Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Внутрибольничные инфекции и меры их профилактики... 13
1.2. Роль условно-патогенных бактерий в возникновении госпитальных инфекций 20
Собственные исследования 28
ГЛАВА 2. Материалы и методы 28
2.1. Ретроспективный анализ заболеваемости ВБИ в обследованных стационарах 28
2.2. Микробиологический мониторинг 30
2.2.1. Объекты исследования 30
2.2.2. Методы отбора проб 30
2.2.3. Бактериологический метод исследования 31
2.2.4. Определение спектра антибиотикочувствительности выделенных изолятов 31
2.2.5. Определение чувствительности микроорганизмов в отношении дезинфицирующих средств 32
2.3. Метод экспресс-обнаружения синегнойной палочки 34
2.3.1. Получение иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих моноклональных против антигенов Pseudomo-nas aeruginosa 34
2.3.2. Оценка активности полученных препаратов 35
2.3.3. Исследование проб смывов с объектов внешней среды и клинического материала 36
2.4. Методы статистической обработки результатов опытов 36
ГЛАВА 3. Ретроспективный анализ заболеваемости внутрибольничны- инфекциями в муниципальных учреждениях здравоохранения №5и № 12 37
ГЛАВА 4. Обсемененность внешней среды стационаров условно-патогенными микроорганизмами - потенциальными возбудителями внутрибольничных инфекций 46
ГЛАВА 5. Резистентность микроорганизмов, выделенных от больных и из проб с объектов внешней среды обследованных стацио наров, в диско-диффузионных тестах с антибиотиками и де зинфицирующими средствами 60
ГЛАВА 6. Применение МФА для экспресс-обнаружения синегнойной палочки 77
Заключение 91
Выводы -. 112
Список использованных источников 115
- Внутрибольничные инфекции и меры их профилактики...
- Ретроспективный анализ заболеваемости ВБИ в обследованных стационарах
- Определение спектра антибиотикочувствительности выделенных изолятов
- Методы статистической обработки результатов опытов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Внутрибольничные инфекции (ВБИ) остаются одной из наиболее важных проблем практического здравоохранения и приобретают все большую социально-экономическую значимость [15, 27, 34, 52, 53, 56, 60, 96]. Они возникают вследствие реализации механизмов естественной и арти-фициалыюй передачи инфекции среди пациентов и медперсонала и развиваются в специфических социальных условиях при циркуляции в стационарах госпитальных штаммов и концентрации восприимчивого к инфекциям контингента, в том числе лиц с измененным иммунным статусом [83, 100, 103].
В нашей стране возбудители нозокомиальных инфекций отнесены в разряд проблемных микроорганизмов, представляющих серьезную угрозу здоровью и жизни пациентов. Ежегодно в России регистрируют от 50 000 до 60 000 случаев госпитальных инфекций. По мнению ряда авторов, число инфицированных в 40-50 раз превосходит официальные данные, что свидетельствует о неполном учете заболеваемости ВБИ и в ряде случаев сокрытии фактов инфицирования пациентов за период их нахождения в стационарах [60, 83].
В решении Коллегии Минздрава Российской Федерации от 26.11.2002, отразившем состояние заболеваемости внутрибольничными инфекционными болезнями и меры по их предупреждению, было отмечено, что «ситуация в стране остается напряженной», а низкий уровень регистрируемой заболеваемости госпитальными инфекциями объясняется их недоучетом.
Минимальный международный уровень заболеваемости ВБИ составляет 5 %, максимальный - колеблется в широком диапазоне значений [49, 103]. В различных странах мира регистрируют своеобразное наступление микроорганизмов, вызывающих нозокомиальные инфекции [15, 48, 51, 144, 149].
В Российской Федерации в 1997-2001 г.г. распространенность ВБИ по стационарам различных профилей составляла 37,3 % в родильных домах (отделени-
6 ях), 26,2 % - в хирургических стационарах, 15,6 % - в прочих стационарах, 12 % -в амбулаторно-поликлинических учреждениях, 8,6 % - в детских стационарах [36].
Одной из основных причин, породивших современные госпитальные инфекции, считают начало широкого и не всегда обоснованного применения хи-миотерапевтических препаратов [32, 107, 108]. Установлено, что их нерациональное использование приводит к увеличению частоты появления полиантибио-тикорезистентных госпитальных штаммов микроорганизмов [21,31,48,112,125,143].
