок Hfq не связывает гуаниновые основания. На основании полученных нами данных детализована модель связывания матричных и регуляторных РНК с белком Hfq. Предложенная методика поиска мест связывания РНК на поверхности белка Hfq может быть использована для локализации сайтов связывания одноцепочечных РНК (ДНК) на поверхности других белков, связывающих нуклеиновые кислоты.
Апробация работы и публикации. Результаты работы неоднократно представлялись на российских и международных конференциях. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в ведущих научных
журналах, рекомендованных ВАК, и 12 тезисов. Полученные структуры депонированы в банк данных PDB (3QUI, 4MMK, 4MML, 4J5Y, 4J6W, 4J6X, 4J6Y).
Структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы (166 наименований). Диссертация содержит 68 рисунков и 6 таблиц.
Белок AF-Sm2 может быть гексамером и гептамером
История эукариотических LSm белков началась в 1959 году, когда впервые диагностировали аутоиммунное заболевание - красную системную волчанку. Оказалось, что в ходе развития болезни организм больного продуцирует антитела к собственным РНК-белковым антигенам, локализованным в ядре. Антигены, вызывающие заболевание, в 1966 году были названы “smith antigen” (SmAg) (Notman et al, 1975). Позднее было установлено, что белковая фракция данных антигенов входит в состав сплайсосомы, а также формирует комплексы с малыми ядерными РНК. Найденный белок был назван Sm белком. Помимо семи Sm-белков, которые входят в состав сплайсосомы (Kambach et al, 1999а), в эукариотах было найдено более пятнадцати белков, содержащие Sm домен, близких по последовательности, однако не входящих в состав сплайсосомы. Такие белки были названы Sm-подобными белками (Salgado-Garrido et al, 1999; Sraphin, 1995), они также как Sm белки являются РНК-связывающими белками и выполняют различные функции в процессах транскрипции и трансляции РНК (Tritschler et al, 2007, 2008), принимают участие в созревании гистонов (Strub and Birnstiel, 1986), поддержании структуры теломер (Seto et al, 1999) и деградации мРНК (Bouveret et al, 2000; Не and Parker, 2000).
Впервые бактериальный Sm-подобный белок Hfq был открыт в 1968 г. как клеточный белок E.coli HF-I (Host factor I), участвующий в репликативном цикле бактериофага Qp (Shapiro et al, 1968). Позднее этот белок был обнаружен во многих грамположительных и грамотрицательных бактериях. В бактериях белок Hfq выполняет роль глобального регулятора экспрессии генов, влияя на уровень трансляции мРНК как напрямую, так и посредством малых регуляторных РНК (Link et al., 2004).
Функции Sm-подобных белков в археях до сих пор подробно не изучены. Архейные Sm-подобные белки были впервые идентифицированы в 1999 г. при системном анализе аминокислотных последовательностей геномов эукариот и архей (Salgado-Garrido et al, 1999). Было найдено по одному или по два различных гена Sm-подобных белков в геномах ряда архей. Отсюда следовало, что архейные геномы кодируют один или два Sm-подобных белка, которые принадлежат двум подсемействам, названным Sm1 и Sm2 (Salgado-Garrido et al., 1999). Наиболее распространенным типом Sm-подобных белков в археях является Sm1. Последним был обнаружен третий тип Sm-подобных архейным белков – Sm3 – отличающийся от Sm1 и Sm2 подсемейств наличием добавочного Сконцевого домена (Mura et al., 2003).
Известно, что архейные Sm-подобные белки взаимодействуют с PNPase P и Убогатыми последовательностями, что предполагает участие архейных Sm-подобных белков в процессинге тРНК (Brennan and Link, 2007). По своей структуре архейные белки более близки к эукариотическим Sm-подобным белкам, чем к бактериальным: в растворе и кристаллах они формируют гептамеры как эукариотические белки (Collins et al., 2001; Mura et al., 2001; Tr et al., 2001) и, в отличие от бактериальных белков, не содержат длинного С-концевого хвоста (Tr et al., 2001).
