Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. N. meningitidis И Н. influenzae - возбудители инфекционных заболеваний 12
1.1. Инвазивные и неинвазивные заболевания, вызываемые N. meningitidis и Н. influenzae 12
1.2. Носительство N. meningitidis и Н. influenzae 20
ГЛАВА 2. Современное состояние лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых N. meningitidis И Н. influenzae 26
2.1. Схемы выделения бактерий из лабораторно - диагностического материала 27
2.2. Физиолого-биохимические особенности бактерий рода Haemophilus H.N. meningitidis 33
2.3. Питательные среды для выделения бактерий рода Haemophilus и N. meningitidis 35
Заключение по обзору литературы 45
Собственные исследования 47
Глава 3. Объекты и методы исследования 47
3.1. Объекты исследования 47
3.1.1 Штаммы микроорганизмов 47
3.1.2 Питательные среды 49
3.2. Методы исследования 51
3.2.1 Изучение питательных сред 52
3.2.2 Изучение диагностической значимости питательных сред 54
3.2.3 Статистическая обработка полученных результатов 55
ГЛАВА 4. Конструирование питательных сред со стимулятором роста из экстрактов лекарственных растений (элр) для выращивания и выделения бактерий рода haemophilus 56
4.1. Изучение стимуляторов роста из экстрактов лекарственных растений, повышающих ростовые свойства питательной среды для выращивания бактерий рода Haemophilus 56
4.2. Конструирование селективной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus 62
4.3. Сравнительная оценка разработанных и традиционных питательных сред 66
ГЛАВА 5. Разработка питательных сред для выращивания и выделения Neisseria meningitidis 72
5.1. Изучение ростовых свойств питательных сред на разработанной основе КАЭ + Л в отношении N. meningitidis 72
5.2. Разработка селективной питательной среды для выделения N. meningitidis 73
ГЛАВА 6. Изучение диагностической значимости разработанных селективных питательных сред в отношении бактерий рода hamophilus и n. meningitidis в лабораторно - эпидемиологических исследованиях 82
6.1. Изучение диагностической значимости питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus (SAH) 82
6.2. Изучение диагностической значимости питательной среды для выделения N. meningitidis (SAM) 88
Заключение 98
Выводы 108
Литература 109
- Физиолого-биохимические особенности бактерий рода Haemophilus H.N. meningitidis
- Статистическая обработка полученных результатов
- Конструирование селективной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus
- Изучение диагностической значимости питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus (SAH)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Известно, что Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, в частности, Н. influenzae серотипа Ъ (Hib), Streptococcus pneumoniae являются этиологическим фактором тяжелейших заболеваний, в том числе угрожающих жизни, особенно маленьких детей. Наиболее тяжёлой нозологической формой является гнойный бактериальный менингит (ГБМ). Следует отметить, что в России регистрируется заболеваемость, связанная с генерализованными формами менингококковой инфекции (ГФМИ), входящими в ГБМ, которые отдельно не учитываются, поэтому невозможно вычленить ни заболеваемость ГБМ менингококковой этиологии, ни .Шьменингиты [70]. По данным анализа заболеваемости ГФМИ и ГБМ в 37 регионах, проведенного Российским центром по эпидемиологическому надзору за менингококковой инфекцией и гнойными бактериальными менингитами, отмечено, что в 2002-2004гг в этиологии ГБМ значительно преобладали N. meningitidis (66,1% случаев), далее по частоте выделения следовали S. pneumoniae и Н. influenzae серотипа b (14,5% и 6,2% случаев соответственно). При этом летальность от ГФМИ и ГБМ составила 12,4%, а от ГБМ неменингококковой этиологии - 13,1% [54, 55].
К тяжёлым заболеваниям, вызываемым приведенными
микроорганизмами, относятся различные формы пневмоний. Так, показано доминирование при хронической пневмонии детей бескапсульной формы Н. influenzae и S. pneumoniae (соответственно, 80% и 47% выделенной микрофлоры, из которых 27 % приходится на долю их ассоциаций) [32]. При анализе материала со слизистой надгортанника детей, больных острым эпиглоттитом, в 52,8% выделен Н. influenzae серотипа йив 19,4% и 2,8% случаев соответственно S. pneumoniae и N. meningitidis [34].