Для подразделений лечебных учреждений характерны локальные особенности микробного пейзажа госпитальной среды и превалирование тех или иных видов микроорганизмов из числа потенциальных возбудителей ВБИ [31, 36, 49, 121, 126, 141]. Определение ведущей микрофлоры в стационарах различного профиля в конкретный период времени является одной из наиболее важных задач надзора за госпитальными инфекциями. Эпидемиологическое маркирование и выявление госпитальных штаммов возбудителей ВБИ проводят согласно результатам определения видовой принадлежности изолируемых микроорганизмов и спектру их антибиотикорезистентности [31,46]. В последние годы отмечены изменения в этиологической структуре ВБИ, связанные с увеличением удельного веса внутриболышчных осложнений, вызванных грамотрицательными микроорганизмами, принадлежащими к семейству энтеробактерий и к группе нефермен-тирующих бактерий [2, 31, 36, 49, 89].
Разработанная РАМН совместно с Минздравом России «Концепция профилактики внутриболышчных инфекций» предусматривает выполнение программ организационных и практических мероприятий по предупреждению заболеваемости ВБИ на региональном уровне. Полагают, что ее успешной реализации будет способствовать внедрение в практику достижений современных технологий, методов и средств быстрого и достоверного обнаружения возбудителей ВБИ, дезинфицирующих препаратов нового поколения, а также совершенствование мер
по созданию диагностических бактериологических лабораторий, способных проводить мониторинг антибиотикорезистентных госпитальных штаммов микроорганизмов в унифицированном режиме [95].
В то же время, согласно постановлению Главного государственного санитарного врача Российской Федерации Г.Г.Онищенко от 5.10.2004 «О состоянии заболеваемости внутрибольничными инфекционными болезнями и мерах по их снижению», в России, по-прежнему, сохраняется значительный недоучет случаев ВБИ и выявлены серьезные недостатки в работе ЛПУ в части принимаемых мер по снижению заболеваемости госпитальными инфекциями и их профилактике. Во исполнение Федерального закона от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемио-логическом благополучии населения» в постановлении даны рекомендации по улучшению профилактики госпитальных инфекций.
Цель работы. Изучение локальных особенностей микробного пейзажа в двух многопрофильных стационарах Краснооктябрьского района г. Волгограда и разработка научно обоснованных рекомендаций по совершенствованию эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями в них.
Задачи исследования:
1. Провести ретроспективный анализ заболеваемости ВБИ в ряде отделений
муниципальных учреждений здравоохранения (МУЗ) № 5 и № 12.
Изучить микробный пейзаж внешней среды стационаров, исследовать видовой состав микроорганизмов в пробах с объектов внешней среды и пробах клинического материала, установить ведущую микрофлору в каждом из обследованных лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ).
Определить резистентность доминирующих видов условно-патогенных микроорганизмов в отношении антибиотиков и дезинфицирующих средств.
Оценить эффективность использования четвертично-аммониевых соединений (ЧАС) для целей совершенствования профилактических мероприятий в обследованных стационарах.
На основе моноклональных антител против антигенов синегнойной палочки из коллекции Волгоградского НИПЧИ приготовить экспериментальные образцы иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих, отобрать наиболее эффективные из них в части обнаружения Pseudomonas aeruginosa в пробах смывов с объектов внешней среды и пробах клинического материала.
Провести апробацию метода флуоресцирующих антител (МФА) с экспериментальными образцами иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих моноклональных против антигенов синегнойной палочки и оценить его эффективность как метода экспресс-обнаружения P.aeruginosa при работе с пробами клинического материала и с объектов внешней среды.
Научная новизна
Впервые проведено изучение видового состава микробного пейзажа госпитальной среды МУЗ № 5 и МУЗ № 12. Определены абсолютные и относительные показатели числа грамположительных и грамотрпцательпых бактерий, изолированных из проб с объектов внешней среды, сезонные колебания относительных показателей частоты обнаружения этих микроорганизмов в госпитальной среде вышеназванных ЛПУ.
Получены приоритетные данные о превалировании во внешней среде обследованных стационаров грамотрпцательпых аэробных микробов из семейства энтеробактерий и группы неферментирующих бактерий. Выявлены доминирующие виды условно-патогенных микроорганизмов, определена их резистентность в отношении широкого спектра антибиотиков и ряда дезинфицирующих средств, в том числе нового поколения.
Осуществлен ретроспективный анализ заболеваемости ВБИ в МУЗ № 5 и МУЗ № 12 в 2001-2002 г.г. Определены относительные показатели заболеваемо-
сти ВБИ и гнойно-септическими инфекциями (ГСИ) в этих ЛПУ, выявлено многообразие незарегистрированных нозологических форм внутрибольничных заболеваний, протекавших спорадически, а также имевшие место предвестники осложнений эпидемической ситуации и факты эпидемиологического неблагополучия в данных стационарах. Проведен сравнительный анализ заболеваемости ВБИ и ГСИ в отделениях хирургического профиля, определены отделения повышенного риска возникновения госпитального инфицирования пациентов в них.
