Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Понятие об «Инфекции» 10
1.2. Нозокомиальные инфекции 11
1.3. Эпидемиология нозокомиальных инфекций 13
1.4. Патогенез нозокомиальных инфекций 15
1.5. Этиология нозокомиальных инфекций 17
1.6. Структура нозокомиальных инфекций 20
1.6.1. Нозокомиальные инфекции мочевыводящих путей 20
1.6.2. Нозокомиальные инфекции дыхательных путей 21
1.6.3. Нозокомиальные раневые инфекции 23
1.6.4. Ангиогенные (катетерассоциированные) инфекции 27
1.7. Антимикробная резистентность приоритетных патогенов ВБИ 29
1.8. Методы детекции БЛРС 39
1.9. Исследования распространения антибиотикорезистентности 41
1.10. Профилактика распространения антибиотикорезистентности 44
Собственные исследования 46
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Пациенты 46
2.2. Штаммы 47
2.3. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам 49
2.4. Детекция генов р-лактамаз с помощью ПЦР 57
2.5. Статистическая обработка данных 62
Глава 3. Микробиологический мониторинг ведущих патогенов ВБИ в ДГКБ № 9 64
Глава 4. Антимикробная резистентность патогенов 69
4.1. Антимикробная резистентность патогенов 69
4.1.1. P. aeruginosa 69
4.1.2. A. baumannii 70
4.1.3. К. pneumoniae 72
4.1.4. E.coli 74
4.1.5. Enterobacter spp 77
4.2. Анализ потребления антибактериальных препаратов в группе пациентов, вошедших в исследование 79
Глава 5. Детекция генов b-лактамаз 81
5.1. Детекция генов р-лактамаз класса А энтеробактерий 81
5.2. Детекция генов металло-р-лактамаз класса В 85
Глава 6. Антибиотикочувствительность продуцентов b-лактамаз 86
6.1. К. pneumoniae 86
6.1.1. Антибиотикочувствительность штаммов К. pneumoniae, продуцирующих р-лактамазы разных типов 86
6.1.2. Сравнительный анализ антибиотикочувствительности штаммов К. pneumoniae - продуцентов и непродуцентов ESBL 88
6.2. Е. coli 92
6.2.1. Антибиотикочувствительность штаммов Е. coli, продуцирующих b-лактамазы разных типов 92
6.2.2. Сравнительный анализ антибиотикочувствительности штаммов Е. coli - продуцентов и непродуцентов ESBL 94
6.3. Enterobacter spp 97
6.4. P. aeruginosa 97
Глава 7. Обсуждение результатов 101
Выводы 111
Практические рекомендации 112
Литература 114
Приложение 131
- Антимикробная резистентность приоритетных патогенов ВБИ
- Детекция генов р-лактамаз с помощью ПЦР
- Детекция генов р-лактамаз класса А энтеробактерий
- P. aeruginosa
Введение к работе
Актуальность проблемы: Внутрибольничные инфекции остаются одной из острейших проблем в современном здравоохранении во всем мире. Несмотря на противоэпидемические мероприятия, частота их возникновения, летальность от них и стоимость терапии ВБИ продолжает возрастать [Levy S. B. et al.]. В основном это связано с ростом и распространением госпитальных штаммов, резистентных к антимикробным препаратам, что является серьёзным фактором, влияющим как на клинический исход, так и приводящим к значительному увеличению затрат на лечение инфекций [Levy S. B. et al; Wise R. et al.]. В развитых странах ВБИ развиваются у 5-10% госпитализированных пациентов [Weinstein R. A.]. В развивающихся странах показатель распространенности ВБИ превышает таковой в 2-20 раз [Дехнич А. В. и соавт.]. В РФ из-за отсутствия единой системы регистрации ВБИ, специфики сбора и анализа данных показатели распространенности ВБИ искусственно занижены. По данным государственного доклада Главного государственного санитарного врача РФ «О санитарно-эпидемиологической обстановке в РФ в 2008 году», в России зарегистрировано 25456 случаев ВБИ или 0,8 на 1000 пациентов, что не отражает истинной заболеваемости ВБИ. Низкий уровень заболеваемости обусловлен недоучётом таких нозологических форм, как инфекции мочевыводящих путей, пневмонии, инфекции области хирургического вмешательства, гнойно-септические инфекции у новорождённых и др. [Роспотребнадзор]. По данным проспективных исследований ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, ежегодное количество ВБИ в РФ составляет не менее 2-2,5 млн, а ежегодные экономические потери — более 5 млрд. рублей [Страчунский Л. С. и соавт.].