Вместе с тем широко распространено носоглоточное носительство приведенных видов микроорганизмов. Попадая на слизистую ротоглотки человека, они осуществляют колонизацию эпителия, которая, как показано на примере менингококка, протекает бессимптомно и трактуется как здоровое
носительство, завершающееся чаще всего освобождением от возбудителя [45], в то же время в эпидемическом процессе менингококковой инфекции скрытым звеном является именно назофарингеальное носительство [28]. Микрофлора полости рта является одним из основных источником инфицирования как при госпитальных, так и при внебольничных пневмониях [6].
Установление этиологического агента заболевания обосновывает адекватное своевременное антибактериальное лечение больных, от которого зависит исход заболевания, а выявление назофарингеального носительства определяет тактику применения профилактических средств [39]. В тоже время оценка состояния лабораторной диагностики ГФМИ и ГБМ не менингококковой этиологии показала её низкий уровень (в среднем 30 - 40% и до 20% в некоторых регионах) [55, 56]. Совершенствование традиционных-и разработка новых методов диагностики нашли своё отражение в действующих нормативных документациях, которые в настоящее время наиболее соответствуют своей цели, определяя комплексный подход к лабораторной диагностике [51, 64]. Несмотря на всё более широкое использование некультуральных методов выявления бактериальных *-антигенов и ДНК, бактериологические исследования остаются необходимым и обязательным этапом лабораторной диагностики.
Как известно, бактерии рода Haemophilus и вида N. meningitidis относятся к микроорганизмам, весьма требовательным к питательным веществам и факторам роста, в связи с чем для их выделения и выращивания используются сложные комплексные питательные среды: сывороточный, «шоколадно» - кровяной, кровяной агары лабораторного приготовления (на различных высоко питательных основах). Существует отечественная коммерческая среда - «Менингоагар» (ФГУП ГНЦ прикладной микробиологии, Оболенск), к которой добавляют нормальную сыворотку, однако эта среда пока ещё не получила должной оценки практики. Для усиления ростовых свойств «шоколадного» агара при выделении
гемофильных бактерий Л.К. Катосова [32] предложила добавлять дрожжевой экстракт или НАД (никотинамидадениндинуклеотид).
В качестве добавок, ингибирующих рост посторонней микрофлоры, рекомендовано использование ристомицина или линкомицина, бацитрацина [58, 64], что важно при анализе заведомо контаминированных диагностических образцов (например, носоглоточной слизи, мокроты). Для этих же целей в НИИВС им. И.И.Мечникова была предложена питательная среда на разработанной ранее основе, состоящей из кислотного гидролизата казеина средней степени расщепления (используемого при производстве столбнячного анатоксина в ОАО «Биомед» им. Мечникова), препарата «Аминопептид» (выпускаемого ООО «Самсон-мед», Санкт-Петербург), экстракта кормовых дрожжей, получившая название КАЭ [73], к которой для придания ей селективных свойств в отношении бактерий рода Haemophilus был добавлен бацитрацин [24]. При испытании в лабораторно-диагностических исследованиях эта питательная среда не уступала селективному агару НАЕ (bioMerieux, Франция).
В диагностической практике используют импортный коммерческий стандартный селективный «шоколадный» агар «Haemophilus» (НАЕ), включающий антимикробную добавку (бацитрацин 50 МЕ/мл, ванкомицин 3 мкг/мл и амфотерицин В 3 мкг/мл; bioMerieux, Франция), ингибирующую рост сопутствующих грамположительных бактерий, дрожжеподобых грибов. Для выделения N. meningitidis на Западе чаще всего используют тот же «шоколадный» агар с коммерческой добавкой PolyViteX и ингибиторной смеси VCN (ванкомицин 3 мкг/мл, колистин 7,5 мкг/мл и нистатин 12,5 ЕД/мл; bioMerieux, Франция), подавляющих не только рост большинства грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжеподобых грибов, но и непатогенных видов нейссерий [107, 113, 122, 125].
