Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Протеолитические ферменты бактериальной природы, методы получения и очистки
Глава 2. Способы стабилизации ферментов и сфера их применения 26
Глава 3. Объекты и методы исследований 39
3.1. Объекты исследований 39
3.2. Методы исследований 39
Глава 4. Разработка способа микробного биосинтеза протеолитического фермента
4.1. Изучение влияния компонентов питательной среды на рост и продукцию протеазы 44
4.2. Исследование протеазосинтетической активности Bacillus subtilis ЗН 47
4.3. Масштабирование процесса культивирования и биосинтеза про- 52
теолитического фермента штаммом-продуцентом Bacillus subtilis ЗН
Глава 5. Разработка способа очистки протеолитического фермента Bacillus subtilis ЗН
5.1. Очистка протеолитического фермента, полученного в питательной среде с пептоном 60
5.2. Очистка протеолитического фермента, полученного в питательной среде с дрожжевым экстрактом и мочевиной 72
Глава 6. Получение стабильных форм протеолитического фермента 76
6.1. Иммобилизация протеолитического фермента на полиглюкине 76
6.2. Образование внутримолекулярных сшивок глютаровым альдегидом 79
6.3. Изучение стабильности нативного, иммобилизованного на полиглюкине и сшитого глютаровым альдегидом протеолитического фермента 80
Глава 7. Изучение свойств различных форм протеолитического фермента
7.1. Влияние величины рН на протеолитическую активность 83
7.2. Определение субстратной специфичности 84
7.3. Изучение кинетики протеолиза 85
7.4. Изучение температурного оптимума 90
7.5. Молекулярная масса 91
7.6. Ингибиторный анализ 91
7.7. Изучение раноочищающего и ранозаживляющего действия протеолитического фермента 93
Заключение 98
Выводы 103
Список литературы 104
- Способы стабилизации ферментов и сфера их применения
- Изучение влияния компонентов питательной среды на рост и продукцию протеазы
- Очистка протеолитического фермента, полученного в питательной среде с пептоном
- Иммобилизация протеолитического фермента на полиглюкине
Введение к работе
Актуальность проблемы
В современной медицине широко применяются лекарственные препараты, имеющие ферментную природу. В 1996 г мировой объем производства ферментов осуществлен на сумму 1 млрд. долларов [130]. При этом доля ферментов медицинского назначения составляла более 10 % от этой суммы, основным источником их получения являются органы и ткани животных, например: цитохром С из бычьего сердца, панкреатин, трипсин, тестикулярная гиалурони-даза, ацетилхолинэстераза из эритроцитов и т.д. [23, 28,41,102,134].
Однако в связи с последними достижениями вирусологии и открытием прионовых заболеваний, по рекомендации ВОЗ, использование препаратов из тканей животных с каждым годом сокращается. Поэтому получение ферментов путем микробиологического синтеза является актуальной проблемой.
Из множества известных ферментов микробного происхождения практическое применение в медицине и различных отраслях промышленности нашли протеолитические ферменты. Их доля в мировом производстве равна 60 % [130]. В связи с этим разработке технологических способов получения протеолитических ферментов, продуцируемых микроорганизмами, исследователи уделяют большое внимание [25,28, 38, 71, 94, 106,123, 161].
В научной литературе детально представлены способы микробного биосинтеза протеолитических ферментов при культивировании штаммов рода Bacillus с целью получения протеолитических ферментов в лабораторных и в крупномасштабных производствах [29, 36, 55, 60, 77, 94,103].
В настоящее время в медицинской промышленности протеазы применяют при производстве питательных сред и органопрепаратов (Церебролизина, Це-ребролизата, Сирепара). Кроме того, их используют как самостоятельные лекарственные препараты (Террилитин, Терридеказа, Протосубтилин, Стрепто-киназа, Мезимфорте, Ируксол, Knol и т.д.) при терапии различных заболеваний органов пищеварения, глаз, сердечно-сосудистой системы, гнойной хирургической патологии, онкологических заболеваний и т.д.
5 С 1989 года в Уфимском НИИВС им. И.И. Мечникова под руководством
д.м.н., профессора Н.А. Михайловой началось изучение антагонистически активных штаммов Bacillus subtilis. При их культивировании отходом является фильтрат культуральной жидкости, с высокой ферментативной активностью, обусловленной протеолитическими, амилолитическими, липолитическими ферментами.