Глава 2. Пространственная структура Sm/Sm-подобных белков
Первые данные о структуре белка Hfq из E.coli были получены с помощью электронной микроскопии (Zhang et al., 2002). На электронно-микроскопических изображениях видно, что белок образует симметричные пентамеры или гексамеры диаметром около 70–80 (рис. 1). Определение пространственных структур белка Hfq из Staphylococcus aureus (Schumacher et al., 2002), коровой части (1–72 остатки) белка из E.coli (Sauter, 2003) и белка из Pseudomonas aeruginosa (Nikulin et al., 2005) подтвердило формирование белком Hfq четвертичной структуры в виде гексамера (рис. 4). В кристаллах белки Hfq образуют тороиды с внешним диаметром около 70 и центральной полостью диаметром 8–10 . Формирование четвертичной структуры белков семейства Hfq происходит за счет образования “сквозного” -листа путем объединения -тяжей соседних мономеров. Водородные связи, образуемые атомами главных цепей соседних -тяжей, определяют ориентацию мономеров относительно друг друга в олигомере. Рис. 1. Электронно-микроскопические фотографии гексамеров Hfq из E. coli. На рисунке слева видны частицы округлой формы. Изображения отдельных 689 гексамеров были использованы для построения обобщенной модели белка, которая имеет выраженную симметрию 6 порядка (справа) (Zhang et al., 2002).
Сравнение аминокислотных последовательностей бактериальных Sm-подобных (Sm-like, LSm) белков Hfq показало, что они имеют выраженную консервативную центральную область примерно в 80 аминокислотных остатков и вариабельную Сконцевую часть переменной длины (рис. 2) (Zhang et al., 2002). В белках Hfq было обнаружено наличие консервативного мотива Sm1, характерного для Sm белков эукариот, и, таким образом, выявлена гомология между бактериальными белками Hfq и эукариотическими Sm-подобными и Sm белками (рис. 2) (Mller et al., 2002; Sledjeski et al., 2001). Последнее позволило предположить, что бактериальные белки Hfq и эукариотические Sm-подобные белки имеют общего предка (Sun et al., 2002).
Наиболее консервативной частью белков Hfq является мотив Sm2,
располагающийся на конце 4 и начале 5 тяжей, захватывающий короткую перетяжку между ними (рис. 2). Он включает в себя консенсус [Y/F]KHAI, который сохраняется практически во всех бактериальных белках. Аминокислотные остатки Sm2 мотива участвуют во взаимодействии белка с РНК (Schumacher et al., 2002), и, по всей вероятности, определяют четвертичную структуру белка (Moskaleva et al., 2010; Nikulin et al., 2005; Panja and Woodson, 2012; Sauter, 2003).
Поиск гомологов Hfq среди известных на 2002 г. геномов бактерий давал положительные результаты только для примерно половины из них (Sun et al., 2002). Поскольку гомологи белка не были найдены в некоторых протеобактериях и грамположительных бактериях, возникло предположение, что для отдельных ветвей эволюции ген белка был потерян (Sun et al., 2002). Однако позже, благодаря применению более совершенных алгоритмов поиска гомологов в сочетании с использованием аминокислотных паттернов, ортологи белка Hfq были обнаружены ещё в ряде геномов, в которых ранее они не были идентифицированы (Valentin-Hansen and Eriksen, 2004). Эти данные позволили заключить, что белки Hfq распространены значительно шире, чем предполагалось ранее, и что они могут иметь значительные вариации по первичной структуре.
Одним из ярких примеров отдаленных ортологов Hfq являются белки из цианобактерий Synechocystis sp. PCC 6803 и Anabaena PCC 7120, которые были выделены в новую группу белков Hfq (Boggild et al., 2009). У представителей этой группы обнаружено 65% сходство по первичной структуре при 30% идентичности аминокислотных остатков между собой. Выделение их в отдельную группу подтверждается при сравнении с другими белками Hfq (рис. 2). В частности, консервативная область Sm2 мотива у белков из цианобактерий отличается от консенсуса [Y/F]KHAI и заменена на последовательность RLAAI в белке из Synechocystis или на WKQAI в белке из Anabaena (Boggild et al., 2009). Отличия в первичной структуре привели к тому, что белки Hfq из Synechocystis sp. PCC 6803 и Anabaena PCC 7120 имеют намного меньшее сродство к РНК, по сравнению с белком Hfq из E.coli. Они не могут регулировать экспрессию генов в клетках E.coli in vivo (Boggild et al., 2009), однако нокаут гена hfq в Synechocystis приводит к потере подвижности клеток и значительно снижает уровень синтеза мРНК ряда генов (Dienst et al., 2008).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
На N-конце мономера белка находится -спираль (для белка Hfq из E.coli – остатки с 7 по 18), которая присутствует во всех Sm/Lsm белках, но не относится к Sm фолду. В гексамере -спираль каждого мономера располагается на одной стороне тора и прикрывает межсубъединичный интерфейс от растворителя (Tsui et al., 1994). Эта сторона гексамера называется проксимальной, а противоположная – дистальной. Вместе с N-концевой -спиралью -тяжи Sm фолда образуют коровую часть белка Hfq (остатки 7– 66), которая наиболее консервативна среди всех известных белков Hfq (рис. 2) (Brennan and Link, 2007; Sauter, 2003). Располагающаяся далее С-концевая часть белка имеет длину от 7 (в Bacillus subtilus) до 36 (в E.coli) преимущественно положительно заряженных остатков и не обладает выраженной гомологией среди известных последовательностей (рис. 2).