Исходя из изложенного следует, что в лабораторно - диагностической практике для выделения N. meningitidis и бактерий рода Haemophilus из материала, обсеменённого посторонней флорой, применяются питательные
среды лабораторного приготовления в связи с отсутствием отечественных коммерческих питательных основ и селективных питательных сред, что определяет актуальность их разработки.
При конструировании селективных питательных сред одними из основных требований должно быть обеспечение высоких ростовых свойств в отношении искомых штаммов, в частности, способствующих быстрому формированию хорошо развитых колоний. Известно, что такой эффект можно получить путем добавления к питательным средам экстрактов лекарственных растений, содержащих различные факторы роста, способствующие увеличению размера колоний изученных штаммов шигелл, стафилококков, коринебактерий [3].
Цель исследования - конструирование новых питательных сред для выделения бактерий рода Haemophilus и вида Neisseria meningitidis.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Изучить влияние экстрактов некоторых лекарственных растений на ростовые свойства питательной среды в отношении бактерий рода Haemophilus.
Сконструировать селективную питательную среду для выделения бактерий рода Haemophilus.
3. Определить возможность использования разработанной питательной среды с экстрактом лекарственных растений для выращивания N. meningitidis.
Сконструировать селективную питательную среду для выделения N. meningitidis.
Изучить сравнительную диагностическую ценность разработанных селективных питательных сред при их лабораторном испытании.
Научная новизна работы
Разработана новая питательная среда, обладающая высокими ростовыми свойствами для бактерий рода Haemophilus (увеличение диаметра колоний и жизнеспособности клеток, уменьшение их полиморфизма). Увеличение ростовых свойств достигнуто за счёт введения в известную основу экстракта семян льна, как наиболее эффективного стимулятора роста. Новизна исследования подтверждена патентом № 2320714 «Питательная среда для выращивания бактерий рода Haemophilus».
Показана возможность использования разработанной питательной среды для выращивания N. meningitidis без добавления в неё сыворотки.
Разработаны и испытаны селективные питательные среды для выделения бактерий рода Haemophilus и вида N. meningitidis, не уступающие стандартным коммерческим средам фирмы bioMerieux, Франция.
Обоснован способ выявления гемофильных бактерий в более короткие сроки (через сутки от начала исследования) за счёт одновременного использования набора сред, состоящего из селективной среды, среды для выращивания бактерий рода Haemophilus, контрольной среды, на которой отсутствовал рост бактерий данного рода, и питательной среды для дифференциации Н. influenzae и Н. parainfluenzae.
Практическая значимость работы
Установлена диагностическая значимость разработанных селективных питательных сред и показана перспективность их использования для выделения бактерий рода Haemophilus и N. meningitidis в лабораторной практике.
Разработана и передана на экспертизу в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича нормативно-техническая документация на «Питательную среду для выделения бактерий рода Haemophilus».
Основные положения, выносимые на защиту
Сконструирована питательная среда для выращивания бактерий рода Haemophilus и вида Neisseria meningitidis на основе, состоящей из кислотного гидролизата казеина, препарата «Аминопептид» и дрожжевого экстракта, с добавлением экстракта семян льна, обладающая достаточно высокими ростовыми свойствами.
Селективные свойства разработанных питательных сред достигнуты за счёт введения антибиотических добавок: для выделения бактерий рода Haemophilus - бацитрацина и вида N. meningitidis - смеси ванкомицина и колистина в определённых концентрациях.
3. Предложенные селективные питательные среды имеют высокую
диагностическую ценность и не уступают по качеству импортным
коммерческим селективным средам («шоколадныму агару «Haemophilus»» и
«шоколадному агару с добавкой PolyViteX» и ингибиторной смесью VCN,
bioMerieux, Франция). Среда для выделения менингококка превосходит
используемую в практике здравоохранения среду с добавлением сыворотки и
линкомицина по подавлению роста посторонней микрофлоры, в том числе,
непатогенных нейссерий.