При исследовании продукта биосинтеза Bacillus subtilis З Н, получившего название Бактилин [114], установлено, что его действие связанно с двумя протеазами - металлопротеазой и минорными примесями сериновой протеазы, имеющими молекулярную массу 29+2 kD, активность в диапазоне рН 6,0-12,0 и субстратную специфичность в отношении большого количества белков.
Однако помимо протеаз в комплексе содержатся примеси белковой, ли-пидной, полисахаридной природы, а также остатки минеральных солей, которые, по-видимому, совокупно обусловливают некоторую биологическую токсичность Бактилина. Это делает невозможным его медицинское применение.
Существуют различные способы очистки протеолитических ферментов: высаливание, ионообменная, гель- и аффинная хроматографии, избирательная адсорбция на нерастворимых носителях, изофокусирование, электрофорез и т.д. [89,105].
В экспериментах многим исследователям удавалось получить высоко-очищенные препараты протеаз, комбинируя между собой различные методы. Однако лабораторные методы чрезвычайно трудоемки, малопроизводительны, относительно дороги. Их невозможно полностью адаптировать к условиям промышленного производства [40, 117, 168]. Все это обосновывает необходимость поиска технологически приемлемых путей объединения эффективных способов получения и очистки ферментов.
Цель работы
Получение, очистка, стабилизация и изучение свойств протеазы, синтезируемой Bacillus subtilis ЗН в различных питательных средах при периодическом
глубинном гомогенном культивировании.
Задачи исследования
1. Подобрать состав питательной среды для получения препарата с опта-
* мальными физико-химическими и биологическими свойствами.
Изучить протеазосинтетическую активность морфологических вариантов промышленного штамма-продуцента Bacillus subtilis ЗН и выбрать наиболее активные клоны.
Определить рациональный способ получения посевного материала.
Получить стандартный нативный ферментный препарат, содержащийся в культуральной жидкости после выращивания наиболее активного клона Bacillus subtilis ЗН методом периодического глубинного гомогенного культивирования с использованием мочевино-дрожжевой среды и выбранного способа подготовки посевной культуры.
5. Разработать оптимальные методы очистки и стабилизации
протеолитического фермента.
6. Изучить физико-химические свойства и специфическую биологиче-
скую активность полученного ферментного препарата.
* 7. Испытать лабораторную схему получения протеолитического фермента
в производственных условиях.
Научная новизна
Научно обоснована промышленная технология получения металлопро-теазы Bacillus subtilis ЗН.
Повышен уровень биосинтеза протеазы путем отбора и культивирования высокоактивных клонов штамма-продуцента с использованием мочевино-
* дрожжевой среды и рационально подобранной схемы подготовки посевного
' . материала.
Подобранные условия культивирования позволили использовать метод ультрафильтрации для эффективной очистки фермента.
7 Показана возможность стабилизации очищенного протеолитического
фермента, путем иммобилизации на полиглюкине, а также внутримолекулярной сшивкой глютаровым альдегидом.
Очищенная металлопротеаза и ее модифицированные аналоги охарактеризованы по величинам рН и температурных оптимумов, субстратной специфичности, молекулярной массе, кинетике Махаэллиса-Ментен.
Экспериментально доказана раноочищающая и ранозаживляющая активность полученного протеолитического препарата.
Практическая значимость работы
Разработана промышленная технология получения очищенного протеолитического фермента, включающая следующие стадии:
- предварительную очистку дрожжевого экстракта от балластных белков
«
перед приготовлением питательной среды с использованием метода ультрафильтрации на мембранах с пропускной способностью 15 Ш;
выбор высокоактивных клонов штамма-подуцента Bacillus subtilis ЗН по морфологическим характеристикам;
периодическое глубинное гомогенное культивирование производственного штамма Bacillus subtilis ЗН в питательной среде с дрожжевым экстрактом и мочевиной;
освобождение ферментсодержащей культуральной жидкости от микробных клеток методами сепарации и микрофильтрации;
очистку фракции, обладающей протеолитической активностью, от балластных белков методом ультрафильтрации на мембранах с пропускной способностью 15 Ш.
Выход протеолитического фермента, полученного по этой технологии, достигает не менее 70 %, а его удельная активность составляет, не менее 40 ПЕ/мг белка.