Сегодня в клинической практике основную проблему составляют грамотрицательные патогены, продуцирующие -лактамазы, среди которых наибольшие трудности для лечения инфекционных осложнений создают БЛРС и МБЛ. Синтез грамотрицательными бактериями этих ферментов обусловливает неэффективность целой группы антибиотиков — -лактамов.
Мониторинг ВБИ, их патогенов, профиля устойчивости к используемым антимикробным препаратам в совокупности с мероприятиями по инфекционному контролю в каждом конкретном стационаре может способствовать снижению заболеваемости ВБИ и резистентности патогенов.
Цель исследования: определить антибиотикочувствительность грамотрицательных факультативно-анаэробных и аэробных бактерий к антибактериальным препаратам и выявить механизмы резистентности госпитальных штаммов энтеробактерий и P. aeruginosa к -лактамам, для оптимизации антибактериальной терапии внутрибольничных инфекций в ДГКБ № 9 им. Г. Н. Сперанского.
Задачи исследования. Для достижения указанной цели исследования представлялось необходимым решение следующих задач:
-
Определить этиологическую структуру приоритетных грамотрицательных факультативно-анаэробных и аэробных патогенов нозокомиальных инфекций в ОРИТ и отделениях хирургического профиля ДГКБ № 9 им. Г. Н. Сперанского.
-
Оценить антибиотикочувствительность к широкому спектру антибактериальных препаратов грамотрицательных патогенов, выделенных при ВБИ различной локализации.
-
Провести фенотипический скрининг -лактамаз расширенного спектра действия среди представителей семейства Enterobacteriaceae и металло-бета-лактамаз P. aeruginosa.
-
Провести детекцию наиболее распространенных типов -лактамаз у подозрительных на их продукцию госпитальных штаммов энтеробактерий и P. aeruginosa.
-
Оценить адекватность назначения антибактериальной терапии ВБИ в исследуемой группе пациентов.
-
Дать рекомендации по эффективной антибактериальной терапии ВБИ на основе данных антибиотикочувствительности и характеристики генотипов патогенов.
Научная новизна полученных результатов:
На основе единого методического подхода проведено комплексное микробиологическое обследование хирургических больных при различных формах ВБИ, что позволило получить наглядное представление о роли определенных патогенов в этиологии ВБИ в конкретном стационаре.
Определены проблемные патогенны ВБИ для ОРИТ и хирургических отделений ДГКБ № 9 им. Г. Н. Сперанского.
Проведён мониторинг антибиотикочувствительности приоритетных патогенов гнойно-септических осложнений, который показал высокую активность таких антибактериальных препаратов, как карбапенемы, цефоперазон/сульбактам, цефепим, амикацин, ципрофлоксацин.
Определен фенотип и генотип резистентности приоритетных патогенов ВБИ в стационаре.
На основании мониторинга предложены различные варианты рациональной антимикробной химиотерапии ВБИ у больных ОРИТ и отделениях хирургического профиля ДГКБ № 9 им. Г. Н. Сперанского.
Практическая значимость исследований. Работа является фрагментом плановой темы НИР кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова: «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований», № госрегистрации 01.2.006.06352.