Впервые представлены экспериментальные доказательства эффективности применения МФА с иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими моноклональными для быстрого и достоверного обнаружения P.aeruginosa во внешней среде стационаров и пробах клинического материала.
Практическая ценность
Полученные данные о состоянии внешней среды двух многопрофильных стационаров Краснооктябрьского района и уровне заболеваемости ВБИ и ГСИ в ряде отделений этих стационаров позволят приступить к успешной реализации положений, регламентируемых «Концепцией профилактики ВБИ», определить тактику проведения наиболее эффективных противоэпидемимеских мероприятий в них.
Данные об особенностях микробного пейзажа обследованных стационаров, резистентности доминирующих видов условно-патогенных микроорганизмов в отношении антибиотиков и дезинфицирующих средств значимы для принятия рациональных управленческих решений в части усиления материальной базы клинических лабораторий с целью обеспечения современного уровня монитори-рования госпитальной среды стационаров и изучения антибиотикорезистентности клинических изолятов, проведения обоснованной политики закупок и назначения антибактериальных химиотерапевтических прапаратов, а также использования наиболее эффективных дезинфицирующих средств нового поколения.
Результаты выполненных исследований использованы при подготовке постановления Главного государственного санитарного врача по Волгоградской области А.Н.Жукова № 25 от 28.12.2004 «О состоянии заболеваемости внутри-больничными инфекционными болезнями и мерах по их снижению».
Разработанный способ экспресс-обнаружения синегнойной палочки в различных объектах исследования рекомендован для включения в схему лабораторного анализа при надзоре за синегнойной инфекцией, одной из наиболее значимых госпитальных инфекций, прежде всего для отделений хирургического профиля, ожоговых отделений и отделений интенсивной терапии и реанимации. Особенности проведения анализа, тактика отбора и подготовки проб к иммуно-люминесцентному выявлению этого проблемного микроорганизма, критерии оценки получаемых результатов обобщены в утвержденных директором Волгоградского НИПЧИ «Методических рекомендациях по применению метода флуоресцирующих антител для экспресс-обнаружения синегнойной палочки в пробах из объектов внешней среды стационаров», предназначенных для сотрудников Центров Госсанэпиднадзора и практических бактериологических лабораторий, занимающихся вопросами эпиднадзора за возбудителями госпитальных инфекций. Метод внедрен в практическую работу отделений хирургического профиля МУЗ № 12 г. Волгограда (акт внедрения, утвержденный главным врачом МУЗ № 12 от 28 декабря 2004 г.).
Практически значимые результаты работы включены в лекции для слушателей курсов повышения квалификации врачей-бактериологов но клинической микробиологии (бактериологии), проводимых на базе Волгоградского НИПЧИ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Ретроспективный анализ заболеваемости госпитальными инфекциями в обследованных стационарах Краснооктябрьского района г. Волгограда выявил имевшие место в 2001-2002 г.г. спорадические случаи ВБИ, а также отличия показателей заболеваемости этими инфекциями в отделениях различного профиля.
Преобладание во внешней среде обследованных стационаров условно-патогенных грамотрицательных бактерий, циркуляция значительного числа ан-тибиотикорезистентных штаммов свидетельствуют о потенциальной опасности инфицирования больных возбудителями ВБИ и возможности ухудшения эпидемиологической ситуации в них.
Определение антибиотикочувствителыюсти госпитальных штаммов возбудителей ВБИ необходимо для оптимизации схем лечения пациентов и профилактики инфицирования этими микроорганизмами контингента обследованных стационаров.
Применение дезинфицирующих средств группы ЧАС позволит повысить эффективность противоэпидемических мероприятий в обследованных ЛПУ.
5. Применение МФА с иммуноглобулинами диагностическими флуо
ресцирующими моноклональными против антигенов P.aeruginosa обеспечивает
быстрое и достоверное обнаружение синегнойной палочки в пробах с различных
объектов внешней среды и клинического материала.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 131 машинописного текста, проиллюстрирована 16 рисунками и 16 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Список использованных источников литературы включает 151 работу (109 отечественных и 42 зарубежных).
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы, были представлены и обсуждены на VI Российском съезде врачей-инфекционистов (29-31.10. 2003 г.), Российской научно-практической конференции с международным участием «Роль клинической микробиологии в профилактике внутрибольничных инфекций» (26-27.10.2004 г.), XIV съезде национальной организации дезинфекциони-
стов (6-8 октября 2004 г.), конференции Волгоградского НИПЧИ (17-18.06. 2004 г.).