Препарат очищенного протеолитического фермента может быть рекомендован для разработки лекарственного средства с ранозаживляющей активно-
стью.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Оптимизирован процесс периодического глубинного гомогенного
культивирования высокоактивных клонов штамма Bacillus subtilis ЗН, продуци
рующего протеазу, с использованием мочевино-дрожжевои питательной среды
и рациональной схемы подготовки посевного материала.
Подобраны условия выделения, очистки, иммобилизации и стабилизации протеазы, обеспечивающие получение препарата с высокой удельной про-теолитической активностью.
Очищенный стабилизированный протеолитический фермент является металлопротеазой с широким оптимумом величины рН, температуры, а также обладает в опытах in vivo раноочищающим и ранозаживляющим действием.
Способы стабилизации ферментов и сфера их применения
Известно, что первичная структура белков состоит из аминокислотного полимера, который под действием различных сил приобретает вторичную и третичную структуру, образуя статический клубок, который обладает наименьшей свободной энергией. Для исследования природной стабилизации ферментов к экстремальным условиям применяют белки, которые выделяют из термофильных микроорганизмов [125].
Методом рентгенографического анализа была установлена структура молекул многих ферментов, выделенных в кристаллическом виде. Ряд данных указывает на то, что основные элементы строения кристаллов белков сохраняются также в вводных растворах [76]. Но при нагревании ферментов, особенно, если рН раствора далек от изоэлектрической точки или же в условиях неводных растворителей, происходит существенное изменение конформации молекул. Повышение свободной энергии фермента приводит к изменению энтропийного фактора и дезориентации отдельных участков белковой молекулы относительно друг друга, приводящей к потере ферментативной активности. Такое состояние белковой молекулы называется денатурацией [13,14].
Различают обратимую и необратимую денатурацию. В случае обратимой денатурации (или инактивации) конформационные изменения белка носят обратимый характер, что обеспечивает восстановление нативной конформации при снятии денатурирующих воздействий с полным или частичным восстановлением активности фермента.
Денатурирующие воздействия могут оказывать нагревание, радиация, высокие концентрации различных химических соединений, значительное изменение рН, органические растворители и многие другие факторы. Изучение денатурации белков позволяет определить их стабильность и выяснить причину потери биологической активности для выработки стратегии их стабилизации. Белки могут быть целенаправленно стабилизированы посредством ряда стратегий, таких как иммобилизация и химическая модификация [152], использование добавок [171], белковая инженерия с применением сайт-направленного мутагенеза [140].
В процессе иммобилизации может быть затронута пространственная структура фермента. Если это связано с химической модификацией функциональных групп белка, то для предотвращения такого явления необходимо либо защищать эти группы в ходе иммобилизации, либо подбирать такие методы, которые не затрагивают эти группы. Свойства иммобилизованных ферментов связаны с влиянием полимерной матрицы на микроокружение фермента и непосредственно на его активность, а также с различными эффектами, воздействующими на реальное поведение катализатора. «Микроокружение» - среда внутри полимерной матрицы. Растворитель, в котором суспендирован иммобилизованный фермент - «макроокружение» или «свободный раствор». В микроокружении эти же параметры могут иметь другие значения. Влияние полимерной матрицы на микроокружение связано с эффектом распределения и диффузионными ограничениями. Эффект распределения является следствием того, что полимер либо притягивает, либо отталкивает от своей поверхности субстрат, продукт реакции, ингибитор или активатор и различные ионы, тем самым повышая или понижая их концентрацию в растворе. В результате чего их содержание вокруг фермента и во всей системе будет отличаться. Диффузионные ограничения являются следствием того, что полимерная матрица - это препятствие для свободной диффузии молекул как в направлении к ферменту, так и от него. Большинство ферментов, будучи удалены из своего естественного окружения, становятся весьма лабильными. Существенные успехи стабилизации ферментов были достигнуты при иммобилизации ферментов [145]. Стабильность ферментов по отношению к денатурирующему действию температуры, чрезвычайно важный фактор, показывающий, насколько стабильна молекула белка. При повышении температуры повышается скорость всех химических процессов, в том числе и ферментативных, при этом одновременно происходит дестабилизация