Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Исторические аспекты исследования бактерий с измененной морфологией 8
Глава 2 . Фаза несбалансированного роста 15
2.1. Факторы, вызывающие нарушение синтеза клеточной стенки у бактерий 15
2.2. Формы несбалансированного роста 22
2.3. Сферопласты и протопласты 24
2.4. Роль бактерий в фазе несбалансированного роста в инфекционной патологии 28
Глава 3 . Л-фаза бактерий 33
Экспериментальные исследования 37
Глава I. Материалы и методы 37
Глава 2 . Получение форм несбалансированного роста и их сравнительная биологическая характеристика 49
2.1. Действие пенициллина 49
2.2. Действие хлористого лития 62
2.3. Действие специфической антисыворотки, комплемента и лизоцима 67
2.4. Действие ультрафиолетового облучения 72
Глава 3 . Структурная организация и способы репродукции форм несбалансированного роста грамположительных и грамотрицательных бактерий 80
3.1. Формы несбалансированного роста листерий 80
Формы несбалансированного роста стафилококка 99
Формы несбалансированного роста сальмонелл 122
Условия реверсии и структура ревертантов 144
Глава 4 . Незавершенные Л-формы бактерий 154
4.1. Получение незавершенных Л-форм пневмококка 154
4.2. Особенности структурной организации незавершенных Л-форм пневмококка в динамике их роста и способы репродукции 160
Глава 5 . Выделение вариантов бактерий с измененной клеточной стенкой из образцов крови 178
5.1. Выделение морфологически атипичных бактерий из крови больных 179
5.2. Структурная организация вариантов бактерий, выделенных из крови больных 187
Глава б . Разработка метода выделения бактерий с дефектом синтеза клеточной стенки из смешанных микробных популяций и его использование для выявления форм несбалансированного роста и Л-форм бактерий 195
6.1. Выделение вариантов бактерий с измененной
клеточной стенкой с помощью метода центри
фугирования в градиенте плотности
вещества 196
6.2. Выделение форм несбалансированного роста и Л-форм бактерий из материала ротовой полости * 208
6.3. Структурная организация вариантов бактерий, выделенных из материала ротовой полости... 212
Обсуждение 221
Выводы 242
Литература 245
- Факторы, вызывающие нарушение синтеза клеточной стенки у бактерий
- Действие пенициллина
- Формы несбалансированного роста листерий
- Получение незавершенных Л-форм пневмококка
Введение к работе
Явление несбалансированного роста у бактерий известное ранее как гетероморфний рост было открыто и описано в классических работах Н.Ф.Гамалеи (8), А.А.Имшенецкого (13), М.А.Пешкова (49). Формы несбалансированного роста представляют собой первичную реакцию бактерий на действие самых разнообразных факторов окружающей среды химической, физической и биологической природы. Они способствуют выживанию и сохранению вида в условиях кратковременного действия этих факторов и встречаются чаще, чем другие варианты бактерий с дефектной клеточной стенкой.
В работах последних лет убедительно показано, что различные варианты бактерий с измененной клеточной стенкой, в том числе формы несбалансированного роста, могут образовываться как в при-' родных условиях, так и в организме больного в ходе инфекционного процесса (86,95). Подобные варианты возбудителя, приобретая большую резистентность к некоторым антибиотикам и факторам защиты макроорганизма по сравнению с бактериями с полноценной клеточной стенкой, либо сохраняют патогенные потенции родительских бакте- рий, либо быстро восстанавливают их в процессе реверсии.
Формы несбалансированного роста изучены хуже других микроорганизмов с дефектной клеточной стенкой. Так, до настоящего времени не вполне выяснены биологические свойства и жизнеспособность .форм несбалансированного роста, не изучены особенности их субмикроскопической организации и способов репродукции. Не выяв-
ЭлеКТрОННО-МИКрОСКОПИЧеСКИе ИССЛеДОВаНИЯ ПрОВедеНЫ При ПОСТО'
янной консультации доктора биологических наук Л.Н.Кац и кандидата медицинских наук Н.Д.Константиновой.