Публикации
Основные положения диссертации отражены в 9 печатных работах.
Внутрибольничные инфекции и меры их профилактики...
В последнее время в различных странах мира регистрируют своеобразное наступление микроорганизмов, вызывающих нозокомиальные инфекции [15, 48, 49,51, 103,144]. В США госпитальное инфицирование пациентов считают основной причиной летальных исходов в стационарах. Так, в 1995 г. от ВБИ умерли более 88 тысяч больных, то есть каждые 6 минут умирал один пациент [149]
В общей структуре инфекционных болезней населения нашей страны эта группа заболеваний занимает заметное место. Данные об эпидемиологической ситуации по ВБИ в Российской Федерации в 1997-2001 г.г. были представлены в программном докладе Г. С. Коршуновой на VIII съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов [36]. Распространенность ВБИ по стационарам различных профилей была следующей: 37,3 % были зарегистрированы в родильных домах (отделениях), 26,2 % - в хирургических стационарах, 15,6 % - в прочих стационарах, 12 % - в амбулаторно-полпклинических учреждениях, 8,6 % - в детских стационарах. В структуре ВБИ в 1999-2001 г.г. доминировали послеоперационные гнойно-септические инфекции (ГСИ) -24,1 %, ГСИ новорожденных - 20,3 % , постинъекционные ГСИ -17,4 %, ГСИ родильниц - 11,2 %, ОКИ - 9,8 %, другие -инфекционные заболевания - 9,9 %.
Среди различных групп ВБИ на долю ГСИ, по данным В. Г. Акимкина, приходится 81,1+4,3 % [2]. В стационарах г. Санкт-Петербурга в 1999 г. ГСИ составляли 65 % [27]. Основной причиной этих заболеваний, по мнению Л. П. Зуевой, является современный лечебно-диагностический процесс, изобилующий множеством манипуляций, в том числе инвазивных. Обсуждая вопросы стратегии борьбы с госпитальными инфекциями и пути ее реализации, автор обращает внимание на необходимость выполнения мероприятий по повышению качества медицинской помощи, на ограничение избыточного числа вмешательств для исключения артифициалыюго механизма передачи возбудителей ГСИ [27].
Роль условно-патогенных микроорганизмов в возникновении ВБИ, прежде всего ГСИ, возрастает с каждым годом [59]. При этом установлено, что значение различных видов условно-патогенных микроорганизмов как возбудителей ВБИ неравнозначно [109].
Многие аналитики обращают внимание на существенные изменения в этиологической структуре ВБИ и отмечают, что за последнее десятилетие зарегистрировано снижение относительных показателей частоты инфекций, обусловленных грамположительными бактериями, и увеличение удельного веса внутри-больничных осложнений, вызванных грамотрицательными микроорганизмами, принадлежащими к семейству энтеробактерий и к группе неферментирующих бактерий [46, 49, 103]. В ряде стран (США, Германия) за десятилетие выявлено 14-кратное повышение частоты ВБИ, вызываемых грамотрицательными микроорганизмами. К моменту окончания исследования они являлись причиной 60% от всех зарегистрированных госпитальных инфекций [16].
Несмотря на заметную роль грамположительных бактерий и грибов в этиологии нозокомиальных инфекций, проблемными возбудителями в нашей стране считают грамотрицательные аэробные микроорганизмы из семейства энтеробактерий и группы неферментирующих бактерий (синепюйная палочка, ацинетобак-теры и другие) [3,7, 14,18, 19,48, 103, 111, 132, 145].
Среди причин, влияющих на уровень заболеваемости ВБИ и их структуру, называют возросшее число лиц с измененным иммунным статусом: в России приблизительно 40 % взрослого населения имеют различные иммунопатологические состояния [58]. Существенное влияние на динамичный рост этих заболеваний оказывают регистрируемое повсеместно старение населения, ухудшение экологической обстановки, увеличение перечня заболеваний и агентов, приводящих к иммуносупрессии. В связи с этим, эпидемиологический надзор за инфекционными (паразитарными) болезнями постепенно становится составной частью системы социально-гигиенического мониторинга за состоянием здоровья населения и среды его обитания [99].
Около 25% всех нозокомиальных инфекций приходится на долю пациентов, госпитализируемых в отделения интенсивной терапии (ОИТ), то есть на ту категорию больных, чье состояние является наиболее тяжелым, а медицинское обеспечение требует значительных затрат.
