Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. CLASS Роль P.aeruginosa в инфекционной патологии человек CLASS а 11
Глава 2. Основные факторы патогенности и антигенные структуры синегнойной палочки 20
Глава 3. Перспективы разработки генно-инженерных вакцин против бактериальных инфекций 31
Собственные исследования 43
Глава 4. Материалы и методы 43
4.1. Материалы 43
4.1.1. Использованные штаммы 43
4.1.2. Экспериментальные животные 43
4.1.3. Протеины и сыворотки 43
4.1.4. Оборудование 44
4.1.5. Реактивы 44
4.2. Методы 46
4.2.1. Выделение геномной ДНК P.aeruginosa 46
4.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 46
4.2.3. Трансформация клеток E.coli 47
4.2.4. Выделение плазмидной ДНК (микровариант) 49
4.2.5. Определение нуклеотидной последовательности 50
4.2.6. Электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли...53
4.2.7. Иммуноблоттинг і 54
4.2.8. Иммуноферментный анализ (ИФА) 55
4.2.9. Получение иммунных сывороток 56
4.2.10. Статистические методы 57
Глава 5. Получение рекомбинантного белка наружной мембраны OprF P.aeruginosa 58
5.1. Клонирование гена рекомбинантного белка OprF 58
5.2. Получение рекомбинантного белка OprF 63
5.3. Характеристика специфичности полученного рекомбинантного белка OprF 66
Глава 6. Изучение иммунобиологических свойств рекомбинантного белка OprF 69
6.1. Изучение антигенных свойств рекомбинантного белка OprF 69
6.2. Изучение токсичности рекомбинантного белка OprF 73
6.3. Изучение протективных свойств рекомбинантного белка OprF..76
Глава 7. Изучение свойств иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку OprF P.aeruginosa 78
7.1. Исследование превентивных свойств иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку OprF 78
7.2. Изучение антибактериальных свойств иммунных сывороток к рекомбинантному белку OprF 80
7.3. Оценка внутривидовой специфичности полученных иммунных сывороток к рекомбинантному белку OprF 82
Заключение 84
Выводы 93
Список литературы 94
- Выделение геномной ДНК P.aeruginosa
- Клонирование гена рекомбинантного белка OprF
- Изучение антигенных свойств рекомбинантного белка OprF
- Исследование превентивных свойств иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку OprF
Введение к работе
Актуальность проблемы. Синегнойная палочка {Pseudomonas aeruginosa) в настоящее время продолжает оставаться одним из основных возбудителей гнойно-септических заболеваний и осложнений в условиях стационара. В России она занимает второе место после кишечной палочки среди микроорганизмов, вызывающих госпитальные инфекции в отделениях интенсивной терапии и реанимации [27, 35, 50, 66]. P.aeruginosa также является причиной развития пневмоний, поражений мочеполовой системы у урологических больных, часто встречается у больных с ожогами, вызывает 20-25% гнойных хирургических инфекций и первичных грамотрицательных бактериемии [8, 14, 36, 41].
С одной стороны, частота развития синегнойной инфекции связана с увеличением количества больных с признаками вторичных иммунодефицитов, развивающихся в результате экологического неблагополучия, хирургических вмешательств, диагностических манипуляций, обширных термических и лучевых поражений, травм, онкологических процессов, родов, а также нерационального использования антибиотиков [27, 35]. С другой стороны, синегнойная палочка отличается высоким уровнем передающейся с плазмидами резистентности к антибактериальным и химиотерапевтическим препаратам, антисептикам и дезинфектантам. Эти обстоятельства обуславливают актуальность разработок препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний, вызываемых P.aeruginosa [50, 66].