Апробация работы состоялась 17 декабря 2007 года на научной конференции отдела микробиологии ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН. Материалы диссертационной работы доложены на 1 Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов» (Москва. 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006), на заседании секции медицинской и фармацевтической микробиологии Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в их числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 патент и 2 в материалах и тезисах докладов.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 124 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 37 таблицами и 8 рисунками, состоит из введения, 2 глав обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 129 источников, из них 86 отечественных работ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Физиолого-биохимические особенности бактерий рода Haemophilus H.N. meningitidis
Как известно, бактерии рода Haemophilus и N. meningitidis относятся к микроорганизмам, весьма требовательным к питательным веществам и факторам роста.
Бактерии рода Haemophilus являются неподвижными грамотрицательными неспорообразующими факультативно анаэробными полиморфными палочками. Большинство этиологически значимых видов, к которым в первую очередь относится Н. influenzae, нуждаются в готовых факторах роста, присутствующих в крови, особенно в факторе X (термостабильный, представляет собой группу тетрапирольных соединений, входящих в состав железосодержащих пигментов, например, гемин) и в факторе V (термолабильный, НАД, или НАДФ, соответственно, никотинамидадениндинуклеотид или никотинамидадениндинуклеотид-фосфат). Потребность в этих факторах является критерием внутриродовой дифференциации бактерий рода Haemophilus (таблица 4), являющихся хемоорганотрофами, даже при наличии X и V факторов роста они растут лучше на средах сложного состава [58].
Таким образом, Н. influenzae обладают цитохромоксидазой и каталазой, нуждаются в V и X факторах роста и не обладают В-галактозидазной активностью. Это является основными дифференциально - диагностическими признаками данного вида микроорганизмов. По способности гидролизовать мочевину, образовывать индол и орнитиндекарбоксилазу виды К influenzae и H.parainfluenzae различаются, и эти признаки можно использовать для биохимического типирования штаммов видов, что видно в таблице 5 в отношении Н. influenzae.
N. meningitidis - относятся к роду Neisseria, неподвижные грамотрицательные неспорообразующие аэробные кокки, способные к капсулообразованию (в организме человека), оксидазоположительные. В мазках патологического материала клетки видны в виде попарно расположенных уплощённых кофейных зёрен; на поверхности кокка -располагаются пили, единичные или в виде пучков [13, 53]. Как отмечено выше, менингококк требует для своего роста сложных полноценных питательных сред, содержащих готовые аминокислоты, факторы роста, витамины, поэтому к богатым питательным основам добавляют 20 % нормальной лошадиной сыворотки или 5 % крови. Они очень чувствительны к температуре и при отклонении от оптимума (37С) рост прекращается. Рост заметно улучшается при наличии 5 - 7 % ССЬ в окружающей среде. В отличие от других нейссерий, колонии N. meningitidis никогда не бывают пигментированы. Биохимически менингококк малоактивен, содержит ферменты, расщепляющие только глюкозу и мальтозу до органических кислот без газа (таблица 6). Менингококк чувствителен к пенициллину и его полусинтетическим производным, к левомицетину, цефалоспоринам, фторхинолонам; он устойчив к ристомицину, полимиксину, ванкомицину и линкомицину [13, 53]. На основании различий в химической структуре капсулу N. meningitidis подразделяют на серологические группы: у больных чаще выделяют серогруппы А, В и С, а у бактерионосителей и, чаще при спорадической заболеваемости, - серогруппы X, Y, Z, 29-Е и W-135. Следует отметить, что среди населения у носителей циркулируют бескапсульные нетипируемые штаммы [53].
Известно, что микроорганизмы, которые выращивают в средах, не обеспечивающих их питательные потребности, могут находиться в состоянии стресса [4]. С другой стороны, лимитирование различных факторов питания, например, ионов железа при выращивании менингококка, может приводить к дополнительной экспрессии белков наружной мембраны, что коррелирует с увеличением вирулентности, в то время, как в сбалансированной среде экспрессия этих белков не наблюдается [116]. В тоже время при разработке вакцин нового поколения, в частности, для профилактики менингококковой В-инфекции, большое внимание исследователи уделяют именно белкам наружной мембраны [26].