Относительно функциональности белка Hfq из E.coli, лишенного С-концевой области, имеются противоречивые данные. С одной стороны показано, что укороченный с С-конца до 65 остатков белок из E.coli способен связывать некодирующие РНК и даже способствовать изменению их вторичных структур, однако не способен связывать мРНК и осуществлять регуляцию экспрессии ряда генов in vivo, включая авторегуляцию экспрессии гена hfq (Vecerek et al., 2008). С другой стороны приводятся данные о наличии негативного и позитивного контроля регуляции экспрессии ряда генов укороченными с С-конца до 65, 66, 69 и 72 остатков белка Hfq из E.coli in vivo (Olsen et al., 2010). Тем не менее, обе группы авторов согласны с тем, что укороченные варианты белка способны связываться с достаточно большим количеством различных молекул РНК, разногласия же возникают только лишь в отношении оценки сохранения способности к регуляции экспрессии ряда генов. Кроме того, известно много природных укороченных белков Hfq, которые представляют собой практически только коровую часть молекулы белка, однако успешно функционируют. К их числу можно отнести белки Hfq из Synechocystis sp. PCC 6803 и Anabaena PCC 7120 (Boggild et al., 2009), Aquifex aeolicus (Sittka et al., 2007), Listeria monocytogenes (Nielsen et al., 2010).
Олигомеризация через образование межсубъединичного -листа характерна не только для Sm-белков, но и для многих других. Различают следующие типы таких взаимодействий: расширение -листа, когда -тяж одного белка присоединяется к границе -листа другого белка, -тяжевые вставки, когда -тяж одного белка вставляется в -лист другого белка, и -тяжевой зипперинг, когда неструктурированные петли каждого из связывающихся белков контактируют друг с другом с образованием двутяжевого -листа или -зиппера. Анализ белковых комплексов, представленных в белковом банке данных, выявил, что олигомеризация через образование сквозного -тяжа играет важную роль в различных метаболических процессах (Remaut and Waksman, 2006).
Четвертичная структура архейных и эукариотических Lsm-белков и эукариотических Sm-белков похожа на бактериальную (Valentin-Hansen and Eriksen, 2004). Главное их отличие состоит в том, что бактериальные белки Hfq образуют только гексамеры, в то время как почти все архейные и эукариотические белки – гептамеры, сохранившие при этом тороидальную структуру. Однако имеются единичные примеры пентамеров и октамеров Sm-подобных белков (рис. 4). Объяснение такому разнообразию четвертичных структур при высокой схожести пространственных структур мономеров белка пока еще не приведено в исследованиях. Все Sm-подобные белки формируют аналогичные межсубъединичные контакты, что было трактовано как консервативность структур Sm-подобных белков в процессе эволюции (Valentin-Hansen and Eriksen, 2004). Рис. 4. Кристаллические структуры Sm-белков и Sm-подобных белков различной степени олигомеризации. (1) Пентамер Sm-подобного белка цианофага (Das et al., 2010), (2) гексамер белка Hfq Pseudomonas aeruginosa (Nikulin et al., 2005), (3) гептамер белка Sm1 Archaeoglobus fulgidus (Tr et al., 2001), (4) октамер Lsm3-белка Saccharomyces cerevisiae (Naidoo et al., 2008).