молекулы фермента, а по достижении определенной температуры происходит разрыв всех связей, удерживающих нативную каталитически активную конформацию, что приводит к денатурации фермента. Показано, что индуцированные температурой конформационные изменения одинаковы для иммобилизованного и нативного ферментов. Однако описано достаточно случаев повышения термостабильности иммобилизованных ферментов [76, 152,172]. Большинство ферментов теряют свою активность под действием экстремальных значений рН, это происходит вследствие изменения заряда при титра-ции заряженных аминокислотных остатков под действием избыточного количества или ОН" ионов. Изменение заряда приводит к ослаблению ионных взаимодействий, и как следствие к ослаблению структуры фермента. Наиболее показательным примером может служить пепсин, который, при рН 6,0 необратимо теряет свою активность. Ферменты могут терять активность под действием денатурирующих агентов. Классическими денатурирующими агентами могут считаться мочевина, гуанидин, поверхностно-активные вещества, органические растворители и т.д. Показано, что в то время как свободный трипсин полностью инактивируется в 8 М мочевине, трипсин, ковалентно присоединенный к сополимеру малеиново-го ангидрида и этилена, сохраняет в таких условиях значительную часть своей активности [76]. Аминоацилаза, присоединенная к ДЕАЕ-сефадексу, не инактивируется под действием мочевины, гуанидина, пропанола вследствие многоточечной связи с носителем [76]. Носители, имеющие ионогенные группы и обладающие буферными свойствами, могут компенсировать внешнее изменение рН раствора. Это приводит к повышению наблюдаемой рН стабильности иммобилизованного фермента по сравнению с его нативным состоянием [85, 135]. Исследование кислотной инактивации нативной и ковалентно присоединенной лактатдегидрогеназы показало, что нативный фермент при рН 3,2 и 25 С почти полностью инактивируется за 1 час, а иммобилизованный фермент в этих условиях сохраняет практически 100 % активность даже после 35 дневной инкубации [76].
Изучение влияния компонентов питательной среды на рост и продукцию протеазы
Успех или неудача при попытке повысить стабильность фермента обработкой его бифункциональным реагентом, в основном, зависит от того, насколько длина бифункционального реагента соответствует расстоянию между возможными центрами пришивки на белковой глобуле [76]. Для внутримолекулярной сшивки можно применить диамины, взаимодействующие с карбоксильными группами ферментов, если их предварительно активировать карбодиими-дом. В результате между аминогруппой модификатора (диамина) и карбоксильной группой белка образуется прочная амидная связь. Однако в результате образования внутримолекулярной сшивки могут образовываться надмолекулярные образования, включающие несколько белковых молекул. Поэтому в условиях, когда отсутствует межмолекулярная сшивка белковых молекул, найдено, что существенно возрастает термостабильность внутримолекулярно сшитого по этому методу химотрипсина (по сравнению с нативным препаратом константа скорости термоинактивации уменьшилась более чем в 40 раз) [76]. Наблюдаемый эффект стабилизации не может быть объяснен простой (одноточечной) химической модификацией фермента, поскольку модификация химотрипсина, даже уменьшает его термостабильность. Эффект стабилизации зависит от количества метиленовых групп в молекуле модификатора.
Тот факт, что обработка тетраметилендиамином приводит к наибольшей стабилизации химотрипсина, по-видимому, обусловлен тем, что длина именно этого сшивающего агента наилучшим образом соответствует расстояниям между карбоксильными группами белковой молекулы. Это приводит к возникновению большего, чем, в случае других диаминов, количества внутримолекулярных сшивок.
Для увеличения групп, по которым можно будет связать сшивающий реагент, вводят в ферментную молекулу SH-группы (с помощью N 37 ацетилгомоцистеинтиолактона или других соединений) с последующим использованием в качестве бифункциональных реагентов бисиодацетамидов различных алифатических диаминов. В случае описанной выше системы оказалось полезным предварительно модифицировать фермент янтарным ангидридом, чтобы увеличить содержание в его поверхностном слое карбоксильных групп. Затем сукцинилированный химотрипсин обрабатывали (по той же методике, что и нативный фермент) диаминами различной длины. Определено, что, во-первых, максимальный эффект стабилизации фермента возрос; во-вторых, максимальное стабилизирующее влияние оказывает не тетраметилендиамин, а более короткий бифункциональный реагент - этилендиамин. Последнее свидетельствует о более частой «заселенности» поверхности глобулы сукцинилхи-мотрипсина (по сравнению с нативным химотрипсином) карбоксильными группами.