Активная иммунизация может быть одним из эффективных средств защиты против условно патогенных микроорганизмов и, в частности, P.aeruginosa. Для индукции противосинегнойного иммунитета в нашей стране разрабатывались препараты на основе инактивированных бактерий, их компонентов и экзопродуктов: поливалентная синегнойная корпускулярная вакцина [45, 47], пиоиммуноген [55, 58], псевдомонас-
вакцина [6, 17, 18, 19, 58, 59, 61, 70], а также препараты на основе экзотоксина А P.aeruginosa — анатоксин синегнойной палочки [25, 28, 33, 34]. По разным причинам в настоящее время для использования в клинической практике не зарегистрировано ни одного препарата, предназначенного для иммунопрофилактики и иммунотерапии синегнойных инфекций.
Трудности создания эффективных иммунопрепаратов против синегнойной палочки заключаются в том, что патогенез развивающихся с ее участием инфекций обусловлен воздействием целого ряда факторов патогенности, среди которых выделить наиболее значимый для разработки вакцинных препаратов представляется сложной задачей.
Известно, что на первом этапе инфекционного процесса, когда происходит инвазия возбудителя в ткани хозяина, важную патогенетическую роль играют поверхностные антигены бактериальной клетки, имеющие исключительное значение в стимуляции врожденного и адаптивного иммунитета [59, 82].
Современные лабораторные методики позволяют выделить и исследовать иммунобиологические свойства большого спектра антигенов имеющихся в структуре P.aeruginosa. При том, особое внимание уделяется поверхностным антигенам и экзотоксинам. В настоящее время зарубежными и российскими исследователями иммунологически охарактеризовано большинство белковых компонентов клеточной стенки P.aeruginosa [59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 98, 107, 108].
Установлено, что некоторые из них индуцировали иммунный ответ и обладали протективной активностью против бактериемии, вызываемой P.aeruginosa у пациентов ожоговых стационаров [122, 132, 133, 134].
Особый интерес представляет белок F наружной мембраны (OprF -outer membrane protein F), участвующий в формировании пор микроорганизма. Его аминокислотная последовательность является высококонсервативной для представителей рода Pseudomonas (P.fluorescens,
P.alcaligenes, P.putida и др.). Это обстоятельство обуславливает целесообразность изучения иммунобиологических свойств белка OprF для создания вакцины широкого спектра действия против различных видов Psendomonas [59, 60, 63, 157].
При использовании традиционных методов, когда для создания вакцин из бактериальной клетки необходимо выделить протективные антигены, возникает ряд проблем. Во-первых, процентное отношение протективных антигенов в составе клетки микроорганизма незначительно, и поэтому при культивировании необходимы большие объемы биомассы, а также необходимы многостадийные методики очистки и концентрирования, что обуславливает высокие производственные затраты. Во-вторых, не гарантировано полное отсутствие примесей обеспечивающих неблагоприятные реакции организма.
В последнее время при создании вакцинных препаратов все большое внимание уделяется использованию генно-инженерных методов, суть которых заключается во встраивании генов, отвечающих за синтез протективных антигенов в возбудителях, в геном непатогенной бактерии (например, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae и др.) [154]. Во время культивирования полученных продуцентов, в большом количестве синтезируется протективный антиген, который подвергается простой очистке и может использоваться для приготовления вакцины. Такая стратегия позволяет вычленить и использовать наиболее иммуногенные компоненты бактерии, а при производстве вакцин исключает контакт сотрудников с культурами патогенных микроорганизмов, что является существенным технологическим преимуществом, обеспечивающим безопасность персонала.
Впервые возможность стимуляции иммунных реакций у животных с использованием отдельных генно-инженерных белковых доменов поверхностного белка VP1 вируса ящура была продемонстрирована в 1982 году [91], затем в 1984 году описана индукция защитных реакций в
организме мышей при использовании рекомбинантного полноразмерного белка gD вируса простого герпеса [130]. В последние годы для вакцинации населения против вирусного гепатита В применяются препараты на основе дрожжевых рекомбинантных белков (например «Энджерикс В») [162, 147].