В отличие от гомогептамерных Lsm-белков, эукариотические Sm-белки образуют тороидальные гептамеры из 7 различных субъединиц и входят в состав сплайсосомы (рис. 5). Эукариотические Sm-белки и Sm-подобные белки в растворе существуют в виде мономеров или димеров, формируя гептамеры в присутствии РНК (Kambach et al., 1999a, 1999b; Pomeranz Krummel et al., 2009). Рис. 5. Кристаллические структуры коровой части и полной U1-частицы человека.
Коровая часть U1 мяРНП частицы (малой ядерной рибонуклеопротеиновой частицы). Обозначены Sm-белки B, D1, D2, F, E, G и D3. Sm-сайт мяРНК представлен 7 нуклеотидами в центральной поре гептамера белков. Показан фрагмент экспериментальной карты электронной плотности (контур по 1). (2) Модель полной U1 мяРНП частицы. Голубым показана коровая часть U1 мяРНП частицы. Обозначены белки U1A (зеленого цвета), U1-70k (оранжевого цвета), U1C (красного цвета) и U1 мяРНК (сиреневого цвета) с петлями SL2, SL3 и SL4 (Pomeranz Krummel et al., 2009)
Белок AF-Sm2 может быть гексамером и гептамером Исследования архейных Sm-белков показали, что белок Sm2 из Archaeoglobus fulgidus (AF-Sm2) – единственный на данный момент белок, который может существовать как в гексамерной, так и в гептамерной формах в зависимости от состава буферного раствора (Achsel et al., 2001; Tr et al., 2002). Было предположено, что такое свойство белка AF-Sm2 можно объяснить взаимодействием остатков Glu19 и Glu23 (рис. 6) на поверхностях смежных мономеров (Tr et al., 2002). На расстоянии 4 от них находится еще один остаток глутаминовой кислоты – Glu47 (рис. 6), который также может влиять на степень олигомеризации белка AF-Sm2 (Kilic et al., 2006) (рис. 7).
Выделение белка Hfq дикого типа и его мутантных форм
При определении температур плавления белков Hfq методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии использовались низкие значения рН для сдвига пика теплоемкости в более низкие температуры, а также для блокирования процесса агрегации. Сдвиг теплоемкости в более низкие температурные значения был необходим, так как белок PaeHfq обладает температурой плавления при нейтральных рН, выходящей за рабочий диапазон прибора (до 120С), а для анализа кривых необходимо видеть второй склон пика полностью. Измерения ДСК были проведены в сотрудничестве с В.В. Филимоновым (Группа термодинамики белка, Институт белка).
Изменение теплоемкости для мутантных белков N28A, D40A, H57A, Q8A, Y55A PaeHfq и белка дикого типа приведено на Рис. 39. Белок с заменой YKHA/RGDT не исследовался методом ДСК, так как склонен к образованию агрегатов. При рН=3,0 высота пиков теплоемкости для мутантных белков Y55A и H57A PaeHfq находится в пределах шума, поэтому температуры плавления этих белков не могут быть хорошо интерпретированы. Высота пика теплоемкости для белка Y55A PaeHfq мала, так как этот белок при низких значениях рН (рН 3,0) находится в полностью или частично расплавленном состоянии.
Для остальных белков была посчитана площадь под кривой, соответствующая энтальпии плавления, а также удельная теплоемкость плавления. Кроме того, было показано, что плавление всех мутантных белков является обратимым и что пик теплоемкости не смещается с изменением концентрации белка. Последнее может говорить о том, что в пике плавится мономер, так как только положение пика теплоемкости плавления мономера может не зависеть от концентрации белка.
Кривые плавления белков PaeHfq при рН=3,0. Высота пиков теплоемкости для мутантных белков Y55A и H57A PaeHfq находится в пределах шума, поэтому температуры плавления этих белков не могут быть интерпретированы.
Полученные кривые зависимости теплоемкости от температуры были аппроксимированы двумя моделями (В.В. Филимонов, персональное сообщение). Первая модель была без учета процесса диссоциации – плавление мономера, вторая модель -плавление димера, с учетом диссоциации до мономеров (Рис. 40). Как видно из рисунка, вторая модель лучше соответствует экспериментальны данным. Рис. 40. Аппроксимация зависимости теплоемкости белка PaeHfq дикого типа (рН=2,0) двумя разными моделями плавления белка. Первая модель (красная пунктирная линия) соответствует равновесному плавлению мономера белка. Вторая модель (голубая пунктирная линия) соответствует модели плавления димера белка с учетом диссоциации димера до мономеров.
