Введение к работе
Актуальность темы. Pseudomonas putida – часто встречающаяся бактерия, выделяемая как из внешней среды (вода, почва, растения), так и из патологического материала (Красильников, 1974; Смирнов, 1990; Weyant et al., 1996).
В отечественной и зарубежной литературе имеются многочисленные сообщения, в которых освещаются отдельные биологические свойства P. putida (Сиволодскиий, 1990; Волкова, 2006; Blazevic, Koepke, Matsen, 1973; Harwood, Fosnaugh, Dispensa, 1989; Boopathi, Rao, 1999; Ribera, Monteoliva-Sanchez, Ramos-Cormenzana, 2001; Ward, de Roo, O’Connor, 2005; Bertani et al., 2007).
Данный микроорганизм является возбудителем псевдомоноза у прудовых рыб, сопровождающегося массовой гибелью рыбы (Лобунцов и др., 1971; Мусселиус, 1983; Грищенко, 1984; Вялова, Шкурина, 1995; Юнчис, 2005; Altinok, Kayis, Capkin, 2006). В единичных случаях бактерии P. putida способны вызывать заболевания у теплокровных животных и человека: абсцессы, бактериемии, раневые инфекции, инфекции мочевыводящих путей, кольпит, приводящий к самопроизвольным выкидышам, абортам (Литвин, 1997; Blazevic, Koepke, Matsen, 1973; Anaissie et al., 1987; Perz et al., 2005).
Имеются сведения, что P. putida вызывает порчу пищевых продуктов (Clive de W. Blackburn, 2008). Кроме того, ряд штаммов данной бактерии проявляет фитопатогенные свойства (Пастушенко, Симонович, 1979; Burkholder, 1950). Другие штаммы, напротив, входят в состав биопрепаратов для стимуляции роста растений (Боронин, Кочетков, 2000; Lopez, Henkels, 1999).
Бактерии P. putida широко известны и имеют важное научно-практическое значение благодаря своей способности окислять необычайно большое число различных органических соединений, являются объектом биотехнологических исследований при конструировании препаратов-деструкторов, в том числе со множественной деструктивной активностью (Волкова, 2006; Muller, 1992). Разработаны методы использования P. putida для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (Клюянова, 2006; Kowalski, 2002).
Вышеперечисленное обуславливает научный и практический интерес к бактериям P. putida. В значительной степени это связано с недостаточно разработанными методами индикации и идентификации данного микроорганизма при выделении из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов (Сиволодский, 1988; Васильев, Золотухин, Никишина, 1998).
С середины прошлого столетия бактериофаги широко используются для диагностики различных бактериальных инфекций (Гольдфарб, 1961). Вместе с тем, использование реакции нарастания титра фага, как быстрого и точного метода индикации бактерий, для P. putida ранее не изучалось.
Цель работы – усовершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.
Задачи работы:
1. Разработать среду накопления и селективную среду для выделения штаммов P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, подобрать бактериологические тесты для идентификации этих бактерий.
2. Разработать схему бактериологической идентификации и дифференциации P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов на основе разработанных сред и подобранных тестов.
3. Изучить основные биологические свойства штаммов P. putida, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.
4. Выделить бактериофаги бактерий P. putida и изучить их основные биологические свойства: морфологию негативных колоний, литическую активность, установить спектр литической активности, специфичность действия, температурную устойчивость и устойчивость к хлороформу.
5. По критериям литической активности, спектру лизируемых культур и специфичности, отобрать наиболее оптимальный бактериофаг для конструирования биопрепарата.
6. На основе отобранного бактериофага создать биопрепарат для индикации и идентификации P. putida и разработать технологию его изготовления.
7. Оптимизировать схему индикации бактерий P. putida в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов с помощью биопрепарата бактериофага Psp10-УГСХА методом реакции нарастания титра фага.