Положения, выносимые на защиту:
-
Приоритетные патогены ВБИ в ОРИТ и отделениях хирургического профиля ДГКБ № 9: P. аeruginosа, A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli, Enterobacter spp.
-
Карбапенемы обладают наибольшей активностью по отношению ко всем изученным патогенам. Высокая активность наблюдалась у цефоперазон/сульбактама, цефепима, амикацина, ципрофлоксацина.
-
Фенотипический скрининг выявил: 12,8% штаммов P. аeruginosа, подозрительных на выработку ферментов МБЛ класса В; 79% штаммов K. pneumoniae и 78% штаммов E. coli, подозрительных на выработку БЛРС-ферментов.
-
12,8% штаммов P. aeruginosa содержат blaVIM гены, кодирующие металло-бета-лактамазы. Среди K. pneumoniae гены -лактамаз расширенного спектра действия имеют 61,5% штаммов и -лактамаз широкого спектра действия 71,2% штаммов. У клебсиелл чаще встречается комбинация blaSHV-1 и blaТЕМ-1 генов, кодирующих -лактамазы широкого спектра действия, и blaCTX-М1 генов, кодирующих БЛРС-ферменты, в 23,1% случаев. Среди E. coli гены БЛРС-ферментов и -лактамаз широкого спектра действия содержат 52,2% штаммов. Наиболее часто у E. coli встречается blaТЕМ-1 гены, кодирующие -лактамазы широкого спектра, и их комбинация с blaCTX-М1 генами, кодирующими -лактамазы расширенного спектра действия.
-
Наиболее активные в отношении изолированных патогенов препараты вошли в спектр получаемых пациентами антибактериальных средств.
-
Изучена активность широкого ряда антибактериальных препаратов в отношении различных генотипов приоритетных патогенов ВБИ в ОРИТ и отделениях хирургического профиля в ДГКБ № 9 им. Г. Н. Сперанского. Полученные результаты послужили основой для разработки практических рекомендаций по рациональному применению антибиотиков у детей в ДГКБ № 9 им. Г. Н. Сперанского.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в работу:
лаборатории клинической микробиологии и иммунологии ДГКБ № 9 им. Г. Н. Сперанского (Москва);
в деятельность военно-медицинских подразделений воинской части 1199;
в учебный процесс на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО ММА им. И. М. Сеченова.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на:
научной конференции кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО ММА им. И. М. Сеченова;
IX Международном конгрессе по антимикробной терапии Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ), 30 мая – 01 июня 2007 года, Москва.
научно-практической конференции воинской части 1468 (25 февраля 2009 г.);
совместной научной конференции кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО ММА им. И. М. Сеченова и бактериологической лаборатории ДГКБ № 9 им. Г. Н. Сперанского (11 декабря 2009 года, протокол № 2).
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах выполненных в соавторстве, автором лично было проведено моделирование процессов, мониторинг основных параметров, аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической и клинико-бактериологической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.
Публикации. По теме диссертации опубликованы 14 работ, в том числе 9 в центральных журналах, рекомендованных ВАК, издано 1 пособие для врачей.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, семи глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка цитируемой литературы и приложения. Работа включает 131 страницу текста; 26 таблиц; 39 рисунков. Список литературы содержит 228 источников, из них 70 отечественных и 158 зарубежных.
Антимикробная резистентность приоритетных патогенов ВБИ
Знание основных тенденций резистентности к антибиотикам наиболее приоритетных патогенов ВБИ необходимо при выборе антибиотика для конкретного больного, а также при разработке программ эмпирической антибактериальной терапии в стационаре.
Резистентность микроорганизмов к антибактериальным препаратам может быть либо природной, либо приобретённой. Истинная природная устойчивость является постоянным видовым признаком и характерна для подавляющего большинства штаммов определенного вида микроорганизмов. В случае природной резистентности клиническая неэффективность антибиотика является легко прогнозируемой на основании данных видовой идентификации. Под приобретенной устойчивостью понимают свойство отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при тех концентрациях антибиотиков, которые подавляют основную часть микробной популяции. Формирование резистентности во всех случаях обусловлено генетически: мутациями или изменением уровня экспрессии собственных генов или приобретением новой генетической информации [36].