лен их удельный вес в естественных биоценозах и значение при инфекционных процессах. Представляется еще не ясным, все ли формы несбалансированного роста являются потенциальными предшественниками Л-форм бактерий или только некоторые из них.
Незавершенный Л-цикл бактерий или М-цикл представляет собой своеобразный и малоизученный феномен, описанный для некоторых видов патогенных бактерий на светооптическом уровне. Он заключается в спонтанном образовании в бактериальной популяции шаровидных вакуолизированных клеток, не способных к самостоятельной . репродукции. До настоящего времени отсутствует анализ субмикроскопической организации незавершенных Л-форм, не выяснена их связь с другими этапами Л-трансформации.
Как известно, традиционные методы лабораторной диагностики при некоторых хронических и рецидивирующих заболеваниях не всегда учитывают возможность перехода возбудителя в атипичные варианты, у которых существенно изменены не только форма клетки, но и питательные потребности. С другой стороны, присутствие в исследуемом клиническом материале бактерий с полноценной клеточной стенкой затрудняет выделение чистых культур измененных вариантов бактерий. Поэтому актуальным является разработка методов выделения бактерий с дефектной клеточной стенкой, необходимых как для дальнейшего выяснения их роли в этиологии и патогенезе различных нозологических форм неясной инфекционной природы, так и для целей лабораторной диагностики.
Исследования по диссертации проводились в соответствии: с общесоюзной целевой программой научно-исследовательских работ по эпидемиологии и клинике инфекционных болезней человека бактериальной этиологии, направленных на совершенствование сие-
темы лечебных и противоэпидемических мероприятий (раздел 1,3,02. -."Роль Л-форм в персистенции патогенных бактерий"), с программой работ НИИЭМ им.Н.Ш.Гамалеи АМН СССР "Персистенция патогенных микроорганизмов" и планом основной тематики работ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи № 81032556.
Целью наших исследований явился анализ явления несбалансированного роста и незавершенного Л-цикла на субмикроскопическом уровне, а также разработка методов выделения бактерий с дефектной клеточной стенкой из клинического материала. В этой связи целесообразно было решить следующие конкретные задачи:
Выяснить возможность образования форм несбалансированного роста под действием факторов различной природы: хлористого лития, специфической антисыворотки в сочетании с комплементом и лизоцимом, УФ-облучения и пенициллина.
Провести анализ некоторых биологических свойств, структурной организации и способов репродукции полученных форм несбалансированного роста.
Получить незавершенные Л-формы бактерий и провести анализ их структурной организации.
Выделить бактерии с дефектной клеточной стенкой из клинического материала с помощью разработанного метода.
Основные результаты проведенных исследований сводятся к следующему.
- Показана возможность индукции форм несбалансированного роста у листерий, стафилококка и сальмонелл под действием хлористого лития, специфической антисыворотки в сочетании с комплементом и лизоцимом, УФ-облучения, пенициллина.
Установлено, что все полученные формы несбалансированного роста жизнеспособны на уровне популяции, сохраняют свои свойства в течение нескольких пассажей и реверсируют при исключении фактора их индукции.
Сходство форм несбалансированного роста, полученных под влиянием различных факторов, заключается в повреждении поверхностных структур и 'способов деления клетки, однако характер и глубина повреждений в каждом случае различны.
У форм несбалансированного роста впервые обнаружено образование элементарных тел, ранее описанных как минимальные репродуктивные элементы Л-форм бактерий.
Формы несбалансированного роста обнаружены также у незавершенных Л-форм пневмококка, наряду с неизменными и Л-по-добными клеткаїли. Смешанная популяция способна существовать ограниченное время. На уровне популяции репродукция происходит благодаря формам несбалансированного роста.