При создании генно-инженерных вакцин обязательным условием является наличие достоверной информации об иммуногенности определенных белков и кодирующих их нуклеотидных последовательностях [106]. Как уже отмечено выше, были исследованы иммунобиологические свойства большого спектра выделенных антигенов, имеющихся в структуре P.aeruginosa. Кроме того, геном (6,26 млн. нуклеотидных пар) данного микроорганизма (штамм РА01) полностью отсеквенирован и представлен в базе данных GenBank (Accession Number АЕ004091). Поэтому в настоящее время зарубежными исследователями проводятся работы по созданию вакцин с использованием генов белков наружной мембраны P.aeruginosa. Изучение таких препаратов показало их высокую иммуногенность и безвредность [98, 129, 137]. При этом, используют как полные аминокислотные последовательности, так и отдельные пептиды.
Цель работы: Получение рекомбинантного белка, F наружной мембраны (OprF) P.aeruginosa и изучение его иммунобиологических свойств.
Задачи исследования:
Выделить геномную ДНК P. aeruginosa, амплифицировать ген белка OprF с помощью ПЦР, встроить его в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках E.coli и получить бактериальный продуцент рекомбинантного белка.
Наработать и хроматографически очистить рекомбинантный белок OprF. г
Изучить иммунобиологические свойства рекомбинантного белка OprF P.aeruginosa.
Получить иммунные сыворотки и изучить их превентивные свойства.
Научная новизна и теоретическая значимость
Получен непатогенный бактериальный продуцент E.coli, характеризующийся гиперэкспрессией рекомбинантного белка F наружной мембраны P.aeruginosa (около 30% от содержания общего клеточного белка).
Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка OprF содержала дополнительных 6 гистидиновых оснований, необходимых для ионно—афинной хроматографии на Ni-агарозном сорбенте, что позволило выделить высокоочищенный препарат.
Очищенный рекомбинантный белок OprF в реакции ИФА проявлял высокое специфическое взаимодействие с различными иммунными сыворотками, содержащими антитела к штаммам P.aeruginosa по классификации Fisher-Devlin.
Иммунизация очищенным рекомбинантным белком OprF стимулировала у животных выработку специфических антител, а полученные к нему иммунные кроличьи сыворотки обладали протективными свойствами.
Выявлена перекрестная активность иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку OprF на моделях торможения роста культур P.aeruginosa различных серовариантов по классификации Habs.
Практическая значимость
Созданный штамм-продуцент E.coli может быть использован в качестве производственного в технологии получения рекомбинантного белка F наружной мембраны P.aeruginosa при разработке вакцины против синегнойной инфекции.
Отсутствие патогенных свойств у полученного штамма, а также простота методики выделения белкового продукта гарантируют безопасность и технологичность производственного процесса.
Основные положения, выносимые на защиту:
Сконструированный штамм-продуцент E.coli Ml 5 pQE-30/oprF характеризуется высоким выходом целевого продукта (30% от содержания общего клеточного белка), а разработанные технологические приемы получения и очистки рекомбинантного белка позволяют нарабатывать его в количествах, требуемых для биологического тестирования.
Полученный рекомбинантный белок OprF внешней мембраны P.aeruginosa нетоксичен, обладает антигенными и протективными свойствами.
Присутствие антител к рекомбинантному белку OprF в сыворотках кроликов после иммунизации культурами штаммов P.aeruginosa, относящихся к различным серовариантам, подтверждает его специфичность для рода Pseudomonas.
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Выделение геномной ДНК P.aeruginosa
Осажденную при 6000 об/мин в течение 2 минут в центрифужной пробирке биомассу, которую получали после 14-16 часов культивирования, растворяли в воде с добавлением Tris-HCl буферного раствора, рН 8,0 (до концентрации 10 тМ) и 10% саркозила (до 0,5%). После чего, добавляли протеиназу К до концентрации 10-20 мкг в мл и инкубировали 1 час при +50С, с перемешиванием. Раствор после инкубации становился прозрачным.
ДНК из водной фазы выделяли методом фенольной экстракции [26].