Микробиологические питательные среды по своему назначению условно можно разделить на две основные группы: диагностические для лабораторно - клинических исследований и производственные для получения биомассы с целью приготовления иммунобиологических препаратов.
Как известно, бактерии рода Haemophilus и вида N. meningitidis относятся к микроорганизмам, весьма требовательным к питательным веществам и факторам роста. Для их выращивания в научных и практических целях, используют нативные полноценные, полусинтетические и синтетические питательные среды [31, 47, 66, 68, 73, 84, 105, 114, 123], к которым для повышения биосинтетических свойств добавляют факторы роста, сыворотку крови животных или кровь. Однако вопрос о разработке стандартных, эффективных, обладающих высокой чувствительностью питательных сред для лабораторной диагностики остаётся всё ещё открытым.
Ещё в 1980г Н.Н. Костюкова с соавт. [47] отметили, что «...в нашей стране не имеется производственного выпуска единой сухой стандартной питательной основы для сред, предназначенных для культивирования и идентификации менингококка». Это же относилось к другим патогенным нейссериям, в частности, к гонококку, и к гемофильной палочке. В связи с этим в 70-80-е годы разработке питательных сред для выделения этих прихотливых микроорганизмов было уделено особое внимание специалистов Дагестанского института по производству питательных сред и НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Была разработана основа - сухой стандартный казеиново-дрожжевой агар (КДА), использование которого, с добавлением 20% нормальной лошадиной сыворотки, при посеве спинномозговой жидкости от больных гнойным менингитом и при выделении менингококка из носоглоточной слизи, обеспечивало высеваемость и сохранение основных биологических свойств изученных штаммов менингококка не ниже, чем на общепринятых средах [47]. При этом особое внимание было уделено стандартизации условий посева и принципов оценки пригодности плотных питательных сред, в частности, для менингококка было предложено использование одного серийного разведения (Ю"5) взвеси культур свежевыделенных и лиофилизированных (музейных) штаммов [17, 48]. Было показано также, что среды на основе КДА, при добавлении лошадиной сыворотки или крови, подходят для гонококка, пневмококка и гемофильной палочки, поскольку они, по чувствительности и сохранению основных биологических свойств изученных штаммов, не уступали сывороточному мясо-пептонному агару и кровяному или «шоколадному» агару на основе переваров мяса и бычьих сердец [18, 19]. Результаты испытания качества сред на основе КДА, приведенные в таблице 7, свидетельствуют о том, что, сухой КДА может быть единой основой сред, используемых для выделения приведенных высокотребовательных микроорганизмов [46], однако производственный выпуск приведенной основы и сред отсутствует.
Статистическая обработка полученных результатов
Лабораторно - диагностические исследования проводили путём обследования контингента детей на носительство бактерий рода Haemophilus и N. meningitidis. G этой целью брали мазки с задней стенки глотки, использовали полужидкую транспортную среду - агар Amies с углём (Сорап, Италия), с которой проводили высевы на разработанные питательные среды и среды сравнения и изучали выделенные культуры.
Первым этапом являлся просмотр выросших колоний и определение наличия среди них подозрительных по морфологии на искомый вид. Бактерии рода Haemophilus на ША образуют серые или серовато-белые слизистые блестящие или «суховатые» колонии с резким «мышиным» запахом (запах индола), на агарах КАЭ и на среде на основе сердечно-мозгового настоя (Difco, BBL, США) - прозрачные выпуклые блестящие колонии с характерным запахом. В окрашенных по Граму мазках из колоний видны грамотрицательные полиморфные палочки, вариабельные по длине -от точечных коккобацилл до образующих нитевидные формы, что в большой степени связано с использованной питательной средой. N. meningitidis на ША образуют нежные сероватые колонии с блестящей поверхностью маслянистой консистенции, на МА с сывороткой и на агаре КАЭ - мелкие голубоватые прозрачные колонии с ровными краями и гладкой поверхностью. В окрашенных по Граму мазках из колоний обнаруживаются грамотрицательные кокки одиночные или, чаще, диплококки, располагающиеся обычно беспорядочно (эффект «рассыпанного гороха»). Колонии непатогенных нейссерий обычно образуют жёлтый пигмент.