Удельная теплоемкость, рассчитанная из пика для мономера белка с молекулярной массой 9 кДа, составляла порядка 35 Дж/г. Для хорошо свернутых белков размера порядка 10 кДа удельная теплоемкость должна быть равна примерно 50 Дж/г. Такая разница между теоретическим и измеренным значениями удельной теплоемкости обычно говорит о частично неупорядоченном состоянии белка. Белок Hfq из P. aeruginosa имеет длинную неупорядоченную C-концевую часть, которая составляет около 15 аминокислот или 20% от всех аминокислотных остатков белка. Кроме того, из структуры гексамера видно, что N-концевая -спираль одного мономера формирует гидрофобные контакты с поверхностью соседнего мономера белка. Поэтому мы предполагаем, что N-концевая -спираль принимает развернутое состояние при диссоциации гексамера до мономеров, что также вносит вклад в снижение удельной теплоемкости основного пика плавления белка. При проведении анализа методом ДСК белка Y55A PaeHfq при рН=7,0 получен график зависимости теплоемкости от температуры, содержащий несколько пиков (Рис. 41), что должно соответствовать наличию ряда олигомеров белка в растворе. Скорее всего, данная замена затронула гидрофобное ядро белка и привела к появлению на поверхности белка новой гидрофобной области, которая способствует процессу его олигомеризации.
Зависимость теплоемкости белка Hfq Y55A от температуры при нейтральных рН (рН=7,0). Видны достаточно острые пики теплоемкости (обозначены стрелками), соответствующих плавлению устойчивых олигомерных состояний белка. Пики в конце кривой плавления соответствуют неупорядоченной агрегации.
Влияние произведенных замен на олигомерное состояние белка Hfq Влияние произведенных замен на степень олигомеризации белка Hfq оценивалось тремя методами – электрофорезом в “полунативных” условиях (semi-native electrophoresis), электрофорезом в неденатурирующих условиях (при рН=4,5) и гель-фильтрацией.
Электрофорез в “полунативных” условиях производился с добавлением 0,5% процентного ДСН к образцу непосредственно перед нанесением образца на гель, нанесение осуществлялось без предварительного прогрева препарата. Ранее этим методом оценивалось влияние замен некоторых аминокислотных остатков в межсубъединичной области для белка Hfq из E.coli на степень диссоциации олигомеров белка (Рис. 42) (Panja and Woodson, 2012). Считается, что в данных условиях разворачивание белка не происходит, однако фиксируется равновесное олигомерное состояние белка в растворе.
Для оценки влияния произведенных нами мутаций в белке Hfq из P. aeruginosa на степень его олигомеризации, мы повторили условия “полунативного” электрофореза (Рис. 43). Оказалось, что замена N28A не повлияла на степень олигомеризации белка Hfq, а замены H57A, Q8A, Y55A, YKHA/RGDT привели к полной диссоциации олигомеров до димеров и мономеров. Мутация D40A заблокировала образование мультимеров в растворе. Кроме того, на полученной электрофореграмме видно, что во многих случаях имеется полоса, соответствующая димерам белка, которой нет на электрофореграмме для белков Hfq из E.coli (Рис. 42).
Рис. 42. Электрофорез в “полунативных” условиях мутантных форм белка Hfq из E.coli (Panja and Woodson, 2012). Приведена дорожка маркера молекулярных весов (М) и оценка степени олигомеризации белка. Отмечены дорожки, соответствующие белку дикого типа и белкам с соответствующими заменами. Для белка дикого типа и белка с заменой Y25D наблюдается мультимерная, гексамерная и мономерная степени олигомеризации. Замены Q8A, Y55A и K56A приводят к диссоциации до мономеров, замена R16A - к диссоциации мультимеров до гексамеров. Рис. 43. Электрофорез в “полунативных” условиях мутантных форм белка Hfq из P. aeruginosa. Приведена оценка степени олигомеризации белка. Отмечены дорожки, соответствующие белку дикого типа и белкам с соответствующими заменами. Замена N28A не повлияла на степень диссоциации белка. Замена D40A привела к блокированию образования мультимеров. Остальные замены привели к диссоциации гексамеров и мультимеров до димерного/мономерного состояния.
