Введение к работе
Актуальность проблемы
Массовая специфическая вакцинопрофилактика коклюша в нашей стране позволила снизить заболеваемость коклюшем в последнее десятилетие более чем в 60 раз. Заболеваемость коклюшем в Российской Федерации за последние 5 лет стабилизировалась на уровне 2,5 - 3,8 на 100 тыс. населения. Вместе с тем, даже на фоне высокого уровня охвата профилактическими прививками (до 95,0%), по-прежнему регистрируются периодические подъемы заболеваемости, как за счет непривитых, так и привитых детей, тяжелые формы заболевания и единичные летальные исходы. Наибольшие показатели заболеваемости и летальные исходы отмечаются преимущественно среди детей в возрасте до года. Одной из особенностей эпидемического процесса коклюшной инфекции является увеличение заболеваемости среди школьников 6-10 лет, которые составляют 43,1% от числа всех заболевших, что свидетельствует о снижении противококлюшного иммунитета у детей данной возрастной группы (Лыткина И.Н., 2004; Герасимова А.Г., 2004; Озерецковский Н.А., 2004; Чистякова Г.Г., 2005; Попова О.П., 2005, 2009; Таточенко В.К., 2004, 2009; Бабаченко И.В., 2006, 2009; Тимченко В.Н., 2005, 2007; Петрова М.С., 2008; Селезнева Т.С., 2009; Лобзин Ю.В., 2011; Онищенко Г.Г, 2006, 2008, 2012).
Многочисленные исследования, проводимые, как отечественными, так и зарубежными специалистами, в более чем 30 странах мира показали, что возбудитель коклюша подвержен изменчивости, которая формируется на фоне длительной массовой иммунизации (Mooi F., 1998, 1999, 2001, 2009, 2010; Boursaux-Eude C., 2000; Cassiday P., 2000; Fry N., 2001; van Loo I., 2002; Курова Н., 2003; Семенов Б.Ф., 2003; Packard E., 2004; Schouls L., 2004; van Amersfoorth S., 2005; Мазурова И.К., 2005, 2008; Борисова О.Ю., 2008, 2010 ; Litt D., 2009; Advani A., 2009, 2011; Kourova N., 2010; Schmidtke A., 2012; и др.). Фенотипическая изменчивость проявляется не только в смене циркулирующего серотипа штаммов B. pertussis, но и в снижении их чувствительности к антибиотикам и появлении резистентных форм (Hill B., 2000, Gordon K, 2001; Yao S., 2008; Sitchenko V., 2010; Fry N., 2010). А генотипическая – в штаммовом SN-полиморфизме (SNP) B. pertussis, который к настоящему времени описан у 16 генов с наиболее выраженными изменениями в генах – ptxA, ptxC, prn, fim2, fim3, tcfA и ptxP, кодирующих антигенные детерминанты. Предыдущими исследованиями, проведенными во ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (Мазурова И.К., 2005, 2008; Борисова О.Ю., 2007, 2010; Гадуа Н., 2012), установлено, что распространяются штаммы с новыми «невакцинными» аллелями основных генов патогенности, которые несут мутационные изменения, затрагивающие иммуногенные области генома возбудителя.
В последние годы для унификации результатов генотипирования штаммов B.perussis, полученных в различных странах, применяется мультилокусное секвенирование ДНК (MLST) и его модификации (MAST), позволяющие оценивать клональный состав циркулирующих популяций возбудителя коклюша (van Loo I., 2002). Проведенный скрининг штаммов B.pertussis, циркулирующих в различных странах мира, показал значительные изменения клонального состава и глобальность происходящих изменений состава популяций возбудителя на фоне эпидемических подъемов заболеваемости коклюшем (Schouls L., 2004; van Amersfoorth S., 2005; Advani A., 2009; Litt D., 2009; King A., 2010; Mooi F., 2010; Schmidtke A., 2012; и др.).