Современная медицина все шире использует очищенные препараты белковой природы в самых различных отраслях клинической медицины в качестве перспективных средств медикаментозного лечения вследствие их исключительно высокой активности и специфичности.
Гидролитические ферменты широко используются в лечении болезней органов пищеварения [106,109]; сердечно - сосудистой системы [25, 38, 71, 94]; в хирургии - для обработки гнойных ран, ожоговых и обмороженных поверхностей, с противоспалительной целью [28, 106] и т.д. Эти препараты могут обладать как широкой субстратной специфичностью, так и узкой направленностью. Установлено, также что, протеолитические ферменты бактерий рода Bacillus способны лизировать тромбы человеческой крови [38, 94]. Перспективны также микробные протеазы активаторного и антикоагу-лянтного типов действия, которые посредством ограниченного протеолиза белка крови плазминогена приводят к активации защитных механизмов организма человека и восстановлению кровотока [71]. Успехи в исследовании этого рода ферментов открывают большие возможности в решении проблем лизиса преоб 38 разованных сгустков крови, ранней и адекватной диагностики нарушений го меостаза человека, а также предотвращения тромбообразования. Протеолитические ферменты успешно используются и в хирургической практике. Известно, что исход воспалительного процесса в значительной степени зависит от состояния иммунологической реактивности организма. Поэтому эффективность препаратов, применяемых для лечения, во многом определяется их влиянием на иммунный ответ, индуцируемый различными антигенами. Терапевтический эффект протеаз при лечении гнойно-воспалительных ран связан с расщеплением девитализированных участков ткани, ускорением очищения очага воспаления от тканевого детрита, повышением чувствительности микрофлоры к действию антибиотиков [28, 53, 72, 111]. Протеазы в условиях воспалительного процесса стимулируют иммунный ответ, повышают реактивность организма путем влияния на тимусзависимую популяцию лимфоцитов, усиливая фагоцитарную активность лейкоцитов. Применение антибиотиков приводит к угнетению фагоцитарной активности лейкоцитов. Протеолитические ферменты в процессе лечения стафилококковой инфекции активизируют фагоцитоз, а комбинированное использование протеолитических ферментов с антибиотиками уменьшает угнетающее действие последних на фагоцитоз [12, 15, 23,34,42, 43,100, 115]. Протеолитические ферменты могут играть значительную роль в детокси-кации при различных заболеваниях, расщепляя токсины и другие, ядовитые для макроорганизма, вещества [106]. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что области применения протеиназ для терапевтических целей достаточно широки.
Очистка протеолитического фермента, полученного в питательной среде с пептоном
В дальнейших исследованиях по очистке протеолитического фермента использован метод ионообменной хроматографии, являющийся наиболее универсальным в арсенале методов очистки белков. При этом применяли наиболее распространенные ионообменники на основе диэтиламиноэтил - (ДЕАЕ-ц) и карбоксиметил - (КМ-ц) целлюлозы. Изучалось взаимодействие протеолитического фермента с ионогенными группами обменников, а также их рН - зависимость сорбционной активности по отношению к белку, обладающему протео-литической активностью. Для DEAE-ц исследуемый интервал величин рН находился в пределах 6,0-8,5, при котором наблюдалось незначительное понижение уровня протеолитической активности, составлявшей 10-15 % от исходной активности. При этом на анионите сорбировалось 35±5 % общего белка. Очевидно, что белок, обладающий протеолитической активностью, практически, не взаимодействует с ДЕАЕ-ц.
Для КМ-ц интервал значений рН, в котором проводили исследования сорбционной активности, находился в области 4,0-6,5. Нами выявлено увеличение количества сорбированного протеолитического фермента при понижении величины рН. При значении рН 4,0-4,5 протеолитическая активность в надоса-дочной жидкости вообще не тестировалась.
Для определения эффективности разделения белков методом ионообменной хроматографии, в случае их связывания с ионообменником, необходимо определить условия, при которых интересующая нас белковая фракция будет отделяться от носителя.
Десорбцию белков с ионитов можно проводить при помощи повышенной концентрации соли или изменяя значение рН. Десорбция белков при изменении значения рН, более предпочтительна, поскольку не требует последующего обессоливания раствора очищенного фермента. С целью достижения десорбции протеолитического фермента с КМ-ц выбран Na-ацетатный буфер, благодаря достаточной буферной емкости и отсутствия взаимодействия с ионами двухвалентных металлов.