Известны следующие механизмы развития резистентности к антибиотикам [36, 172]:
1. Нарушение проницаемости внешних структур микробной клетки;
2. Инактивация антибиотиков бактериальными ферментами, такими как Р-лактамазы и ферменты, модифицирующие аминогликозиды;
3. Модификация мишени действия антибиотиков (пенициллинсвязывающих белков, ДНК-гиразы или РНК-полимеразы);
4. Активное выведение антибиотика из микробной клетки (эффлюкс);
5. Защита мишени действия антибиотиков. Нарушение проницаемости внешних структур микробной клетки.
Проникновение антибиотиков через наружную и цитоплазматическую мембрану является сложным процессом. Мутации могут приводить к изменению структуры мембраны, что частично или полностью препятствует проникновению антибиотиков и обусловливает повышение антибиотикоустойчивости. Указанный механизм встречается практически среди всех грамотрицательных бактерий, обычно в сочетании с другими механизмами [36, 78].
Инактивация ферментами.
Наиболее распространенным _ механизмом _. устойчивости микроорганизмов к В-лактамным антибиотикам является их ферментативная инактивация в результате гидролиза одной из связей В-лактамного кольца ферментами р-лактамазами. К настоящему времени описано более 500 ферментов, различающихся по следующим практически важным свойствам:
1. субстратному профилю (способности к преимущественному гидролизу тех или иных р-лактамов);
2. чувствительности к применяющимся в медицинской практике ингибиторам: клавулановой кислоте, сульбактаму, тазобактаму;
3. характеру продукции (стабильной, на высоком или низком уровне, или индуцибельной). Эта характеристика, наряду с субстратным профилем фермента, определяет возможность формирования резистентности;
4. источнику и локализации кодирующих генов. Видоспецифические Р-лактамазы кодируются хромосомно. Гены приобретенных ферментов часто входят в состав конъюгативных плазмид и мобильных генетических элементов (транспозонов, бактериофагов и интегронов) [36]. При появлении генетически обусловленных механизмов резистентности возможны концентрация и передача внехромосомной ДНК с помощью плазмид и мобильных генетических элементов, что может привести к распространению генов, кодирующих резистентность к антибиотикам, среди бактерий. Плазмиды являются внехромосомными генетическими элементами. Они обладают свойством саморепликации и могут передаваться в бактериальной популяции от клетки-донора к клетке-реципиенту при конъюгации. Транспозоны обнаружены у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Благодаря им происходит широкое распространение генов резистентности на различных плазмидах даже среди неродственных бактерий. Интегроны имеют детерминанты резистентности, обнаруженные на небольших мобильных элементах, названных кассетными генами, которые включают один ген и один рекомбинантный сайт [78].
В настоящее время используется структурная и функциональная системы классификации р-лактамаз. Все известные в настоящее время Р-лактамазы делят на 4 молекулярных класса, в пределах которых ферменты характеризуются общностью свойств и выраженной гомологией [72]. Ферменты класса В относятся к металлоэнзимам, поскольку в качестве кофермента в них присутствует атом цинка. Р-лактамазы классов А, С и D относятся к ферментам «серинового» типа (по аминокислоте, находящейся в активном центре фермента) [44]. Исчерпывающие данные по классификации Р-лактамаз сформулированы К. Bush и соавт. [92]. В сокращённом виде классификация представлена в табл. 1.7.
В настоящее время наибольшее значение для клинической практики имеют Р-лактамазы нескольких групп: р-лактамазы расширенного спектра грамотрицательных бактерий (БЛРС), цефалоспориназы (АтрС) грамотрицательных бактерий, металло-Р-лактамазы (МБЛ) грамотрицательных бактерий [36].