Идентификацию бактерий рода Haemophilus (видовую, а иногда и биотипирование) проводили в соответствии с известными свойствами основных представителей рода Haemophilus, населяющих носоглотку, приведенными ранее в таблице 3 [58], а также с использованием коммерческой тест-системы API NH (bioMerieux, Франция).
Для выявления специфического if/6-антигена Н. influenzae в реакции латекс-агглютинации (ЛА) использовали набор Slidex meningite-Kit 5 (bioMerieux, Франция) [51].
Идентификацию N. meningitidis также проводили с использованием коммерческой тест-системы API NH (bioMerieux, Франция). Серогрупповую характеристику выделенных штаммов менингококка проводили в реакции агглютинации на стекле с набором агглютинирующих серогрупповых антисывороток (серогруппы А, В, С, X, Y, Z, W-135, 29Е) (Менгрувид, НИИ вакцин и сывороток, Санкт-Петербург) [51].
Для статистической обработки полученных результатов использовали общепринятые методы, включая непараметрические [2, 25]. Достоверность различий между средними показателями оценивали с помощью критерия Стъюдента, достоверными считали различия при р 0,05 (программа BioStat D).
Для оценки различий в средних тенденциях в независимых выборках использовали непараметрический критерий и (Вилкоксона-Манна-Уитни) [25]. Ранее сотрудниками НИИВС им. И.И.Мечникова была разработана питательная среда КАЭ для выращивания продуцентов ферментов сайт-специфической рестрикции, относящихся к роду Haemophilus, прототипом которой была питательная среда на основе сердечно-мозгового настоя [73], которая при проведении настоящих исследований во всех последующих экспериментах была применена как референс - среда (PC). Изучение накопления биомассы и морфологии Н. influenzae серотипа Ъ 11/64 в этих двух средах (КАЭ и PC) (таблица 10) показало, что по оптической плотности в трёх параллельных экспериментах, среда КАЭ уступает PC (р=0,001), в то время как при изучении морфологии, клетки, выросшие на ней, были более однородны и наблюдалась тенденция к увеличению капсулы.
Конструирование селективной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus
При конструировании селективной питательной среды прежде всего следует учитывать два требования к такой среде: она должна обладать высокими ростовыми свойствами в отношении искомых штаммов, способствующими быстрому развитию крупных колоний, и ингибировать сопутствующую микрофлору. Если первая задача решена, как было показано выше, то для решения второй задачи предстоит проведение специальных исследований, что особенно важно при высевах материала, контаминированного посторонней микрофлорой (при высевах из носоглотки, зева, в отличие от посевов крови, спинномозговой жидкости). Ранее [24] было показано, что бацитрацин фирмы Merck в концентрации 500 мкг/мл подавляет рост тест-штаммов S. aureus, но не ингибирует рост изученных штаммов Н. influenzae. Однако, в начале настоящих исследований при использовании бацитрацина другого производителя (ICN, Германия) было выявлено, что приведенная концентрация несколько тормозит рост штаммов Н. influenzae. В связи с этим было необходимо выяснить, будет ли меняться ингибирующая доза бацитрацина при смене партии антибиотика и фирмы -производителя. В ряде проведенных экспериментов при изучении влияния концентраций бацитрацина фирмы ICN (5; 10; 25; 50; 100; 300 и 500 мкг/мл) была установлена концентрация бацитрацина, равная 100 мкг/мл, не влияющая на рост двух штаммов Н. influenzae серотипа b 11/64 и 8143 при высеве из разведений 10"4 и 10"5 и обеспечивающая через 22-24 ч. рост типичных колоний. При этом, если сравнить концентрации бацитрацина, ингибирующие рост Н. influenzae Ъ 11/64 (при высеве из 109/мл, как проводили в предыдущих исследованиях), очевидно, что по активности в питательной среде 500 мкг/мл бацитрацина фирмы Merck соответствует 300 мкг/мл фирмы ICN и Calbiochem (таблица 13). Ориентируясь в дальнейшем на использовании апробированной партии бацитрацина фирмы ICN, проведено определение концентрации бацитрацина этой фирмы, не влияющей на рост двух штаммов Н. influenzae - серотипа Ъ 11/64 и 8143. При высеве из разведений 10"4 и 10"5 и обеспечивающей через 22-24 ч рост типичных колоний, что соответствует требованиям, предъявляемым к разрабатываемым питательным средам, такой концентрацией оказалась 100 мкг/мл (таблица 14). При этом чувствительность питательных сред с ингибитором и без него (максимальное разведение, дающее рост единичных колоний) для двух изученных штаммов
Н. influenzae составляла 10 .