Разработан оригинальный метод выделения бактерий с дефектной клеточной стенкой из смешанных микробных популяций. Показана возможность его применения для выделения форм несбалансированного роста и Л-форм из клинического материала.
Описана схема выделения и подобраны условия для первичного высева и последующего культивирования форм несбалансированного роста, обнаруженных в крови больных.
-8-0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ
Факторы, вызывающие нарушение синтеза клеточной стенки у бактерий
Факторы, при воздействии которых у бактерий могут образовываться варианты с дефектной клеточной стенкой многочисленны и разнообразны: химические соединения, биологические агенты, физические воздействия. Они могут действовать либо непосредственно на клеточную стенку, разрушая иукопептиды или нарушая определенные этапы их синтеза, либо на генетический аппарат клетки, в результате чего образуются мутанты, дефектные по отдельным этапам синтеза пепти-догликана. В первом случае процесс связан с массовой конверсией значительной части бактериальной популяции в формы несбалансированного роста, сферопласты, протопласты и нестабильные Л-формы с последующей селекцией стабильных Л-форм. В этом процессе факторы индукций выступают в роли селекционирующих факторов (49,52,65).
При воздействии мутагенных факторов-лучей Рентгена, ультрафиолетовых лучей, химических мутагенов - образуются мутанты, близкие по своим свойствам к JI-формам бактерии (2,94,109). Антибиотики. Пенициллин является наиболее универсальным фактором Л-трансформации. Он успешно используется при индукции Л-форм практически всех видов патогенных бактерий. Точкой приложения пенициллина является пептидогликан. Пептидогликан -биополимер, состоящий из диаминопимелиновой кислоты, л/--ацетилмурамовой кислоты и S# -аминокислот, обуславливающий форму и осмотическую стабильность бактерий и составляющий от 5 до 90$ оболочки у прокариотов, за исключением микоплазм, галобактерий и метанобактерий, у которых пептидогликан отсутствует . Пенициллин нарушает процесс транспептидирования,т.е. вызывает разрыв одной пептидной связи перед образованием сшивки. %ЄІ (1163) предположил, что пенициллин является аналогом ацил Я) -аланина, он связывается с ферментом транспептидазной реакции и взаимодействует с его активным центром с образованием неактивного пенициллин-фермента. Другие антибиотики, являющиеся ингибиторами различных этапов синтеза пептидогликана, также могут быть в ряде случаев универсальными индукторами Л-форм (метициллин, Цефалотин, Д-циклосерии) . Некоторые антибиотики, подавляющие синтез компонентов клеточной стенки, вызывают образование Л-форм лишь у определенных видов бактерий. Так, бацитрицин вызывает индукцию Л-форм у стрептококка (147,153). Имеются сообщения об индукции Л-форм под действием антибиотиков, первичное действие которых не связано непосредственно с клеточной стенкой.В данном случае,очевидно,дефект в синтезе клеточной стенки носит вторичный характер.Так,стрептомицин,не вызывая -17 Л-трансформации у является активным фактором индукции Л-форм у холерного вибриона (84) и микобактерий туберкулеза (36). Л-формы холерного и НАГ вибрионов получали и под действием тетрациклина (57). Образование Л-форм возможно так же и при комбинированном действии нескольких антибиотиков (64,65,110).
Ферменты. Активным фактором индукции вариантов с дефектной клеточной стенкой является лизоцим. Под лизоцимами понимают группу ферментов, объединенных общим механизмом действия, но варьирующих по структурной организации и некоторым свойствам в зависимости от их природы. Лизопимы являются муралитическими ферментами, т.к. их субстратом служит мукополисахарид бактериальной клеточной стенки, содержащий мурамовую кислоту. Механизм действия лизоцима связан с гидролитическим расщеплением J (1- 4) или Jiy (1- 2) гли-козидных связей Л/ -ацетилглюкозамин-/ -ацетилмурамовой кислоты. Кроме того, в присутствии неорганических солей он может активизировать эндогенные гидролитические ферменты аутолизины клеточной стенки (103).