Модификация мишени действия.
Мишенью действия антибиотиков могут являться различные ферменты, рибосомы, нуклеотидные последовательности. Так мишенью действия Р-лактамных антибиотиков являются пенициллин связывающие белки, участвующие в синтезе клеточной стенки бактерий. В результате модификаций у некоторых пенициллинсвязывающего белка (ПСБ) уменьшается сродство к р-лактамам, что проявляется в повышении минимальной подавляющей концентрации (МІЖ) этих препаратов и снижении клинической эффективности [36].
Активное выведение антибиотика из микробной клетки (эффлюкс).
Широко распространённый механизм устойчивости грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов к различным антибиотикам, таким как Р-лактамы, фторхинолоны, макролиды, линкозамиды, тетрациклины, реализуемый различными системами эффлюкса. Так, как минимум, три хорошо изученные системы эффлюкса участвуют в выведении Р-лактамов из периплазматического пространства у P. aeruginosa и обеспечивает природную устойчивость данного возбудителя к таким антибиотикам, как цефотаксим и цефтриаксон. Повышение активности эффлюксных систем приводит к формированию резистентности к карбапенемам [36].
Защита мишени действия.
Появился новый механизм устойчивости к фторхинолонам, который обусловлен синтезом белков, препятствующих взаимодействию препаратов с мишенями действия. Наибольшее опасение связано с плазмидной локализацией генов, кодирующих синтез этих белков [36].
В этиологической структуре ВБИ в ОРИТ ведущая роль принадлежит грамотрицательным микроорганизмам и стафилококкам [69].
Детекция генов р-лактамаз с помощью ПЦР
При отборе штаммов для генетического исследования учитывались следующие критерии:
Для неферментирующих грамотрицателъных аэробных (хотя бы один из признаков):
устойчивость (промежуточная или высокая) к цефтазидиму;
устойчивость (промежуточная или высокая) к карбапенемам;
положительный результат скрининга P. aeruginosa на продукцию металло-бета-лактамаз.
Для энтеробактерий (хотя бы один из признаков):
устойчивость (промежуточная или высокая) хотя бы к одному из цефалоспоринов III поколения;
устойчивость (промежуточная или высокая) к защищенным пенициллинам;
устойчивость (промежуточная или высокая) к карбапенемам;
положительный тест на продукцию (3-лактамаз расширенного спектра.
Проведение пробоподготовки.
1. Для приготовления суспензии использовали суточную агаровую культуру исследуемых микроорганизмов, выращенных на агаре Mueller-Hinton (№ 51075 по каталогу«ВіоМегіеих», Франция). 3-5 репрезентативных колоний вносили в пробирку с 300 мкл деионизированной воды («BioMerieux», Франция).
2. Перемешивали 15 секунд на устройстве типа персональный вортекс (250-3000 об/мин), «BioSan», Латвия.
3. Центрифугирование взвеси микроорганизмов на центрифуге «Eppendorf», (Германия), со скоростью 10 тыс. об/мин 2 минуты с последующим удалением надосадочной жидкости.
4. Осадок ресуспендировали в стерильном ТЕ-буфере («Хеликон», Россия).
5. Пробы помещали в твёрдотельный термостат «Eppendorf», (Германия), при +99 С в течение 20 минут.
6. После инкубирования все пробирки с пробами немедленно охлаждали во льду в течение 10 минут.
7. Центрифугирование в течение 3 минут при 10 тыс. оборотов в минуту на высокоскоростной центрифуге «Eppendorf», (Германия).
8. Полученный в результате высокоскоростного центрифугирования супернатант отбирали в новые пластиковые асептические пробирки «Eppendorf», (Германия), ёмкостью 2,0 мл для дальнейшего изучения.
9. Хранение супернатанта осуществляли при -70 С.