Для десорбции протеолитического фермента с КМ-ц использовали 0,1 М Na-ацетатный буфер с величиной рН 7,6. Наивысший уровень протеолитиче ской активности, десорбируемой с ионита, обнаруживали при использовании сорбента уравновешенного при значении рН 4,5, который составил 98,5±0,7 % (таблица 5.7.). В результате проведенного фракционирования методом ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе, удельная активность протеолитического фермента увеличилась в 12,78 раз и составила 24,6±1,26 ПЕ/мг белка, а выход протеолитической активности находился в пределах 98,5+0,7 %. Наибольшую степень очистки протеолитического фермента, полученного на пептонной питательной среде, позволяют достичь методы гель-хроматографии, высаливания и ионообменной хроматографии, при этом удельная активность была выше 20 ПЕ/мг белка. Однако при использовании метода гель-хроматографии установлено, что малая концентрация фермента в исходной культуральной жидкости не позволяет вести процесс гель-хроматографической очистки протеазы эффективно. Применение метода высаливания позволяло концентрировать препарат при его перерастворении. Однако лимитирующей стадией при этом способе являлась необходимость осаждения высоленного белка, имеющего характер дисперсной взвеси, требующей высокоскоростного центрифугирования. Методом ионообменной хроматографии также получали очищенный препарат протеолитического фермента, но для концентрирования целевого продукта требуется введение дополнительной стадии в процесс ферментного препарата. Таким образом, вышеперечисленные методы позволяют достичь высокого уровня очистки протеолитического фермента от белковых примесей. Однако они трудоемки, не технологичны и их трудно масштабировать. Применение этих методов не обеспечивает оптимальные условия проведения процесса очистки в промышленных масштабах, что отрицательно влияет на экономические показатели для стадии получения очищенного препарата фермента. С целью разработки технологического промышленного способа получения протеолитического фермента проведена работа по оптимизации состава питательной среды для культивирования штамма-продуцента с заменой пептона на мочевину и добавлением дрожжевого экстракта. Культуральная жидкость, полученная при этом, отличалась от культуральной жидкости, полученной с применением пептона, меньшим содержанием белка, меньшей пигментацией, более высоким содержанием протеолитического фермента. При разработке оптимального способа очистки протеолитического фермента, полученного в питательной среде с дрожжевым экстрактом и мочевиной, важно знать молекулярно-массовый спектр белков, входящих в состав культуральной жидкости, что обуславливает выбор подходов для проведения очистки препарата. Поэтому для изучения распределения молекул белка по размерам, полученный протеолитический фермент исследовали методом гель-хроматографии. Результаты фракционирования культуральной жидкости после выращивания штамма-продуцента на указанной среде представлены на рисунке 5.2. Полученный хроматографический профиль свидетельствует, что материал хорошо разделяется на три области: высокомолекулярную с объемом элю-ции 350-560 мл, среднемолекулярную с объемом элюции 560-700 мл, низкомолекулярную с объемом элюции (800-1000 мл). При исследовании фракций на наличие в них протеолитической активности установлено, что она элюировалась между 550 и 710 мл.
Иммобилизация протеолитического фермента на полиглюкине
В результате исследования протеазосинтетической активности 200 колоний, находящихся в S-форме, обнаружено, что 6 из них (3 %) проявляли максимальную активность (4-6 ПЕ/мл), которые визуально представляли собой маленькие колонии, размером не более 1 мм, образующие зону гидролиза казеина 12-17 мм.
Для этих клонов исследовали протеазосинтетические свойства. Была установлена идентичность кинетических кривых синтеза протеолитического фермента. Они имели длительные лаг-фазы, соизмеримые экспоненциальные и фазы замедления продукции протеолитического фермента. Отличительной особенностью кинетических кривых 4 и 6 является то, что они не имеют фазы замедления скорости синтеза на изучаемом отрезке времени. Уровень накопления протеолитической активности для клона 4 - составлял 32,7+2,2 ПЕ/мл, а для клона 6 - 35,9+1,8 ПЕ/мл.