Различия в структуре клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий обуславливают разную чувствительность этих двух групп микроорганизмов к лизоциму. У грамположительных бактерий лизоцим в гипертонической среде вызывает образование протопластов (165,166). При культивировании лизонимных протопластов в присутствии пеницилина могут быть получены Л-формы бактерий (132). Грамотрицателъные бактерии более устойчивы к действию лизоцима в связи с более высоким общим содержанием липидов в клеточной стенке. Однако после предварительной обработки этих бактерий, способствующей нарушению целостности липидных компонентов клетки, лизоцим может приводить к образованию сферопластов грамотрицательных бакте -18 рий (142). щнокислоты. Некоторые аминокислоты могут ингибировать синтез компонентов клеточной стенки у бактерий. Так -аланин, 5& -серии, аргинин, глицин, фенилаланин могут вызывать образование оферопластов и нитевидных клеток, нарушая процессы синтеза компонентов клеточной стенки и процесса деления клетки (152).
Глицин замещает .- и - аланин в пептидных субъединицах и включается в пептидогликан. Наблюдающиеся морфологические изменения клеток (удлинение, деформация, образование оферопластов и кокковидных клеток, гетерогенность по размерам) обусловлены двойным механизмом действия глицина. Во-первых, при действии глицина происходит накопление глицин-содержащих предшественников, что] приводит к дисбалансу между синтезом пептидогликана и контролируемым энзи-матическим гидролизом в процессе роста. Во-вторых, глицин - содержащие предшественники являются плохим субстратом для реакции транспептидирования, что обуславливает накопление большого количества несцепленных мукопептидов (106).ультрафиолетовые лучи. Имеются единичные сообщений об индукции Л-форм под действием УФ-излучения у аъо сье/риит, itimtfejuesLS, и &иіїйгаь оаьоіЬгї&Ьсь (109,154), а также у УФ чувствительных мутантов &&cfaloeJbui, сово (42). Однако в последнем случаем анализ материалов на дает достаточных оснований для того, чтобы причислить получение измененные варианты к Л-формам. Же_фадтоы. Высокие концентрации неорганических солей легких металлов таких как ртуть, литий, кадмий, а также недостаток некоторых компонентов питательной среды, необходимых для синтеза компонентов клеточной стенки или сбалансированного роста бактерий, также могут вызывать образование форм несбалансированного роста и Л-форм (86,118). В некоторых случаях наблюдали спонтанное образование Л-форм, особенно у микроорганизмов с высокой аутолической активностью, таких как представители родов StutptofacMi ,, 9kts$ebui, Si tec cc (91,92).
Образование бактеіжй_.с_.дефектом клеточной стенки_в_кле20чных_.куль-туЕах и j/ь 2.. В культуре клеток макрофагов хомячка под действием пенициллина и стрептомицина образовывались Л-формы StttczC&L &Se b&t& (107). Ж.Шмитт-Сломска (71,157) показала возможность индукции и длительной персистенпии Л-форм стрептококка группы А в культуре диплоидных клеток эмбриона человека. В последние годы показана возможность индукции Л-фОрм стафилококков, пневмококков, сальмонелл и других видов в опытах т, іїсгХо при моделировании инфекционного процесса у животных (46,65,77,116, 135).
Действие пенициллина
Пенициллин, ингибитор синтеза пептидогликана, классический фактор, вызывающий у бактерий образование вариантов с дефектом синтеза клеточной стенки, в том числе и Л-форм. Формы несбалансированного роста, полученные под действием пенициллина, мы сравнивали в дальнейшем с аналогичными вариантами, образующимися при действии других менее изученных факторов.
Действие_пенициллина__на листерии . 7 листерий под действием пенициллина были получены Л-формы (34, 81, 158) и изучена их ультраструктурная организация (30, 102). У некоторых штаммов листерий не удалось получить Л-формы, а наблюдалась лишь кратковременная реакция на действие пенициллина в виде форм несбалансированного роста, изученных на светооптическом уровне (34).