Поэтому, в настоящее время большое значение имеет наблюдение за биологическими свойствами штаммов B.pertussis в нашей стране и разработка ускоренных молекулярно-биологических методов, позволяющих выявлять измененные клоны возбудителя, которые могут оказывать влияние на течение эпидемического и инфекционного процессов. Кроме того, особую актуальность приобретает использование современных фундаментальных достижений биотехнологии в области таксономической идентификации (генетического разнообразия). В частности, разработка инновационных биокибернетических продуктов – отечественного программного обеспечения, являющегося инструментом биотехнологии, применяемым для накопления биотехнологической информации (знаний о строении макромолекул ДНК/РНК/белков, изменения в строение генома микроорганизмов и т.д.), ее анализа (эволюционный биологический анализ), распространения и последующего применения (создание обширных и доступных баз данных), а так же создания новых способов проведения молекулярно-генетического мониторинга возбудителя коклюша в рамках совершенствования технологической базы системы надзора за патогенными микроорганизмами, направленной на решение медицинских проблем в целях улучшения охраны здоровья населения.
Целью исследования является совершенствование и проведение микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга для оценки фенотипических и генотипических свойств циркулирующих штаммов B.pertussis, а также разработка биоинформационного алгоритма для филогенетического анализа их нуклеотидных и белковых последовательностей.
Задачи исследования:
-
Провести микробиологический мониторинг циркулирующих штаммов B. pertussis, выделенных в 2006 - 2012 гг., по серологическим свойствам (с определением серотипа) и уровню их чувствительности к антибактериальным препаратам.
-
Оптимизировать методы проведения мультилокусного секвенирования ДНК (MLST, MAST1, MAST2), в соответствии с международными протоколами, и провести генотипирование штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России, методами MLST, MAST1 и MAST2.
-
Выявить особенности клонального состава популяции штаммов B.pertussis, циркулировавших в различные периоды эпидпроцесса коклюшной инфекции, и провести анализ филогенетического родства с построением филогенетического дерева.
-
Разработать биоинформационный алгоритм и на его основе программное обеспечение для Intel x86 совместимом компьютере с системой Microsoft для филогенетического анализа нуклеотидных и белковых последовательностей с возможностью построения мультипараметрического дерева Minimum Spanning Tree (MST).
-
Разработать ускоренный молекулярно-биологический метод генотипирования штаммов B.pertussis по структуре промотора ptxP, основанный на изучении длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ), и апробировать его для идентификации штаммов B.pertussis.
Научная новизна
Проведенный микробиологический мониторинг штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем, показал, что по-прежнему циркулируют штаммы серотипа 1.0.3. и прослеживается тенденция снижения общей антибиотикочувствительности штаммов возбудителя коклюша к антибактериальным препаратам. Установлено, что в последние 5 лет в популяции B.pertussis преобладают штаммы с промежуточной чувствительностью к эритромицину и азитромицину.
Впервые с помощью мультилокусного секвенирования ДНК (MLST и MAST) представлена генетическая характеристика штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России, и выявлена поступательная смена штаммов с «вакцинными» на новые «невакцинные» сиквенс- и MAST-типы, которые в настоящее время заняли доминирующее положение в популяции, что расширило знания о клональной организации, закономерностях циркуляции и формирования популяции возбудителя коклюша. Продолжение исследований по выявлению особенностей структуры генов ptxA, ptxC, fim3, prn, tcfA и промотора ptxP штаммов B. pertussis, выделенных в России в 2006-2012 гг., показало что, по-прежнему в популяции превалируют штаммы с новыми «невакцинными» аллелями этих генов и обнаружены новые значимые мутации в гене prn, кодирующем пертактин.
Впервые разработан ускоренный молекулярно-биологический способ генотипирования штаммов B. pertussis, основанный на ПЦР-ПДРФ анализе, позволяющий выявлять штаммы с особенностями структуры промотора ptxP коклюшного токсина при проведении молекулярно-генетического мониторинга циркулирующей популяции штаммов возбудителя коклюша (заявка на изобретение «Способ молекулярно-генетического типирования штаммов B. pertussis» № 2012141063).
Впервые разработан биоинформационный алгоритм для филогенетического анализа нуклеотидных и белковых последовательностей, позволяющий накапливать и систематизировать данные о генетических особенностях B. pertussis и проводить построение минимального мультипараметрического остовного дерева (Minimum Spanning Tree – MST) для популяции возбудителя (заявка на изобретение «Способ молекулярно-генетического мониторинга циркулирующих штаммов B. pertussis» № 2012153853).
Практическая значимость
Определены возможности использования мультилокусного секвенирования на основе схемы MAST2 для генотипирования штаммов B.pertussis, что позволит создать подходы для выявления эпидемических значимых штаммов B.pertussis, слежения за появлением новых генотипов, что будет, в свою очередь, способствовать повышению эффективности эпидемиологического надзора за коклюшной инфекцией. Новые данные о динамике распространения штаммов B.pertussis с промежуточной чувствительностью к антибактериальным препаратам могут быть использованы для оптимизации антибиотикотерапии при коклюшной инфекции.