Электрофорез в неденатурирующих условиях проводили при рН=4,5, поскольку белок Hfq из P. aeruginosa имеет рК=9,5 (Рис. 44). При данных условиях мономеры детектируются только для белка с заменой Y55A, который, как уже было указано ранее, в кислых условиях находится в развернутом состоянии.
Электрофорез в неденатурирующих (рН=4,5) условиях мутантных форм белка Hfq из P. aeruginosa. Приведена оценка степени олигомеризации белка. Отмечены дорожки, соответствующие белку дикого типа и белкам с соответствующими заменами. Белок дикого типа формирует преимущественно гексамеры. Белок с заменой YKHA/RGDT формирует только мультимеры. Белок Hfq Y55A находится в развернутом состоянии, о чем говорит и характер дорожки. Остальные белки формируют гексамеры.
Гель-фильтрацией нами показано, что фракция мономеров формируется только при определенных условиях, в остальных случаях преимущественно формируются гексамеры (Рис. 45). Так, для Q8A PaeHfq значительная фракция белка находится в мономерном состоянии при рН=6,5, однако при сдвиге рН до 8,0 для него ни мультимерная, ни мономерная фракции не выявляются.
Рис. 45. Хроматограммы белков Hfq с заменами Q8A и N28A получены с использованием колонки с носителем Superdex 75. (1) При рН=6,5 для белка с заменой Q8A помимо гексамерной фракции детектируется присутствие мультимеров и мономеров. (2) При рН=8,0 ни мультимерной, ни мономерной фракций выявлено не было.
Для остальных исследуемых белков PaeHfq также был проведен анализ их олигомерного состояния методом гель-фильтрации. Для разделения возможных устойчивых высокомолекулярных агрегатных состояний была использована колонка с носителем Superdex 200, диапазон разрешения которой подходит для белков с молекулярными массами от 250 кДа до 5 кДа. При этом только для белка дикого типа была выявлена фракция, которая может соответствовать мономерной форме белка (Рис. 46). Молекулярная масса устойчивого агрегатного состояния белка Hfq с заменой YKHA/RGDT не была определена, так как соответствующий этому белку пик располагался за пределами разрешения колонки.
Использование метода термофлуоресцентного анализа для поиска условий кристаллизации мутантных форм белка Y55A, D40A и YKHA/RGDT PaeHfq.
Новый специфический сайт связывания урациловых оснований с Hfq ранее не был обнаружен в структурах комплексов бактериальных белков Hfq с уридин-богатыми олигоРНК. Близкий аналог этого типа связывания был найден в структуре комплекса белка Sm1 из Pyrococcus abyssi с U7 РНК (Thore et al., 2003). В этом комплексе основания образуют стэкинг не с высококонсервативным для бактериальных белков остатком Phe39, а с остатком Tyr34. При этом формируется сайт связывания, перевернутый относительно латерального сайта связывания бактериальных белков Hfq почти на 180. Несмотря на низкую гомологию с латеральными сайтами связывания РНК бактериальных белков, наличие подобного сайта в архейных гомологах Hfq говорит о функциональной значимости данного места связывания РНК.
Модель связывания белка Hfq с РНК
На основании полученных нами данных по локализации рибонуклеотидов на поверхности белка исходная модель связывания РНК с белком была дополнена (Рис. 69). Нами в модель были добавлены латеральные сайты связывания РНК, а также дополнена возможность связывания цитозиновых оснований в проксимальном и дистальном сайтах.
Сравнение исходной модели связывания РНК на поверхности Hfq (1) и модели, дополненной новыми данными (2). Нами было обнаружено, что в R-сайте связывания адениновых оснований могут связываться цитозиновые основания, также как и в проксимальных сайтах связывания на месте урациловых оснований. Кроме того, был добавлен латеральный сайт связывания уридинов.