В наших опытах при изучении влияния пенициллина на листерий бульонную культуру в логарифмической фазе роста высевали на полужидкие и полутвердые Л-среды с добавлением натриевой соли бензил-пенициллина. Дозы пенициллина при первичном воздействии составляли 6, 15, 60, 90 и 120 мкг на I мл,среды (рис. I ).
Пробирки и чашки с посевами культивировали в течение 3-х суток в термостате, а затем при комнатной температуре. На средах с :_,6 и 15 мкг/мл пенициллина через сутки наблюдали бактериальный рост. При дозе пенициллина 30 мкг/мл на 1-е сутки культура была представлена крупными палочковидными клетками и единичными сферическими образованиями. Такая измененная культура листерии быстро восстанавливала исходную морфологию при снижении концентрации пенициллина в среде по мере его инактивации в процессе культивирования при 37С. Так, уже через сутки после появления измененного роста на тех же средах происходила реверсия в типичные бактерии.
При концентрации пенициллина 60 мкг/мл в полужидкой среде на 5-7-е сутки наблюдали рост в виде мелких колоний. Изучение в световом микроскопе такой культуры выявило существенные изменения исходной морфологии листерии. Популяция состояла из сильно увеличенных клеток, имевших различную оптическую плотность. Палочковидные клетки полностью отсутствовали. При концентрации пенициллина I ,90 и 120 мкг/мл рост данного штамма листерии полностью прекращался.
В другой серии опытов формы несбалансированного роста получали на полутвердой Л-среде и пассировали их в течение; нескольких пассажей. Пассирование культуры проводили с тем, чтобы судить о жизнеспособности форм несбалансированного роста, дальнейших изменениях в структуре клетки и возможности реверсии. При посеве бактериальной культуры на полутвердую среду с ,60 мкг/мл пенициллина через 8-Ю суток вырастали немногочисленные мелкие колонии слизистой консистенции. При фазово-контрастной микроскопии наблюдали колонии, состоявшие из резко увеличенных шаровидных клеток разных размеров (рис. 26). Полученные колонии пересевали вместе с блоком агара на
Следовательно, при действии натриевой соли пенициллина у данного штамма листерий наблюдали изменение формы, размеров и оптической плотности клеток. Использованный в опытах штамм отличался высокой способностью к Л-трансформации. Так, для образования Л-форм было достаточно однократного действия в концентрации 60мгк/мл пенициллина, после чего популяция утрачивала способность к восстановлению исходного фенотипа.
Действие пенициллина на_стафилококкд Закономерности образования форм несбалансированного роста и Л-форм под действием пенициллина были описаны для различных штаммов патогенного стафилококка (53), однако, их ультраструктура не изучалась. В наших опытах была сделана попытка получения форм несбалансированного роста у трех штаммов стафилококка.
При действии пенициллина на штамм 209Р в концентрациях до 0,6 мкг/мл мы не наблюдали задержки роста и изменения морфологии клетки (рис. 3). На средах с 0,6, 3 и 6 мкг/мл пенициллина появление видимого роста отмечали соответственно на 2-4, 6-8 и 7-Ю сутки. При фазово-контрастном микроскопировании колоний они были представлены сферическими клетками различных размеров, в основном значительно крупнее исходных кокков, а также клетками неправильной формы (рис. 46). Формы несбалансированного роста стафилококков, получен о и ные после однократногоддействия пенициллина, можно было поддерживать, пересевая культуры в течение нескольких пассажей на средах с теми же концентрациями пенициллина, при которых они были получены (рис. 3).