Детекция генов, кодирующих Ь-л актам азы класса А (ТЕМ-, SHV, СТХ-типов) и СТХ-группы.
Полимеразную реакцию проводили в ПЦР-пробирках на 0,6 мл («QSP», США) в объёме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили: lxTaq ДНК полимеразный буфер, 1 ЕД Taq ДНК полимераза («СибЭнзим», Россия), 200 мкмоль дезоксинуклиотидов трифосфатов, по 15 пмоль прямого и обратного праймера и 5 мкл раствора матрицы ДНК. Амплификация проводилась в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) по стандартному протоколу: денатурация в течение 2 минут при 94С, затем 30 циклов амплификации (45 секунд денатурация при 94С, 1 минута отжиг праймеров при оптимальной температуре, 1 минута элонгации при 72С), затем 10 минут финальная элонгация при 72С.
Для амплификации генов, связанных с механизмами устойчивости к р-лактамным антибиотикам — blaTEM, blaSuv, Ь/асгх-м и подгрупп типа ЫаСтх-м, применялись составленные с использованием компьютерной базы данных GeneBank. (http://www.ncbi.nim.nih.gov) праймеры, последовательности которых представлены в табл. 2.3.
Анализ продуктов амплификации проводили в 2%-ном агарозном геле с использованием оборудования для ПЦР-детекции (камеры для горизонтального электрофореза, источник питания для электрофореза «Эльф-4», трансиллюминатор с системой гельдокументирования), производства «ДНК-Технология», Россия. Минисеквенирование р-лактамаз ТЕМ-типа.
Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили: 66 мМ трис-HCL (рН=9.0, «Sigma», США); 25 мМ магния хлорида («Sigma», США); 16 мМ аммония сернокислого («Sigma», США); 0,1% раствор желатина; 0,05% раствор твин-20 («Sigma», США); 5% глицерин; раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (НТФ) (НПО «Вектор», Новосибирск), концентрация каждого дНТФ - 250 мкМ; 1 ед. Taq-полимеразы (НПФ «Литех», г. Москва); по 20 пмоль прямого и обратного праймера (TEM-fw и TEM-rev) и 5 мкл раствора матрицы ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе РТС-240 DNA Engine Tetrad2 («MJ Research» «Bio-Rad», США) по следующему протоколу: денатурация в течение 2 минут при 94С, затем 35 циклов амплификации (30 секунд денатурация при 94С, 10 секунд отжиг праймеров при 55С, 20 секунд элонгация при 72С).
Анализ продуктов амплификации проводили в 2%-ном агарозном геле.
Для дефосфорилирования 5 -концевых фосфатных групп dNTP, продукты амплификации гена ТЕМ инкубировали с 0,5 ед. фосфатазы арктических креветок («Promega», США) в течении 30 минут при 37С с последующей инактивацией фермента прогреванием в течении 10 минут 85С.
Реакцию термоциклического минисеквенирования проводили в реакционной смеси: 66 мМ Tris-HCI рН 9,0; 16,6 мМ (NH,)2S04; 2,5 мМ MgCh; по 0,2 мМ необходимых dNTP и/или ddNTP; по 40 пмоль каждого праймера (табл. 2.4.) и 2 ед. TermiPol DNA Polymerase («Solis Biodyne», Эстония), используя в качестве матрицы амплифицированные фрагменты гена ТЕМ. Наработку продуктов минисеквенирования осуществляли по профилю: 94С — 20 секунд, 49С — 20 секунд, 72С — 20 секунд, 70 циклов, в амплификаторе DNA Engine Tetrad («MJ Research», США).