Супернатант переносили в чистые пробирки и осаждали ДНК из раствора, добавлением 2,5 объема этанола и 1/10 объема ацетата натрия. Пробирку инкубировали при температуре -70С 15-20 минут и затем центрифугировали 10 минут при 13000 об/мин, удаляли супернатант и тщательно промывали осадок 70% спиртом [26]. После промывки осадок высушивали на воздухе. Далее его растворяли в воде, добавляли РНКазу до концентрации 5-10 мкг/мл и инкубировали 30 минут в термостате с температурой +37С.
Для приготовления реакционной смеси использовали десятикратный буфер следующего состава: 15 тМ MgCl2; 0,5 М КС1; 0,1 М Tris-HCl, рН 9,0; 1% Triton Х-100. На 50 мкл смеси использовали 1-5 ед. Taq-полимеразы (Fermentas GeneRulerTM), по 1 мкл прямого и обратного праймера (концентрация 12,5 пМ /мкл); 1 мкл геномной ДНК P.aeruginosa (концентрация 0,05 мкг/мкл); 2 мкл смеси dNTP (концентрация 10 мМ/мкл, Promega). После добавления всех компонентов в пробирку вносили 30-50 мкл минерального масла (Хеликон) и осаждали содержимое с помощью микроцентрифуги. Постановку реакций проводили в амплификаторе «Терцик» по программе:
Предварительный нагрев — +94С — 2 минуты
s_ 35 циклов
Денатурация +94С — 1 минута
Отжиг +65 С — 1 минута
Элонгация +72С — 1 минута
Образцы ДНК наносили на 1% агарозный гель и проводили электрофорез при использовании ТАЕ-буфера [26].
После проведения электрофореза просматривали гель в УФ свете на трансиллюминаторе и определяли размер продуктов амплификации, сравнивая их с маркерными фрагментами (Fermentas) - GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder.
4.2.3. Трансформация клеток E.coli
При клонировании и получении продуцентов рекомбинантньгх белков использовали культуру клеток E.coli штамма Ml5, которую выращивали в среде LB или на плотной питательной среде. При приготовлении твердой питательной среды добавляли 15 г сухого агара на 1 литр раствора с добавлением антибиотиков. В качестве "стоковых" растворов использовали водные растворы ампицилина, приготовленные из расчета - 100 мг/мл и канамицина — 25-50 мг/мл. Рабочие концентрации ампицилина и канамицина составляли - 100-200 мкг/мл и 50 мкг/мл, соответственно.
Приготовление компетентных клеток.
Для приготовления компетентных клеток культуру E.coli рассеивали штрихом на чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей канамицин и выращивали 14-16 часов при температуре +37С. С целью получения посевного материала отбирали изолированные колонии. Для этого пересевали бактериальные клетки в пробирку с 3-5 мл LB среды с канамицином. Выращивание осуществляли в течение 12-14 часов в термостатируемом шейкере при температуре +37С с интенсивностью перемешивания 180 об/мин.
Через 14-16 часов к 100 мл свежей LB-среды добавляли 1 мл посевного материала и по 1 мл 1 М MgS04 и 1 М MgCl2. Затем выращивали в термостатируемом шейкере при перемешивании со скоростью 190 об/мин и температуре +37С около двух часов (до оптической плотности 0,6 - 1). Среду с культурой переносили в стерильные центрифужные пробирки объемом 50 мл и инкубировали во льду 15 минут. Охлажденную биомассуч осаждали центрифугированием 10 минут при 3000 об/мин при температуре +4С.
Супернатант сливали. К осажденной биомассе добавляли 12 мл (1/3 от исходного объема) раствора RF1 (0,1 М RbCl; 0,07 М МпС12; 0,07 М СН3СООК; 0,14 М СаС12; 0,55 М глицерин; рН 5,8), в котором осадок аккуратно растворяли !и инкубировали его во льду 15 минут. После инкубации пробирки центрифугировали при тех же условиях.