Культуру, выросшую после однократного действия пенициллина в концентрации 0,6-3 мкг/мл, пересевали на среды с более высокими концентрациями антибиотика (рис. 3). Формы несбалансированного роста штамма 209 Р уже на первом пассаже обладали высокой устойчивостью к пенициллину и в зависимости от концентрации антибиотика в среде образовывали варианты, различающиеся по морфологии. Так, при пересеве на среду с 15 мкг/мл пенициллина сохранялись полиморфные кокковидные и неправильной формы клетки и наряду с этим начинали образовываться очень крупные шары к вакуолизированные клетки (рис. 4в). Увеличение концентрации пенициллина до 30 мкг/мл приводило к образованию значительного количества больших тел и вакуолизированных клеток, а также немногочисленных зернистых структур. Повышение концентрации до 60 мкг/мл вызывало образование зернистых конгломератов при отсутствии других форм. Это наблюдение находится в соответствии с данными ряда авторов, которые показали, что если доза пенициллина превышает оптимальную, то вырастают зернистые варианты, характерные для Л-форм бактерий (16, 69).
Формы несбалансированного роста листерий
Действиепенициллина._Как было указано выше, формы несбалансированного роста листерий были получены при однократном действии пенициллина в концентрации 60 мкг/мл. Изучение ультраструктуры выявило полную потерю клеточной стенки у всех клеток популяции. В результате потери ригидной клеточной стенки клетки приобретали округлую или неправильную форму (рис. 15, 16, 17, контроль рис.14).
В цитоплазме выявляется хорошо развитый нуклеоид. Внутри-цитоплазматические мембранные структуры в большинстве клеток отсутствуют. В культуре имеется много мелких шаровидных клеток с хорошо выраженным нуклеоидом и рибосомами, т.е. наблюдается образование потенциально жизнеспособных элементарных тел, характерных для Л-форм бактерий.
Таким образом, после однократного действия пенициллина в дозе, граничащей с бактерицидной, у клеток листерий штамма НК полностью разрушается клеточная стенка. Наряду с протопластами образуются типичные для Л-форм шаровидные клетки и элементарные
Клетки типичные для Л-форм, полученные после однократного действия пенициллина (60 мкг/мл) на ітопосміовеля ) шт. НК. тела. Такая популяция может рассматриваться как начальный этап Л-трансформации, а наблюдающиеся изменения бактериального фенотипа позволяют отнести эту культуру к фазе несбалансированного роста (58).
Дальнейшее пассирование культуры, подвергшейся однократному действию певжпиллина,проводили на среде без пенициллина. На ультратонких срезах культуры 1-го пассажа наблюдали клетки округлой и неправильной формы с хорошо выраженным нуклеоидом, занимающим значительную часть цитоплазмы, и четко выявляющимися рибосомами (рис. 18,19). Клетки плотно прилегают друг к другу, причем наблюдается тенденция к разрушению близко прилежащих мембран с последующим слиянием клеток (рис. 18). В культуре много элементарных тел. Все клетки погружены в массу, состоящую из фибрилл ДНК (рис. 19).
Тенденция к слиянию клеток усиливалась в популяции листерий 3-го пассажа (рис. 20). Если на более ранних этапах обращало на себя внимание присутствие вокруг клеток фибрилл ДНК, то начиная с 3-го пассажа, внеклеточных фибрилл ДНК значительно меньше. Структура клетки изменяется. Клетки существенно увеличиваются в размерах, цитоплазма становится более рыхлой и выявляется в основном по периферии клетки. Нуклеоид имеет рыхлую структуру и занимает большую часть цитоплазмы. Такая структура клеток характерна для Л-форм бактерий.
Культуры 4-го и последующих пассажей приобретали сходство с Л-формами. Способы репродукции у этих культур также характерны для Л-форм:неравновеликое бинарное деление и почкование с образованием элементарных тел (рис. 21). Элементарные тела формируются также и внутри клетки (рис 21).