При изучении концентраций бацитрацина (в приведенном выше диапазоне), ингибирующих рост 8 тест-штаммов отмечено (таблица 15), что даже при высеве из разведения 10"1 уже 5 мкг/мл бацитрацина подавляет рост N. meningitidis и S. pyogenes, а 50 мкг/мл ингибирует рост двух использованных штаммов S. aureus и Е. faecalis. При этом при высеве даже из большого разведения (10"6) не наблюдалось ингибирования роста . coli, Р. aeruginosa и P. mirabilis максимальной (500 мкг/мл) концентрацией бацитрацина.
Таким образом, введение в питательную среду КАЭ+Л бацитрацина фирмы ICN в концентрации 100 мкг/мл оправдано, поскольку при этом не подавляется рост изученных штаммов К influenzae и ингибируется рост возможной сопутствующей микрофлоры (стафилококков, стрептококков, нейссерий, энтерококков). Такую питательную среду можно назвать КАЭ + Л + Б.
В последующих экспериментах были изучены селективные свойства среды КАЭ+Л+Б в отношении двух штаммов Н. influenzae и тест-штаммов S. aureus и Е. faecalis (таблица 16). При высеве смесей штаммов этих микроорганизмов, приготовленных в отношении 1:1 из соответствующих разведений, не происходило ингибирования Н. influenzae, в то же время полностью подавлялся рост S. aureus и Е. faecalis. На среде сравнения (без бацитрацина и факторов роста) две последние культуры давали сплошной рост), а оба штамма Н. influenzae не росли. В монокультуре на среде КАЭ+Л+Б величина КОЕ Н. influenzae соответствовала тому показателю, который был отмечен в смеси. Полученные результаты подтверждают приведенные выше данные о полном подавлении S. aureus и Е. faecalis на разработанной селективной питательной среде.
Таким образом, введение бацитрацина в дозе 100 мкг/мл в разработанную питательную среду КАЭ + Л придаёт ей селективные свойства в отношении бактерий рода Haemophilus. Изучение чувствительности и ингибирующих свойств предложенной питательной среды показало, что она соответствует требованиям, предъявляемым к селективным питательным средам.
Подготовлена и передана в ГИСК им. Л.А.Тарасевича НТД и получен акт сдачи-приёмки продукции для организации выпуска экспериментально лабораторных серий, а в последующем коммерческого выпуска в ОАО "Биомед" им. Мечникова готовой агаровой питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus (КАЭ + Л + Б): КАЭ +Л во флаконах по (300 мл) с приложением в отдельных фасовках факторов роста (НАД, гемин) и бацитрацина, необходимых для конкретного количества среды.
Изучение диагностической значимости питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus (SAH)
При проведении данного исследования на носоглоточное носительство бактерий рода Haemophilus обследовано две группы детей (105 человек) от 8 мес. до 4 лет в доме ребёнка №15 г. Москвы.