В информационном письме РАМН и Министерства здравоохранения России "Состояние антибиотикорезистентности грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций в отделениях интенсивной терапии" приведены данные о частоте выделения штаммов грамотрицательных микроорганизмов в десяти ОИТ девяти крупных городов России в 1995-1996 г.г. (Москва - 2 клиники, Санкт-Петербург, Екатеринбург, Казань, Краснодар, Красноярск, Новосибирск, Нижний-Новгород, Смоленск). Наиболее частыми возбудителями ВБИ в этих отделениях являлись: P. aeruginosa - 28,8 %, Е. coli - 21,4 %, К. pneumoniae - 16,7 %, P. mirabilis - 9,7 %, Enterobacter spp. - 8,7 %, Acinetobacter spp. - 7,7 % [89].
Ретроспективный анализ заболеваемости ВБИ в обследованных стационарах
Для выявления незарегистрированных случаев госпитального инфицирования в вышеназванных стационарах был использован метод ретроспективного эпидемиологического анализа заболеваемости ВБИ и ГСИ.
Анализу подлежали данные архивных материалов обследованных стационаров, индивидуальные карты назначений больных, годовые отчеты о числе госпитализированных и оперированных пациентов. Произведена выборка данных из историй болезни пациентов хирургического, урологического и терапевтического отделений МУЗ № 5 и хирургического, урологического, травматологического и терапевтического отделений МУЗ № 12, находившихся на стационарном лечении в 2001-2002 г.г. о развитии симптомокомплекса, свидетельствовавшего об имевшем место внутрибольничном инфицировании в сроки более 48 ч от момента поступления в стационар (повышение температуры, учащение пульса, изменения показателей крови, интоксикация, гнойно-септические осложнения послеоперационного периода, потребовавшие включения в перечень лечебных препаратов антибиотиков).
Выявление случаев внутрибольничного инфицирования было проведено в соответствии с положениями инструктивно-методических документов: «Методических указаний по эпидемиологическому надзору за внутрибольничными инфекциями» [44] и методических рекомендаций «Эпидемиологический надзор за госпитальными гнойно-септическими инфекциями в стационарах хирургического профиля» [101]. Расчет относительных показателей, характеризующих госпитальное инфи цирование пациентов, производили по формуле: [88] Число больных с признаками внутрибольничного инфицирования Заболеваемость ВБИ = х 100 (%) Общее число госпитализированных за год Для отделений хирургического профиля определяли относительный пока затель заболеваемости гнойно-септическими инфекциями: [Ю9] Число больных с гнойно-септическими осложнениями Заболеваемость ГСИ = х 100 (%) Общее число оперированных за год Оценку возможного варьирования величин относительных показателей частоты явления проводили по формуле: [5] Р-(ЮО-Р) 195=2 п Р- процент частоты явления, п - общее число наблюдений зо 2.2. Микробиологический мониторинг 2.2.1. Объекты исследования Объектами бактериологического исследования являлись клинический материал, воздушная среда помещений, смывы с кожи рук и носоготки медицинского персонала, предметов обихода, медицинского инструментария и аппаратуры, растворы антисептиков. Пробы клинического материала (кровь, моча, ликвор, мокрота, отделяемое слизистых оболочек носоглотки, слизистой оболочки влагалища, уретры, бронхиальный лаваж) отбирали с учетом установленного или предварительного клинического диагноза. В хирургических и урологических отделениях дополнительно отбирали отделяемое послеоперационных ран, содержимое абсцессов и выпотов. В палатах реанимации и интенсивной терапии делали смывы с постелей больных, мочеприемников, прикроватных тумбочек, аппаратуры. В общих палатах для больных производили смывы со стен, подоконников, раковин для мытья рук, предметов обихода.
Точки отбора проб с объектов внешней среды стационаров выбирали с учетом возможных факторов передачи инфекции на всех этапах пребывания больного (операционные и предоперационные блоки, отделения реанимации и интенсивной терапии, перевязочные, процедурные кабинеты, палаты [66].
Отбор проб воздушной среды проводили седиментационным методом в операционных блоках, родзалах, перевязочных, процедурных, отделениях реанимации и интенсивной терапии, послеоперационных палатах [66]. Смывы с предметов госпитальной среды стационаров производили марлевыми тампонами, смоченными в стерильном 0,9 % растворе хлорида натрия, в операционных блоках, перевязочных, процедурных, родзалах, послеоперационных, послеродовых, палатах реанимации и интенсивной терапии Объем каждой пробы не превышал 3 мл. Для бактериологического контроля эффективности обработки кожи операционного поля и рук хирургов готовили смывы с этих объектов.