Плотноприлежащие друг к другу полиморфные клетки Xoonoetftoginzs шт. НК. 1-й пассаж после действия пенициллина. Стрелками указаны участки разрушенных соседних мембран. Неравновеликое деление и почкование у клеток Zhnonocgtogtrus шт» НК, 4-й пассаж после действия пенициллина. Следовательно, при действии пенициллина на данный штамм листерий большинство клеток популяции, несмотря на полную потерю клеточной стенки, жизнеспособно,имеет хорошо сохраненный ядерный и рибосомный аппарат, характеризуется массовым образованием элементарных тел и образует Л-формы в течение первых 3-х пассажей. По-видимому, способность к слиянию и образованию полиплоидных форм, характерная для действия пенициллина, резко увеличивает возможность появления рекомбинатов, т.е. приводит в конечном счете к изменениям генетических свойств культуры. Действие_хлористого лития. Влияние хлористого лития на ультраструктуру листерий изучали как после однократного воздействия, так и при пассировании в присутствии данного агента. При электроняникроскопическом изучении культуры листерий, подвергшейся однократному действию хлористого лития, было обнаружено резкое увеличение размеров клеток. Клеточная стенка разрыхляется / рис.22, контроль рис. 14/. Иногда нарушается связь между клеточной стенкой и питоплазматической мембраной в результате разрушения внутреннего электронно-плотного слоя стенки /рис.23/. При дальнейшем пассировании измененных "литиевых" форм в среде с хлористым литием отмечали более глубокие изменения морфологии клеток, чем при однократном воздействии. Так, у клеток 3-го пассажа происходит слушивание, а также дальнейшее утоныпение и разрыхление клеточной стенки /рис.24, 25/. Во многих клетках исчезает внутренний электронно-плотный слой клеточной стенки и нарушается связь клеточной стенки с питоплазматической мембраной. Местами обнаруживается прерывистое строение мембраны (рис. 26). В цитоплазме выявляются включения средней электронной плотности (рис.25). Обнаруживаются хорошо развитые внутрицитоплазматические мембранные структуры (рис. 26). Деление клеток аномальное.
Получение незавершенных Л-форм пневмококка
Известно, что способность к образованию незавершенного Л-цикла у различных штаммов выражена в разной степени (Каган,Пе-сина, 1959)« В наших опытах при получении незавершенных Л-форм одновременно брали несколько штаммов пневмококка. Среду готовили на основе триптичеокого перевара бычьего сердца с добавлением бараньих эритроцитов, активированного древесного угля, лошадиной сыворотки и стабилизатора (56). Кроме того использовали среду, приготовленную на основе сердечно-мозгового экстракта ( fttfico) с добавлением сыворотки и стабилизатора. На полутвердые среды наносили по 0,1 бульонной культуры бактерий. Градиент концентраций пенициллина на чашках создавали с помощью полосок фильтровальной бумаги, смоченных в растворе пенициллина в концентрациях 0.1, I и 10 мкг/мл. На границе зоны ингибиции роста на 3-5 сутки роста у 5 из 6 использованных штаммов вырастали мелкие двухконтурные колонии. При пересеве этих колоний с блоком агара на среды того же состава, но без добавления пенициллина, на I сутки у всех штаммов наблюдали рост бактериальных колоний пневмококка. При фазово-контрастном микроскопи-ровании отмечали, что такие колонии состояли в основном из клеток, типичных для пневмококка, а также немногочисленных клеток слегка увеличенных в размерах. Более длительное культивирование приводило к существенному изменению формы и размеров клетки у I (штамм 123) из 5 штаммов. Культура пневмококка шт. 123 на ЗИ Л с добавлением сыворотки и стабилизатора, а/ I сутки, б/ 2 сутки, в/ 3 сутки, г/ 4 сутки, д/ 5 сутки, е/ 8 сутки. Фазово-контрастная микроскопия, х 1850Ha 2 сутки роста на полутвердой среде с сердечно-мозговым экстратом ( фо ) колонии пневмококка штамма 123 состояли как из типичных бактерий, так и увеличенных клеток, шаровидной, вытянутой или иной формы (рис.976). В течение следующих двух суток количество измененных крупных клеток возрастало. Можно было наблюдать цепочки кокков, состоящие как бы из раздутых клеток (рис.97 в,г). На 5 сзгтки культура пневмококка была представлена в основном крупными разнообразной формы клетками (рис.97 д), напоминавшими описанные ранее формы несбалансированного роста других грамположительных бактерий. Встречались также немногочисленные бактериальные клетки. На 8 сутки картина была иной - в колониях преобладали некрупные шаровидные клетки различной оптической плотности (рис.97 е).