Супернатант удаляли, к осадку добавляли 3 мл раствора RF2 (0,01 М RbCl; 0,08 М СаС12; 0,68% MOPS; 0,55 М глицерин; рН 6,8), осторожно ресуспендировали бактериальные клетки и инкубировали во льду 15 минут.
Полученную суспензию клеток разливали в стерильные пробирки Eppendorf по 200 мкл и хранили при температуре -70С.
Трансформация компетентных клеток.
Клонирование гена рекомбинантного белка OprF
На основании анализа литературных данных для исследования выбран белок F наружной мембраны (OprF) P.aeruginosa.
Последовательность нуклеотидов, кодирующих данный белок, амплифицирована с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы использована геномная ДНК P.aeruginosa (штамм РА 103).
Геномную ДНК получали с помощью обработки протеиназой К бактериальной биомассы с последующим осаждением этанолом. Препарат ДНК высушивали, растворяли в воде и обрабатывали РНКазой. Концентрация геномной ДНК в полученном препарате составляла около 0,05 мкг/мкл.
Праймеры для ПЦР-амплификации ДНК подобраны с использованием базы данных GenBank (5 - AAG GAT CCA TGA AAC TGA AGA АСА CCT TAG - 3 и 5 - AAA AGC TTT TAC TTG GCT TCA GCT TCT AC - 3 ). Данные праймеры были специфичны к концевым нуклеотидам гена oprF и имели на 5 -концах (отмеченные подчеркиванием) дополнительные участки узнавания рестриктаз ВатН I и Hind III, что является необходимым условием для встраивания в полилинкер плазмиды pQE-30 (QIAGEN).
Для приготовления 50 мкл реакционной смеси использовали 1 мкл полученного препарата геномной ДНК. Концентрация MgCb в реакции составила 1,5 тМ, а количества всех остальных компонентов соответствовали общепринятым методам.
Температура денатурации (94С) и время (1 минута) соответствовали стандартной методике для ампификатора «Терцик». Температуру отжига праймеров подбирали эмпирически, используя диапазон от 55С до 70С. Температура и время элонгации соответствовали условиям работы фермента Taq-полимеразы. В результате наиболее оптимальной оказалась следующая программа, которая была использована для получения препаративных количеств ДНК:
При анализе продуктов амплификации в 1% агарозном геле идентифицирован ПЦР-амплификат, имеющий размер 1 kb (рис. 4, трек 3), что совпадало по массе с геном, кодирующим полную последовательность белка OprF, известных из литературных данных.
"Синтезированный, ПЦР-продукт очищали от минерального масла хлороформной экстракцией с последующим осаждением этанолом. Затем его обрабатывали ферментами рестрикции ВатН I и Hind III. Встраивание рестрикта проводили в полилинкер плазмиды pQE-30 (QIAGEN) по тем же сайтам рестрикции (ВатН I и Hind III). Используемая плазмида имела регуляторные участки для экспрессии клонированного гена в клетках E.coli (рис. 5). Встраивание осуществляли в реакции лигирования. При этом в объеме 30 мкл использовали 3 ед Т4-ДНК-лигазы, 0,05 мкг вектора и 0,5 мкг вставки. Реакцию проводили при температуре +7С в течение 14-24 часов.
Рисунок 4. Результаты ПЦР-амплификации последовательности нуклеотидов, кодирующих белок OprF и рестриктный анализ генно-инженерной конструкции pQE-30/oprF в 1% агарозном геле.
Треки: 1 - плазмидный вектор pQE-ЗО, обработанный рестриктазами ВатН I и Hind III; 2 - генно-инженерная конструкция для получения рекомбинантного белка OprF в клетках Е. coli (pQE-30/oprF), обработанная рестриктазами ВатН I и Hind III; 3 - результат ПЦР-амплификации гена oprF; 4 - ДНК-маркер молекулярной массы (GeneRuler 1 kb DNA Ladder, Fermentas). Стрелкой отмечены фрагменты размерами 1 kb и 3,5 kb.
Рисунок 5. Схема генно-инженерной конструкции для получения рекомбинантного белка OprF в клетках Е. coli pQE-30/oprF.