Очистку продуктов минисеквенирования проводили с помощью SpectroCLEAN Kit («Sequenom», США) согласно инструкции фирмы-производителя. Аликвоту образца (0,2-1 мкл), полученного после процедуры очистки, наносили на высушенную на мишени AnchorChip (400 мкм, «Bruker Daltonics», Германия) матрицу, приготовленную из насыщенного раствора 3-гидроксипиколиновой кислоты («Fluka», Германия) в 50% ацетонитриле («Merck», Германия) с добавлением 10 г/л цитрата аммония двухосновного («Fluka», Германия) и высушивали на воздухе. Все использованные растворители, включая воду («Merck», Германия), были только аналитической чистоты или специальные для масс-спектрометрии.
Масс-спектрометрический анализ осуществляли с помощью MALDI ToF масс-спектрометра Microflex («Bruker Daltonics», Германия), оснащенного азотным лазером (А.=337 нм) с частотой импульсов до 20 Гц. Все измерения проводили в линейном режиме, детектируя положительно заряженные ионы. Для получения каждого масс-спектра использовали 30 импульсов лазера с мощностью излучения, установленной на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца. Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы «Bruker Daltonics» (Германия): flexControl 2.4 (Build 38) и flexAnalysis 2.4 (Build 11).
По наличию в масс-спектрах продуктов реакции пиков, соответствующих ионам определенной ожидаемой молекулярной массы, судили о нуклеотидном контексте в данном положении. Праймеры, использованные для минисеквенирования генов Р-лактамаз ТЕМ-типа, представлены в табл. 2.4.
Детекция генов р-лактамаз класса А энтеробактерий
Обнаружены у 48 изолятов энтеробактерий из 79 исследованных (60,8%, д. и. 49,1-71,2%): у 34 (65,4 % от числа всех клебсиелл, д. и. 50,9-78,0%,) штаммов К. pneumoniae, у 12 (52,2 % от числа всех кишечных палочек, д. и. 30,1-73,2%,) штаммов Е. coli, у 2 (50% от числа всех энтеробактеров, д. и. 6,7-93,2%)) штаммов Enterobacter spp. Примеры положительных результатов ПЦР-детекции W TEM-I генов в агарозном геле представлены нарис. 5.1.
WaSHv гены обнаружены у 38 изолятов энтеробактерий из 79 исследованных (48,1%, д. и. 36,7-59,6%). Из них 31 штамм содержит 6/aSHV.i гены, кодирующие Р-лактамазы широкого спектра действия (29 штаммов К. pneumoniae и 2 Enterobacter spp.) и 7 штаммов гены, кодирующие Р-лактамазы расширенного спектра действия (у К. pneumoniae: 6/aSnv-n — 4 штамма, WaSHv-i2 — 1 штамм, blasnv-s — 1 штамм; у Е. coli: 6/aSHv-2a — 1 штамм). Примеры положительных результатов ПЦР-детекции blaSHv генов в агарозном геле представлены на рис. 5.2.
Ыастх гены обнаружены у 44 изолятов энтеробактерий из 79 исследованных (55,7%, д. и. 44,1-66,9%»), причём также осуществлялась детекция подгрупп генов: ЫаСтх-т обнаружены у 28 (53,8%) от числа всех клебсиелл, д. и. 39,5-67,8%о) штаммов К. pneumoniae, у 11 (47,8% от числа всех кишечных палочек, д. и. 26,8-69,4%) штаммов Е. соїі, у 2 (50% от числа всех энтеробактеров, д. и. 6,7-93,2%) штаммов Enterobacter spp. Гены Ыастх-мя выявлены у 3 (5,8% от числа всех клебсиелл, д. и. 1,2-15,9%) штаммов К. pneumoniae. Примеры положительных результатов ПЦР-детекции Ыастх генов в агарозном геле представлены на рис. 5.3., 6/астх-мі — на рис. 5.4., Ыастх-М9— на рис. 5.5.
В ходе исследования гены всех трёх основных групп Р-лактамаз обнаружены у энтеробактерий как в изолированном виде, так и в различных комбинациях.
Большинство исследованных штаммов, выделенных из патологического материала при ВБИ, содержат гены, кодирующие продукцию одновременно Р-лактамаз широкого и расширенного спектра действия.