При пересеве культуры пневмококка штамма 123 после 5-6 суток роста на свежую питательную среду вновь наблюдали изменения бактерий от типичных бактериальных форм до шаровидных клеток через формы несбалансированного роста. При этом после 9 суток роста культура утрачивала способность пересеваться.
При пассировании того же штамма пневмококка на другой среде, приготовленной с добавлением эритроцитов и древесного угля, наблюдаемые изменения бактериального фенотипа были характерны для незавершенного Л-цикла. Так, на 2 сутки отмечали образование "Раздутых" клеток и шаровидных тел, при сохранении значительного числа бактериальных клеток пневмококка (рис.98 б). На 3 сутки увеличивалось количество шаровидных тел, различающихся по размерам и оптической плотности (рис.98 в). В культуре незавершенных Л-форм на 4-5 сутки роста присутствовали бактериальные и шаровидные клетки, а также появлялись очень крупные оптически прозрачные сферические образования и бесструктур -157
Незавершенные Л-формы пневмококка шт. 123. а/ I сутки, б/ 2 сутки, в/ 3 сутки, г/ 4 сутки, д/ 5 сутки, е/ 7 сутки роста. Фазово-контрастная микроскопия, ные массы (рис.98 г,д). На 7 сутки культура почти полностью состояла из прозрачных тел и бесструктурных масс (рис.98 е). Незавершенные Л-формы на 5-6 сутки пересевали на свежую среду. При этом наблюдали описанный выше цикл морфологических изменений от кокков до шаровидных и вакуолизированных клеток разной величины. После 8-9 суток культура незавершенного Л-пик-ла не давала рост при пересеве. Такое характерное развитие популяции повторялось в условиях длительного пассирования на среде с осмотическими стабилизаторами и сывороткой без пенициллина. На ісреде без добавления этих компонентов культуры росли в виде типичных бактериальных форм.
Чувствительность к пенициллину у незавершенных Л-форм была почти такой же, как и у исходных бактерий. Незавершеные Л-формы были устойчивы к 0,5 мкг/мл пенициллина, более высокие концентрации антибиотика ингибировали их рост. Бактериальная культура пневмококка штамма 123 давала рост на средах с добавлением пенициллина в концентрациях до 0,25 мкг/мл включительно.
Таким образом, на модели пневмококка удалось наблюдать явление незавершенного Л-цикла. Проявление этого феномена, по-видимому, не зависит от действия Л-трансформирующих факторов, т.к. развитие популяции от бактерий до Л-подобных клеток закономерно повторялось в течение длительного пассирования в отсутствие пенициллина. Действие антибиотика на первом этапе получения незавершенных Л-форм бактерий, вероятно, носило селективный характер и способствовало отбору клеток, склонных к Л-трансфор-мации. Способность к образованию незавершенных Л-форм бактерий обусловлена индивидуальными особенностями штамма и вида. В то же время, развитие незавершенного Л-цикла во многом за -159 висит от условий культивирования. Образование незавершенных I-форм наблюдали лишь на определенном варианте среды. Культивирование этого же штамма пневмококка на другой среде приводило к образованию форм несбалансированного роста, которые не переходили в I-формы. Полученные незавершенные 1-формы при изучении со световым микроскопом напоминали типичные Л-формы, однако, в отличие от последних, они не были способны к самостоятельной репродукции при тех условиях, при которых они были получены.