Отмечены: РТ5 - промоторный регион для экспрессии в прокариотических клетках фага Т5 E.coli; Lac О - /яс-опероны; RBS - сайт посадки рибосомы; ATG - ATG-кодон; 6xHis - последовательность, кодирующая шесть гистидинов; oprF - последовательность, кодирующая белок OprF; Poly(A)signal - участок для остановки транскрипции; Ampicillin - ген устойчивости к ампициллину; Col El - начало репликации; BamH I, Hind III - сайты рестрикции
Полученную лигазную смесь использовали для химической трансформации клеток E.coli штамма Ml5. Изолированные колонии с чашки после трансформации использовали для выращивания в минипрепаративных количествах. Первичный отбор клонов проводили с помощью электрофоретического анализа образцов плазмидной ДНК, выделенных из биомассы клонов и рестриктного анализа. При обработке рекомбинантных конструкций теми же ферментами рестрикции (ВатН I и Hind III), с использованием которых проводилось встраивание, получали продукт размером 1 kb (рис. 4, трек 2), совпадающий по размерам с исходным ПЦР-фрагментом. Более тяжелый продукт рестрикции (размером около 3,4 kb) соответствовал по размерам исходному вектору pQE-ЗО (рис. 4, трек 1).
Для определения аминокислотной последовательности проведено секвенирование клонированного рекомбинантного гена. Полученные результаты свидетельствовали о совпадении кодируемой аминокислотной последовательности (рис. 6) с референс-последовательностью из базы данных GenBank (Accession Number АЕ004091).
Изучение антигенных свойств рекомбинантного белка OprF
Для исследования иммунобиологических свойств полученный очищенный рекомбинантный белок OprF растворяли в фосфатно-солевом буфере и готовили ряд серийных разведений для введения мышам. Дозы для однократного введения содержали 33, 6,6 и 1,32 мкг.
Препараты сорбировали на гидроокиси алюминия в соотношении 1:3 и вводили внутрибрюшинно трехкратно в объеме 0,5 мл с интервалом в две недели трем группам животных. Через две недели после произведенной инъекции антигена получали пул сывороток от трех мышей из каждой группы.
Антигенные свойства белка тестировали в двух реакциях: в иммуноблоттинге и ИФА.
Сыворотки, полученные от иммунизированных мышей, в иммуноблоттинге четко реагировали с хроматографически очищенным рекомбинантным белком OprF (рис. 11, треки 1-9). Прослеживалась зависимость интенсивности окраски нитроцеллюлозной мембраны со связанным с ней рекомбинантным белком OprF от использованной дозы введенного препарата и количества иммунизации. Сыворотки неиммунизированных животных не реагировали с рекомбинантным белком OprF (рис. 11, трек 10).
Рисунок 11. Анализ в иммуноблоттинге наличия специфично реагирующих антител против рекомбинантного белка OprF: 1 — сывооотки мышей иммунизиоованных олнокоатно
При постановке ИФА использовали хроматографически очищенный рекомбинантный белок OprF, растворенный с помощью диализа в карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) с рН 9,4 в концентрации 10 мкг в мл, антитела к иммуноглобулинам мыши, меченные пероксидазои хрена (Сорбентсервис) в разведении 1:10000 и две контрольные сыворотки (интактная сыворотка и иммунная сыворотка мыши к цельной культуре P.aeruginosa (тт. 170015)).
Результаты анализа антигенной активности OprF в ИФА по определеным средним значениям титров антител в группах представлены на рис. 12.
Для исследования антигенных свойств рекомбинантного белка OprF и продолжительности создаваемого иммунного ответа проводили длительную иммунизацию (десять инъекций) кроликов породы «шиншилла» массой 2-2,5 кг. Четырем кроликам вводили подкожно препарат в дозе 330 мкг и четырем - 70 мкг. Интервал между иммунизациями составлял одну неделю.