Таким образом, нами установлено, что выделение активных клонов из "S-популяции" приводило к 10- кратному увеличению протеазосинтетической активности штамма-продуцента Bacillus subtilis ЗН, по сравнению с исходной культурой. Для бактерий рода Bacillus в литературе имеются данные об интенсивном потреблении многих неорганических ионов при развитии микробной популяции [74, 108, 112]. Доказано, что отсутствие сульфата железа позволяет микробным клеткам, минуя лаг-фазу, переходить в экспоненциальную фазу роста. При отсутствии сульфата меди лаг-фаза была короткой и составляла 18 ч. Ее продолжительность увеличивалась при выращивании на питательной среде, в которую не добавляли сульфата аммония или сульфата цинка. Удаление из питательной среды фосфата калия и цитрата натрия приводило к снижению количества биомассы, а отсутствие хлорида кальция - к полному подавлению роста клеток. Таким образом, основными неорганическими компонентами среды, влияющими на процесс накопления биомассы, являются сульфат аммония, цитрат натрия, сульфат цинка, хлорид кальция. Вместе с тем, фосфат калия, может влиять и на продукцию фермента, вызывая замедление клеточного роста. При исследовании влияния индивидуальных ингредиентов среды на синтез протеазы установлено, что ни один из них не оказывает явного стимули-рующего действия. При масштабировании процесса культивирования штамма-продуцента с использованием промышленного реактора объемом 100 л нами подтверждены закономерности, полученные в лабораторных условиях. В ходе исследований установлены оптимальные значения параметров процесса культивирования: схема инокуляции реактора, посевная доза от 0,031 до 0,043 млрд кл./мл, давление воздуха 0,2-0,4 кгс/см2. При данных условиях за 25,0+1,2 ч культивирования получали биомассу с концентрацией 15,4+1,4 млрд кл./мл и культуральную жидкость с протеолитической активностью 15,9± 1,9 ПЕ/мл. При проведении следующего этапа исследований основной задачей являлся выбор метода выделения и очистки экзопротеаз, полученных в процессе гомогенного глубинного культивирования на различных питательных средах. Предложенные рядом авторов [29, 24, 67, 83, 84, 87, 102, 118] методы для выделения и очистки ферментов (сепарирование, центрифугирование, фракционирование) оказались нетехнологичными в силу ряда недостатков: больших потерь объемов материала, трудоемкости, энергоемкости, значительной продолжительности процессов, отсутствия возможности масштабировать. Отделение микробных клеток от ферментсодержащей культуральной жидкости без потерь протеолитической активности удалось осуществить методом микрофильтрации без механического побуждения. Наши исследования были проведены в двух направлениях. В начале ра боты выделение и очистку фермента осуществляли из культуральной жидкости, полученной при выращивании производственного штамма в питательной среде с пептоном. Разделение ферментсодержащей культуральной жидкости гель-хроматографией позволило получить ферментный препарат с удельной активностью 39,5+2,5 ПЕ/мг белка, с выходом 94,4+3,4 %. Методом ультрафильтрации получили препарат с удельной активностью 2,25+0,08 ПЕ/мг белка, при выходе в пределах 40,7±2,9 %. Низкая степень очистки и выхода фермента указывала на необходимость обратиться к другим методам. Солевым фракционированием достигли удельной активности фермента, которая составила 21,6±0,6 ПЕ/мг белка при выходе 78,5+2,2 %. Следующим апробированным методом очистки фермента являлась адсорбция на неорганических гелях гидроокиси алюминия и фосфата кальция. Использование геля гидроокиси алюминия позволило достичь удельной активности 5,6±0,7 ПЕ/мг с выходом 76,6+0,4 %. Более высокие результаты были получены при использовании геля фосфата кальция, при этом удельная активность фермента увеличилась до 10,7±0,8 ПЕ/мг, а выход целевого продукта составил 98,3± 1,7 %. В результате проведенного фракционирования методом ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе, удельная активность протеолитического фермента увеличилась в 12,78 раз и составила 24,6±1,26 ПЕ/мг белка, а выход протеолитической активности находился в пределах 98,5±0,7 %. Использование DEAE-целлюлозы позволило достичь активности фермента, соответствующей 6,3±0,3 ПЕ/мг белка, при этом выход продукта составил 89,3+1,2%. На следующем этапе отрабатывали технологию очистки культуральной жидкости, полученной при культивировании продуцента в питательной среде с дрожжевым экстрактом и мочевиной.