Контроль обсемененности объектов внешней среды стационаров микроорганизмами, их обнаружение и последующую идентификацию изолированных микроорганизмов осуществляли в соответствии с приказом Минздрава № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» [66], «Методическими рекомендациями по определению грамотрицательных потенциально патогенных возбудителей внутрибольничных инфекций» [55] и «Методическими рекомендациями по бактериологической диагностике синегнойной инфекции» [40].
Чувствительность выделенных и идентифицированных штаммов микроорганизмов в отношении химиотерапевтических препаратов, применявшихся в стационарах в 2001-2002 г.г. определяли диско-диффузионным методом в соответствии с «Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом их диффузии в агар с использованием дисков» [43] и методическим письмом «Определение антибиотикочувствителыюсти микрофлоры диско-диффузионным методом» [54].
Использовали препараты пенициллинового ряда (ампициллин, карбеницил-лин), тетрациклинового ряда (тетрациклин, доксициклин), макролиды (эритромицин, ванкомицин), цефалоспорины (цефазолин, цефотаксим, цефтазидим), ами-ногликозиды (амикацин, гентамицин, канамицин, неомицин, тобрамицин), фтор-хинолоны (офлоксацин, цппрофлоксацин, таривид), карбапенемы (имипенем), а также полимиксин, рифампицин, левомицетин, линкомицин, производное нитро-фурана (фурадонин).
Для определения антимикробной активности дезинфицирующих средств в отношении ряда изолированных штаммов микроорганизмов применяли 10 препаратов, относящихся к 3 различным классам соединений. Краткая характеристика этих препаратов представлена в Методика определения чувствительности микроорганизмов в отношении этих препаратов состояла в использовании дисков, пропитанных рабочими концентрациями дезинфицирующих средств. В растопленный и охлажденный до 45 С 2 % МПА вносили взвесь выделенных в стационаре микроорганизмов, содержащую 108 м.к./мл. Содержимое пробирки выливали в чашки Петри. На поверхность застывшего агара накладывали стерильные бумажные диски диаметром 6 мм, пропитанные рабочими растворами исследуемых дезинфицирующих средств. Контролем служили бумажные диски, не содержащие антимикробных компонентов. Чашки помещали в термостат при 37 С. Учет результатов производили через 24-48 ч по величине зоны задержки роста микроорганизмов (в мм), измеряемой от края диска до границы роста микроорганизмов вокруг него: зона задержки роста меньше 2 мм - неэффективное дезинфицирующее средство, 2-4 мм - умеренно эффективное дезинфицирующее средство, 4-7 мм - эффективное дезинфицирующее средство, более 7 мм - высокоэффективное дезинфицирующее средство.
Определение спектра антибиотикочувствительности выделенных изолятов
В качестве метода экспресс-обнаружения P.aeruginosa в пробах из объектов внешней среды стационаров и в пробах клинического материала использовали МФА с экспериментальными образцами иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих синегнойных моноклональных.
Получение иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих моноклональных против антигенов P. aeruginosa Экспериментальные образцы флуоресцирующих антител получали на основе 5 типов моноклональных антител (МКА) к антигенам P. aeruginosa, продуцируемых мышиными гибридомами из коллекции перевиваемых клеточных культур лаборатории иммунодиагностики и биотехнологии Волгоградского НИПЧИ.
Накопление МКА для изготовления экспериментальных образцов препаратов проводили in vivo согласно разделу 1.9 "Методических рекомендаций по получению гибридом-продуцентов моноклональных антител к липополисахариду и экзотоксину А синегнойной палочки" [42].
Из накопленных в асцитической жидкости (АЖ) мышей линии BALB/c методом сульфатного осаждения белка выделяли МКА [37]. Содержание белка в образцах иммуноглобулинов, освобожденных от сульфата аммония, определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Специфическую активность полученных образцов МКА оценивали с помощью твердофазного иммунофер-ментного метода (ТИФМ) и непрямого метода флуоресцирующих антител (НМФА). Охарактеризованные МКА метили флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) по методу Marshall et al. [131]. Нагрузка ФИТЦ на 1 г белка составляла 25 мг. Условия конъюгирования (рН среды и время коньюгирования) варьировали с учетом свойств моноклональных белков [73]. Очистку коньюгата от немеченого белка и не связавшегося красителя проводили на колонке с сефадексом G-25, используя для элюирования 0,1М фосфатный буфер, рН 7,2.