Представительство Р-лактамаз распределилось следующим образом. Из 52 штаммов К. pneumoniae гены, кодирующие Р-лактамазы широкого спектра действия выявлены у 37 изолятов (71,2%, д. и. 56,9-82,9%). Гены, кодирующие продукцию ESBL-ферментов, обнаружены у 32 штаммов, что составляет 61,5% (д. и. 47,0-74,7%) (рис. 5.6.). У 29 штаммов (36,7%, д. и. 41,3-69,5%) одновременно обнаружены гены, кодирующие и Р-лактамазы широкого спектра и ESBL-ферменты. Генетически доказанная распространенность Р-лактамаз у клебсиелл представлена на рис. 5.7.
Из 23 штаммов Е. coli гены, кодирующие продукцию Р-лактамаз широкого спектра действия, выявлены у 12 штаммов (52,2%, д. и. 30,1-73,2%). Гены, кодирующие продукцию ESBL-ферментов, обнаружены у 12 штаммов, что составляет 52,2% (д. и. 30,1-73,2%) (рис. 5.8.). У 6 штаммов (26,1%, д. и. 10,2-48,4%) одновременно обнаружены гены, кодирующие (3-лактамазы широкого спектра и ESBL-ферменты. Генетически доказанная распространенность Р-лактамаз у кишечных палочек представлена на рис. 5.9.
Из 4 штаммов Enterobacter spp. гены, кодирующие продукцию Р-лактамаз широкого спектра действия, выявлены у 3 штаммов (75%, д. и. 19,4-99,4%). Гены, кодирующие продукцию ESBL-ферментов, обнаружены у 2 штаммов, что составляет 50% (д. и. 6,7-93,2%). У 2 штаммов одновременно обнаружены гены, кодирующие Р-лактамазы широкого спектра и ESBL-ферменты. ESBL-ферменты у энтеробактеров представлены ферментами СТХ-М1 варианта (рис. 5.10.).
P. aeruginosa
Результаты интерпритации чувствительности штаммов P. aeruginosa, продуцирующих металло-бета-лактамазы (МБЛ) группы VIM, приведены в табл. 6.5. Для сравнения проанализирована чувствительность штаммов, не продуцирующих МБЛ (таб. 6.6.). Сравнительные данные по резистентности штаммов P. aeruginosa, продуцирующих и непродуцирующих МБЛ, приведены на рис. 6.7.
Активность всех антибактериальных средств в отношении штаммов P. aeruginosa, продуцирующих МБЛ, резко снижена (рис. 6.7.). Различия оказались достоверны практически по всем антибактериальным препаратам: меропенему (р=0,0001), имипенему (р 0,0001), по ципрофлоксацину (р 0,010), амикацину (р=0,008), цефтазидиму (р=0,002), цефоперазону (р 0,0001), цефоперазон/сульбактаму (р 0,002), ко-тримаксазолу (р 0,002). Близки к достоверным различия по гентамицину (р 0,069), различия недостоверны по цефепиму (р=0,306).
Практически все штаммы резистентны к карбапенемам (100%, д. и. 71,5-99,9%, штаммов резистентны к имипенему; 90,9%, д. и. 58,7-99,7%, штаммов — к меропенему). МПК5о имипенема у штаммов-продуцентов МБЛ выросла на 4, а меропенема на 3 разведения по сравнению с МПК5о штаммов, не продуцирующих МБЛ. Более 82% штаммов (д. и. 48,2-97,7%) резистентны к цефоперазон/сульбактаму, ципрофлоксацину, цефалоспоринам III поколения, аминогликозидам. МПК50 цефоперазон/сульбактама увеличилась на 2, а цефалоспоринов III поколения на 1 разведение. Наибольшую активность из всех исследованных антибактериальных средств по отношению к продуцентам МБЛ имеет цефепим — 45,5% (д. и. 34,6-56,5%)