Для изучения динамики накопления антител проводили пробные кровопускания через четыре, восемь, двенадцать, шестнадцать и двадцать недель после начала иммунизации и исследовали пулы сывороток в ИФА.
При постановке ИФА использовали коньюгат (антитела к иммуноглобулинам кролика, меченные пероксидазой хрена (НПО Биотестсистемы) в разведении 1:10000 и две контрольные сыворотки (интактную сыворотку и иммунную сыворотку кролика к цельной культуре P. aeruginosa (шт. 170015)).
На рис. 13 представлена динамика образования антител к рекомбинантному белку OprF. Полученные данные свидетельствовали о том, что иммунный ответ у животных на введение препарата в указанных дозах различался.
У кроликов иммунизированных дозой 330 мкг после Ш-го введения препарата средний титр антител возрастал до разведения 1:10700, после VII-го - до 1:11700, а через две недели после окончания иммунизации наблюдался пик активности пула сывороток (1:12900). На двадцатой неделе от начала иммунизации титр антител в сыворотках крови животных снижался до 1:2400.
Аналогичная динамика образования антител прослеживалась у кроликов, получавших препарат в дозе 70 мкг, однако процесс протекал медленнее и титры активности оказались значительно ниже: после Ш-й иммунизации выявлен титр антител в разведении сывороток - 1:500, после VII-й он увеличился до 1:2850, по окончанию иммунизации достиг значения 1:8400. В течение двух с половиной месяцев после последней инъекции происходило снижение титров антител до 1:325.
У животных обеих групп наблюдали схожую тенденцию изменения количества антител во времени. В течение всего цикла иммунизации уровни специфических антител возрастали, но с прекращением введения препарата снижались до исходных значений.
Таким образом, полученные данные свидетельствовали об антигенной активности рекомбинантного белка OprF выраженность которой зависела от дозы получаемого препарата.
Токсикологические исследования обязательны для оценки безопасности, установления характера и выраженности повреждающего действия создаваемого препарата на организм экспериментальных животных.
Изучена на мышах зависимость токсических эффектов от дозы препарата рекомбинантного белка OprF и вспомогательных веществ (буферные растворы и гидроокись алюминия)
Рекомбинантный белок OprF разводили в двух растворах: в ФСБ рН=6,5 и 50 мМ TRIS-HC1 рН=9,0, а затем сорбировали на гидроокиси алюминия (в соотношении 1:3) и вводили однократно внутрибрюшинно в дозах - 25, 50 и 100 мкг в 0,5 мл на одно животное. Численность каждой группы составила 10 особей.
Для оценки возможной токсичности гидроокиси алюминия мышам вводили 300 мкг этого препарата в физиологическом растворе. Контролем служила группа животных, получавших 0,5 мл физиологического раствора.
В течение 14 дней фиксировали общее состояние мышей, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, состояние волосяного покрова, потребление корма и воды, измеряли массу каждой особи. Результаты изменения массы тела в течение первых 7 дней наблюдения после инъекции представлены в табл. 7.
Исследование превентивных свойств иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку OprF
Для исследования иммунобиологических свойств полученный очищенный рекомбинантный белок OprF растворяли в фосфатно-солевом буфере и готовили ряд серийных разведений для введения мышам. Дозы для однократного введения содержали 33, 6,6 и 1,32 мкг.
Препараты сорбировали на гидроокиси алюминия в соотношении 1:3 и вводили внутрибрюшинно трехкратно в объеме 0,5 мл с интервалом в две недели трем группам животных. Через две недели после произведенной инъекции антигена получали пул сывороток от трех мышей из каждой группы.
Антигенные свойства белка тестировали в двух реакциях: в иммуноблоттинге и ИФА.
Сыворотки, полученные от иммунизированных мышей, в иммуноблоттинге четко реагировали с хроматографически очищенным рекомбинантным белком OprF (рис. 11, треки 1-9). Прослеживалась зависимость интенсивности окраски нитроцеллюлозной мембраны со связанным с ней рекомбинантным белком OprF от использованной дозы введенного препарата и количества иммунизации. Сыворотки неиммунизированных животных не реагировали с рекомбинантным белком OprF (рис. 11, трек 10).