Свойства меченных флуорохромом иммуноглобулинов оценивали общепринятым способом (37) с использованием фиксированных мазков-препаратов клеток типовых штаммов синегнойной палочки (P. aeruginosa Н-1, Н-2, Н-3,... Н-12, всего 12 серотипов по классификации Habs), приготовленных из взвесей с концентрацией 5-Ю -1-10 м.к./мл.После определения спектра специфической активности флуоресцирующих MICA, в отношении типовых штаммов P.aeruginosa образцы препаратов, приготовленные на основе МКА, взаимодействовавших с наибольшим числом серотипов синегнойной палочки, но не реагировавших на присутствие других видов псевдомонад, использовали для окраски мазков-препаратов, приготовленных из проб с объектов внешней среды стационаров и клинического материала. 2.3.3. Исследование проб смывов с объектов внешней среды и клинического материала в МФА
Для проведения этапов экспресс-обнаружения синегнойной палочки из материала исследуемых проб готовили мазки-препараты для МФА. Жидкие пробы объемом более 10 мл предварительно концентрировали методом мембранной фильтрации на фильтрах с диаметром пор 0,45 мкм. Мазки-преиараты готовили на хорошо обезжиренных предметных стеклах, высушивали на воздухе и фиксировали в 96 % этиловом спирте в течение 20 мин без последующего обжигания. Мазки-препараты окрашивали экспериментальными образцами иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих синегнойных моноклональных в рабочем разведении согласно общепринятым рекомендациям. Окрашивание мазков-препаратов, приготовленных из материала проб с объектов внешней среды стационаров, проводили с обязательным гашением неспецифической флуоресценции [37]. Контрастирование достигалось использованием специфического препарата в смеси с бычьим альбумином, меченным родамином.
При поиске P. aeruginosa в каждом мазке-препарате просматривали 25 полей зрения. Учет результатов осуществляли визуально по 4-крестовой системе регистрации интенсивности свечения микробных клеток. Обнаружение единичных м.к. (не менее 3-5) в 25 полях зрения, обладающих специфическим свечением на 3+4+, являлось основанием для выдачи ориентировочного положительного ответа. Отрицательный результат МФА свидетельствовал либо об отсутствии синегнойной палочки в исследуемом объекте, либо о том, что ее концентрация в данной пробе была ниже, улавливаемой с помощью МФА.
Методы статистической обработки результатов опытов
Внутриболышчное инфицирование пациентов, временно находящихся на стационарном лечении, регистрируют в больницах различного профиля. Данные официальной статистики о частоте их возникновения остаются неполными или вовсе отсутствуют [52, 60, 83]. Это связано с тем, что единые критерии диагноза ВБИ и единые критерии оценки уровня заболеваемости госпитальными инфекциями не разработаны, что затрудняет анализ эпидемически неблагополучной ситуации в конкретном ЛПУ [2, 23, 60, 88]. В отсутствие штатных эпидемиологов в подавляющем большинстве больниц учет госпитальных инфекций чаще всего проводят лечащие врачи по системе внутреннего учета, не выходящей за рамки конкретного стационара.
При существующем порядке эпидемиологического надзора за ВБИ данные, поступающие в центры Госсанэпиднадзора, не в полной мере отражают уровень госпитального инфицирования пациентов в тех или иных подразделениях стационаров. В связи с этим, в публикациях последних лет ряд авторов высказывают мнение о том, что на сегодняшний день система эпидемиологического надзора в стационарах нашей страны не получила широкого распространения и не функционирует в полном объеме [10, 36, 103].
Для получения объективных данных о частоте госпитального инфицирования пациентов проводят ретроспективный анализ заболеваемости ВБИ, позволяющий вскрыть особенности эпидемической ситуации в ЛПУ, объяснить причины и условия возникновения и распространения заболеваний в стационарах различного профиля. Он призван определить время риска, группы риска, места и факторы риска, дать оценку эффективности проведенным противоэпидемическим мероприятиям. Полученные данные служат основой для разработки адекватного комплекса мер борьбы с ВБИ и их профилактики [10, 60]. В рамках настоящей работы было установлено, что объективная информация о частоте возникновения ВБИ в МУЗ № 5 и МУЗ № 12 отсутствует. На протяжении ряда лет в центр Госсанэпиднадзора Краснооктябрьского района поступали неполные сведения о регистрации спорадических заболеваний ВБИ, что не могло не отражаться на своевременности и качестве выполнявшихся в этих ЛПУ профилактических и противоэпидемических мероприятий.