Известно, что многие регуляторные РНК, с которыми взаимодействует Hfq, имеют в составе уридиновые последовательности как на 3, так и на 5 конце. Исходя из особенностей связывающихся с белком РНК и анализа мутантных форм белка EcoHfq, была предложена следующая модель взаимодействия малых регуляторных мрРНК на проксимальной стороне тороида (Sauer et al., 2012) (Рис. 70-1). Предполагается, что сначала с белком связывается У-богатая последовательность 3 конца мрРНК в проксимальном сайте Hfq, затем происходит формирование связей между У-богатой последовательностью 5 конца мрРНК с латеральным сайтом связывания на белке. Именно урацилы, формирующие контакты с латеральным сайтом связывания, могут быть ответственны за спаривание с А-последовательностями матричных РНК (Sauer et al., 2012). После нашей работы удалось детализировать исходную модель и утверждать, что на 3 конце мрРНК должны располагаться последовательно не менее чем 4-5 уридинов, часть из которых может быть заменена на цитозины, а на 5 конце мрРНК должна быть последовательность, содержащие уридины в каждом 4-5 положении для взаимодействия с латеральными сайтамиHfq (Рис. 70-2).
Предполагаемая модель положения малых регуляторных РНК на поверхности белка Hfq. (1) Исходная модель на основании данных мутагенеза (Sauer et al., 2012). (2) Детализированная на основе полученных нами структурных данных по локализации УТФ на поверхности белка Hfq модель связывания мрРНК. Для связывания с белком мрРНК должна иметь на 3 конце 4-5 последовательно расположенных уридина, часть из которых может быть замещена на цитидины, а на 5 конце через каждые 3-4 нуклеотида должен быть строго расположен уридин.
Следует сказать, что предложенная нами методика локализации нуклеотидов на поверхности белка оказалась более информативной по сравнению с другими подходами по локализации РНК-связывающих сайтов на поверхности белка Hfq. Наш подход позволяет определить не только расположение сайта взаимодействия белка с одноцепочечной РНК, но и структуру сайта, положение в нем основания нуклеотида, проанализировать специфичность сайта связывания к различным основаниям. Данный подход позволил показать, что Hfq не является АТФазой, как было предположено после работ, выполненных методами мутагенеза и молекулярного докинга (Arluison et al., 2007; Lazar et al., 2010) и определить структурные детали взаимодействия РНК в новом сайте связывания. Этот метод проще, чем SELEX (Someya et al., 2012), позволяющий целенаправленно искать высокоспецифичную к белку последовательность РНК, и не требует получения большого количества мутантных форм белка с заменами для локализации участка связывания на белке (Hmmerle et al., 2012).
В представленной работе изучались стабильность и РНК-связывающие свойства белка Hfq из Pseudomonas aeruginosa. Оказалось, что белок из мезофильной бактерии обладает экстремальной термостабильностью и начинает плавиться при температуре выше 115С. Так как белок существует в виде гексамеров в растворе и кристаллах было предположено, что именно гексамерная структура белка определяет его термостабильность. Однако данное предположение не подтвердилось. Такими методами как мутагенез, гель-фильтрация, электрофорез в “полунативных” условиях, дифференциальная сканирующая микрокалориметрия и измерение спектров кругового дихроизма в дальней ультрафиолетовой области было показано, что самой стабильной единицей белка является мономер. Можно предположить, что при диссоциации гексамера -спираль разворачивается, а гидрофобные области -листов соседних мономеров перераспределяются в пространстве, формируя -бочонок. Эта модель хорошо соотносится со структурой эукариотического ортолога белка Hfq – белка LSm15 из Drosophila melanogaster (Tritschler et al., 2008), который формирует мономеры как в растворе, так и в кристаллах. В структуре LSm15 нет -спирали, а -тяже формируют -бочонок. Полученные нами данные по термостабильности белка Hfq могут быть использованы для повышения стабильности белков, имеющие супервторичную структуру в виде Sm-фолда или близких ему по структуре OB и SH3 фолдов.
В процессе исследования РНК-связывающих свойств белка Hfq было опровергнуто предположение, что он обладает АТФазной активностью. Предложен новый подход к локализации сайтов связывания малых регуляторных и матричных РНК на поверхности белка Hfq. Также была определена специфичность белка Hfq к связыванию последовательности РНК, показано, что он не связывает гуаниновые основания и, следовательно, не способен связывать РНК, содержащие в своем составе протяженные гуаниновые последовательности. Было впервые кристаллографически показано наличие латерального сайта связывания урациловых оснований, а также способность белка Hfq связывать цитозиновые основания. Данный подход может оказаться полезным для локализации одноцепочечных участков РНК или ДНК на поверхности других белков, связывающих нуклеиновые кислоты.