Цель первого обследования 62 детей заключалась в выявлении возможного носительства Н. influenzae серотипа b для определения целесообразности последующей вакцинации данного контингента вакциной Акт-Хиб, рекомендованной к применению в России для профилактики заболеваний, вызываемых Н. influenzae серотипа Ъ. При первичном посеве использовали две селективные питательные среды: среду SAH и «шоколадный агар «Haemophilus»» НАЕ (bioMerieux, Франция) (таблица 26). Рост бактерий на обеих средах отсутствовал в материале от двух детей, а изучение типичных по морфологии культур, выделенных от 60 детей, в реакции латекс-агглютинации (ЛА) с /// -сывороткой показало в 3-х случаях наличие Н. influenzae серотипа Ъ только на среде SAH. Тест-система API NH была использована в 5 случаях (из них 3-е положительной ЛА), в которых выявлено 5 штаммов бактерий рода Haemophilus, из них 4 штамма - Н. influenzae и 1 — Н. parainfluenzae.
Использование всего набора сред (АН-для выращивания бактерий рода Haemophilus, АК-контрольная, на которой бактерии рода Haemophilus не растут и AK+V-для дифференциации Н. parainfluenzae, т.к. на ней Н. influenzae не растут), позволило выявить возможность носительства бактерий рода Haemophilus у 57 детей и у 6 из них - Н. parainfluenzae, поскольку для культур, выделенных с SAH в анализах №№ 3, 9, 34, 35, 39,61, был отмечен рост на средах АН и AK+V при отсутствии его на среде АК. Кроме того, у этих культур была выявлена каталазная, цитохромоксидазная и Р-галактозидазная активности. Для остальных культур из 51 анализа при пересеве был отмечен рост только на среде АН прозрачных колоний с типичной морфологией грамотрицательных палочек и отсутствие роста на средах AK+V и АК, что позволило предположить их принадлежность к бактериям рода Haemophilus. При первичном посеве на SAH было выявлено б типов роста культур бактерий рода Haemophilus, приведенных по описанию выросших колоний на рисунке 8: наиболее типичные и чаще встречающиеся - очень мелкие или мелкие колонии в виде сплошного роста (34 из 60 - 57%) и реже - единичные средние или крупные колонии (12 из 60 — 20%).
Характеристика роста культур Н. influenzae, выделенных при первичном посеве на SAH и НАЕ, приведенная в таблице 27, свидетельствует о различиях в цвете и величине колоний, но не в интенсивности роста на обеих средах; положительная латекс-агглютинация с //zTj-сывороткой определена только у 3 штаммов, выделенных на SAH, что было уже отмечено выше. Следует отметить, что после изучения культур, выделенных при первичном посеве на SAH, в ЛА с ///Ь-сывороткой, тестирования с помощью API NH культур, и получении ответа об их принадлежности к Н. influenzae (анализы №№ 32, 33, 50, 55) и Н. parainfluenzae (анализ № 3), эти культуры с SAH и НАЕ были пересеяны не только на среды АН, АК и AK+V, но и изучены в общепринятых тестах. При этом исследовании было установлена идентичность полученных результатов как при пересеве на данный набор сред, так и в тестах (положительных на наличие каталазной и цитохромоксидазной и отрицательного на Р-галактозидазную активность). Совокупность всех данных позволила считать эти культуры выделенные как с SAH, так и с НАЕ, относящимися к Н. influenzae.
Таким образом, при использовании сконструированной селективной питательной среды SAH на ней, как и на НАЕ, было выделено 4 штамма Н. influenzae, что подтверждено API NH, и три из них серотипа Ь, что выявлено при первичном посеве на среду SAH. В результате анализа полученных данных, в связи с невысоким процентом носительства НіЬ-штаммов (выделенных от 3 из 62 детей - 4,8%) было принято решение о нецелесообразности вакцинации данного контингента детей препаратом, содержащим -полисахарид.
Во втором обследовании основная цель заключалась в изучении целесообразности использования при первичном посеве всего набора сред для выделения и идентификации различных видов бактерий рода Haemophilus. По результатам обследования 43 детей (таблица 28) рост в монокультуре бактерий, типичных для бактерий рода Haemophilus, наблюдался только на среде SAH у 30 детей, т.е. у 69,8%. При этом на средах АН, АК, AK+V во всех анализах (100%) отмечен рост смешанных культур, а в 2-х анализах (4,6%) на всех средах, включая SAH, кроме того отмечен рост дрожжеподобных грибов.