Для оценки эпидемической ситуации в вышеназванных стационарах, определения уровня и структуры госпитального инфицирования пациентов и выявления незарегистрированных (недиагностированных) случаев этих инфекций был проведен ретроспективный анализ заболеваемости ВБИ. Первоначальный этап сбора информации состоял в экспертизе данных историй болезни всех пациентов, находившихся на лечении в хирургическом, урологическом и терапевтическом отделениях МУЗ № 5 и хирургическом, урологическом, травматологическом и терапевтическом отделениях МУЗ № 12 в 2001-2002 г.г. Из общего числа историй болезни пациентов были отобраны истории болезни лиц с признаками внутриболышчного инфицирования и произведен расчет частотных показателей заболеваемости ВБИ в перечисленных выше отделениях больниц и показателей заболеваемости ГСИ в отделениях хирургического профиля. Результаты этого этапа работы представлены в таблице 2 и на рисунках 1 и 2.
Ретроспективный анализ заболеваемости ВБИ показал, что в отделениях МУЗ № 5 и МУЗ № 12 частота спорадических случаев заболеваний госпитальными инфекциями колебалась в диапазоне значений относительных показателей от 12,4 % до 29,0 % в 2001 г. и от 11,9 % до 30,7 % в 2002 г. Поскольку не существует единых критериев предельно допустимых значений заболеваемости ВБИ для отделений различного профиля, анализ полученных результатов был проведен с учетом тех усредненных показателей по стране, которые были представлены на VIII съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Таблица 2. Ретроспективный анализ заболеваемости ВБИ в стационарах № 5 и № 12 за 2001 -2002 гг.
Частота выявленных случаев ВБИ в терапевтическом отделении МУЗ № 5 в 2001-2002 гг. не превышала значении относительного показателя для общесоматических отделений, зарегистрированных в 2001 г. в Российской Федерации (15,6 %). Подобная ситуация была отмечена и в терапевтическом отделении МУЗ № 12 в 2001 г. Однако в 2002 г. относительный показатель заболеваемости ВБИ в терапевтическом отделении МУЗ № 12 вырос более, чем в 2 раза, достигнув значений 30,77 %, достоверно отличаясь от показателя за-блеваемости ВБИ в аналогичных подразделениях по стране (р 0,05). Столь существенные отличия в уровнях заболеваемости ВБИ в условиях одного и того же отделения были связаны с заносом и последующим распространением среди пациентов и персонала острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ). Косвенным показателем повышения частоты возникновения внутри-больничного инфицирования в этом отделении в 2002 г. являлись также данные о включении в схему лечения 33 % больных антибиотиков. Одним из факторов риска возникновения ВБИ в этом отделении в 2002 г. следует считать рост числа госпитализированных больных с пиелонефритом (в 2 раза) по сравнению с 2001 г.
Для отделений хирургического профиля были определены уровени заболеваемости ВБИ и ГСИ. Известно, что последние доминируют в структуре осложнений, регистрируемых у оперированных пациентов [16, 27, 36, 109]. Различия частоты ГСИ в отделениях хирургического профиля обусловлены спецификой работы этих стационаров. Согласно классификации групп внутри-больничных инфекций, предложенной В. Г. Акимкиным [2], на долю ГСИ приходится 81,1 ± 4,3 % от числа выявленных случаев ВБИ.
Анализ полученных данных свидетельствовал о том, что относительные показатели заболеваемости ВБИ в хирургических отделениях обследованных стационаров в 2001 и 2002 г.г. не превышали значений усредненного показателя по Российской Федерации за 1997-2001 г.г. (26,2 %). Частота возникновения ГСИ в них также не превышала пороговых значений. При сравнении относительных показателей заболеваемости ВБИ и ГСИ по годам в МУЗ № 5 и МУЗ № 12 установлено, что в МУЗ № 5 в 2002 г. заболеваемость ВБИ и ГСИ достоверно увеличилась (р 0,05). В хирургическом отделении МУЗ №12 существенных изменений в частоте возникновения ВБИ и ГСИ не отмечено.
Что касается урологических отделений вышеназванных больниц, то прежде всего необходимо отметить, что их, согласно существующему мнению, можно отнести к подразделениям повышенного риска инфицирования возбудителями ВБИ [27, 133, 142]. В урологических отделениях различных стационаров России регистрируют от 32 до 50 % случаев ВБИ [27, 88].
В урологических отделениях МУЗ № 5 и МУЗ № 12 уровень заболеваемости ВБИ колебался в диапазоне 11,89 - 29,05 %. При этом относительный показатель заболеваемости ГСИ в 2001 г. в МУЗ № 5 был равен 77,67 %, в МУЗ № 12 - 72,97 %, приближаясь к пороговым значениям и являясь предвестником увеличения масштабов госпитального инфицирования пациентов. В 2002 г. показатель заболеваемости ГСИ в урологическом отделении МУЗ № 12 превысил пороговые нормы (86,01+3,78 %), создав предпосылки для осложнения эпидемиологического неблагополучия по ВБИ.