Рисунок 11. Анализ в иммуноблоттинге наличия специфично реагирующих антител против рекомбинантного белка OprF: 1 — сывооотки мышей иммунизиоованных олнокоатно
При постановке ИФА использовали хроматографически очищенный рекомбинантный белок OprF, растворенный с помощью диализа в карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) с рН 9,4 в концентрации 10 мкг в мл, антитела к иммуноглобулинам мыши, меченные пероксидазои хрена (Сорбентсервис) в разведении 1:10000 и две контрольные сыворотки (интактная сыворотка и иммунная сыворотка мыши к цельной культуре P.aeruginosa (тт. 170015)).
Результаты анализа антигенной активности OprF в ИФА по определеным средним значениям титров антител в группах представлены на рис. 12.
Для исследования антигенных свойств рекомбинантного белка OprF и продолжительности создаваемого иммунного ответа проводили длительную иммунизацию (десять инъекций) кроликов породы «шиншилла» массой 2-2,5 кг. Четырем кроликам вводили подкожно препарат в дозе 330 мкг и четырем - 70 мкг. Интервал между иммунизациями составлял одну неделю.
Для изучения динамики накопления антител проводили пробные кровопускания через четыре, восемь, двенадцать, шестнадцать и двадцать недель после начала иммунизации и исследовали пулы сывороток в ИФА.
При постановке ИФА использовали коньюгат (антитела к иммуноглобулинам кролика, меченные пероксидазой хрена (НПО Биотестсистемы) в разведении 1:10000 и две контрольные сыворотки (интактную сыворотку и иммунную сыворотку кролика к цельной культуре P. aeruginosa (шт. 170015)).
На рис. 13 представлена динамика образования антител к рекомбинантному белку OprF. Полученные данные свидетельствовали о том, что иммунный ответ у животных на введение препарата в указанных дозах различался.
У кроликов иммунизированных дозой 330 мкг после Ш-го введения препарата средний титр антител возрастал до разведения 1:10700, после VII-го - до 1:11700, а через две недели после окончания иммунизации наблюдался пик активности пула сывороток (1:12900). На двадцатой неделе от начала иммунизации титр антител в сыворотках крови животных снижался до 1:2400.
Аналогичная динамика образования антител прослеживалась у кроликов, получавших препарат в дозе 70 мкг, однако процесс протекал медленнее и титры активности оказались значительно ниже: после Ш-й иммунизации выявлен титр антител в разведении сывороток - 1:500, после VII-й он увеличился до 1:2850, по окончанию иммунизации достиг значения 1:8400. В течение двух с половиной месяцев после последней инъекции происходило снижение титров антител до 1:325.
У животных обеих групп наблюдали схожую тенденцию изменения количества антител во времени. В течение всего цикла иммунизации уровни специфических антител возрастали, но с прекращением введения препарата снижались до исходных значений.
Таким образом, полученные данные свидетельствовали об антигенной активности рекомбинантного белка OprF выраженность которой зависела от дозы получаемого препарата.
Токсикологические исследования обязательны для оценки безопасности, установления характера и выраженности повреждающего действия создаваемого препарата на организм экспериментальных животных.
Изучена на мышах зависимость токсических эффектов от дозы препарата рекомбинантного белка OprF и вспомогательных веществ (буферные растворы и гидроокись алюминия)
Рекомбинантный белок OprF разводили в двух растворах: в ФСБ рН=6,5 и 50 мМ TRIS-HC1 рН=9,0, а затем сорбировали на гидроокиси алюминия (в соотношении 1:3) и вводили однократно внутрибрюшинно в дозах - 25, 50 и 100 мкг в 0,5 мл на одно животное. Численность каждой группы составила 10 особей.
![Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс]](/i/i/4503/199818.png "Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс] Донин Михаил Васильевич")