Научная новизна. Впервые для выделения, идентификации и оценки распространения бактерий P. putida была предложена и использована бактериологическая схема, основанная на применении оригинальных специфических сред: среды накопления Psp-A-УГСХА с сукцинатом натрия и минеральными солями, селективной среды Psp-S-УГСХА с глюкозой, бромтимоловым синим и фурадонином, а так же подобранной системы тестов, позволяющая за 96 часов провести дифференциацию бактерий P. putida от сопутствующей микрофлоры. Применение данной схемы позволило выделить и изучить 33 штамма P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, что внесло существенный вклад в понимание биологических особенностей этих псевдомонад.
Выделены и изучены по заданным биологическим свойствам бактериофаги P. putida. Впервые для целей идентификации бактерий указанного вида разработан биопрепарат на основе отобранного наиболее оптимального для данных целей бактериофага Psp10-УГСХА.
Впервые разработана и апробирована на объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов схема реакции нарастания титра фага для индикации бактерий P. putida с использованием биопрепарата бактериофага Psp10-УГСХА, позволяющая проводить индикацию бактерий P. putida за 24 часа. Разработаны биотехнологические параметры изготовления биопрепарата бактериофага Psp10-УГСХА для индикации и идентификации бактерий P. putida.
Практическая значимость работы. Предложена схема по выделению, бактериологической идентификации и дифференциации, позволяющая выделять и идентифицировать штаммы P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Сконструированная среда накопления Psp-A-УГСХА, селективная среда Psp-S-УГСХА и подобранная система биохимических тестов позволяют выделять и типировать бактерии P. putida до вида за 96 часов. Сконструирован биопрепарат на основе бактериофага Psp10-УГСХА и разработана схема индикации бактерий P. putida методом реакции нарастания титра фага (РНФ) в течение 24 часов.
Результаты усовершенствования бактериологической схемы выделения и идентификации P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, изучения биологических свойств бактериофага Psp10-УГСХА, а также возможность использования биопрепарата бактериофага Psp10-УГСХА в схеме реакции нарастания титра фага, подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА от 11 апреля 2011 г.
По материалам диссертационной работы предложены и утверждены ректором УГСХА (29 апреля 2011 г.) «Методические рекомендации по ускоренной индикации бактерий Pseudomonas putida методом реакции нарастания титра фага в объектах санитарного надзора», «Методические рекомендации по изготовлению и контролю бактериофага Psp10-УГСХА», а также «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида Pseudomonas putida в объектах санитарного надзора». Методические рекомендации предназначены для сотрудников медико-биологических научных учреждений и специалистов бактериологических лабораторий.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработанная среда накопления Psp-A-УГСХА обеспечивает преимущественный рост и размножение бактерий P. putida. Сконструированная плотная селективная среда Psp-S-УГСХА является специфичной по отношению к бактериям P. putida и угнетает рост возможных ассоциантов.
-
Разработанная схема бактериологической дифференциации, включающая сконструированные среды: среду накопления Psp-A-УГСХА и плотную селективную среду Psp-S-УГСХА, а также систему бактериологических тестов, позволяет идентифицировать P. putida за 96 часов.
-
Из 14 выделенных и изученных по биологическим свойствам штаммов бактериофагов бактерий P. putida отобран один бактериофаг Psp10-УГСХА, который может быть использован для целей идентификации и индикации P. putida в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.
-
Разработан биопрепарат на основе бактериофага Psp10-УГСХА для индикации бактерий P. putida и биотехнологические параметры по его изготовлению.
-
Усовершенствованная схема индикации P. putida методом РНФ с применением биопрепарата бактериофага Psp10-УГСХА позволяет типировать P. putida за 24 часа.
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия».
Апробация работы:
Материалы диссертационной работы были представлены на: Международной научно-практической конференции Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008, 2009, 2011), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009), III-й Международной научно-практической конференции молодых учёных «Молодёжь и наука XXI века» (Ульяновск 2010), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011), Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (Покров, 2011).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы, собственных исследований, состоящих из объекта, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников, приложений. Материалы диссертации изложены на 155 страницах, включают 42 таблицы и 21 рисунок. Список использованных литературных источников включает 239 наименований, в том числе 127 зарубежных.