Разработанный ускоренный молекулярно-биологический способ генотипирования штаммов B. pertussis, основанный на ПЦР-ПДРФ анализе, дает возможность проводить скрининг большого количества штаммов при мониторинге циркулирующей популяции для дифференцирования штаммов с особенностями структуры промотора ptxP коклюшного токсина.
Разработанное на основе биоинформационного алгоритма программное обеспечение «SEQ» для Intel x86 совместимом компьютере с системой Microsoft позволяет получить высокоинформативную характеристику популяции штаммов в виде графа, построенного с учетом определения степени родства штаммов между собой, частоты их встречаемости, места и периода (территориального и временного признака) их выделения, что дает возможность оценивать генетическую вариабельность и прогнозировать развитие клонального состава циркулирующей популяции возбудителя коклюша.
Создан банк ДНК B.pertussis, обладающих различным уровнем чувствительности к антибактериальным препаратам и генетической структурой (сиквенс-типами), который можно использовать в дальнейших исследованиях для прогнозирования распространения эпидемически значимых штаммов возбудителя коклюша, а так же изучения молекулярно-генетических механизмов их резистентности к антибактериальным препаратам.
Внедрение результатов работы в практику
Поданы заявки на изобретения: 1) на новый молекулярно-генетический метод типирования штаммов B. pertussis, имеющих различную структуру промотора ptxP - «Способ молекулярно-генетического типирования штаммов B. pertussis» рег. № 2012141063 от 26.09.2012; 2) на новый способ филогенетического анализа штаммов B. pertussis с помощью разработанного биоинформационного алгоритма - «Способ молекулярно-генетического мониторинга циркулирующих штаммов B. pertussis» рег. № 2012153853 от 13.12.2012. Результаты проведенных исследований нашли применение в лекционном цикле и практических занятиях на курсах повышения квалификации для врачей- бактериологов «Актуальные вопросы современной медицинской микробиологии», проводимых на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (2009; 2010 гг.); семинаров тематического усовершенствования «Биологические свойства возбудителя коклюша и лабораторная диагностика» для врачей-бактериологов филиалов ФБУЗ ЦГиЭ г. Москвы (2009 г., 2010 г., 2012 г). Оптимизированные и разработанные молекулярно-биологические методики генотипирования штаммов B.pertussis используются в Референс-центре ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора при проведении микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга штаммов возбудителя коклюша, циркулирующих на территории России.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Микробиологический мониторинг показал, что по-прежнему циркулируют штаммы B.pertussis серотипа 1.0.3 и произошли изменения уровня их чувствительности к антибактериальным препаратам – увеличилась частота выявляемости штаммов с промежуточной чувствительностью к эритромицину, азитромицину и ампициллину среди штаммов B. pertussis, выделенных в 2000-2012 гг.
-
С помощью методов MLST, MAST1 и MAST2 показаны изменения клонального состава популяции возбудителя коклюша – поступательная смена штаммов с «вакцинными» на новые «невакцинные» сиквенс-, MAST-типы и выявлена тенденция нарастания степени генетической гетерогенности современной популяции B. pertussis.
-
Разработаны новые биотехнологические подходы - молекулярно-биологический метод мониторинга возбудителя коклюша и биоинформационный алгоритм, являющийся основой программного обеспечения для анализа биотехнологической информации о строении макромолекул ДНК/РНК/белков и генома микроорганизмов в рамках совершенствования технологической базы системы надзора за патогенными микроорганизмами.
Апробация работы
Диссертация апробирована на совместном заседании секций Ученого совета «Медицинская биотехнология» и «Эпидемиология, микробиология, клиника инфекционных заболеваний» ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 7 от 13 декабря 2012 г.
Результаты диссертационной работы представлены на конференциях молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения» (г. Нижний Новгород, 2011 г.); III Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 2011 г.); «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа рисков здоровья населения» (г. Пермь, 2012 г.); IV Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 2012 г.).
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, в том числе 5 статей – в рецензируемых изданиях, 1 статья – в другом издании, 6 работ – в материалах конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 187 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, заключение и выводы. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 41 рисунком. Список литературы включает 258 источников, в том числе 53 - отечественных и 205 - зарубежных авторов.
