Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. CLASS Обзор литературы CLASS 9
1.1. Физиологические особенности возбудителя псевдотуберкулеза и сопутствующей ему в патологическом материале микрофлоры 9
1.2. Питательные среды для выделения и культивирования псевдотуберкулезного микроба 21
Собственные исследования 31
Глава 2. Материалы и методы 31
2.1. Штаммы 31
2.2. Реактивы, питательные основы, питательные среды 31
2.3. Биохимические методы 33
2.4. Биологические методы 35
2.5. Физико-химические методы 40
2.6. Статистические методы 41
ГЛАВА 3. Разработка состава питательной среды для выделения псевдотуберкулезного микроба .' 42
3.1. Дыхательная активность псевдотуберкулезного микроба в динамике роста при температуре культивирования 28 и 37 С 42
3.2. Влияние на редукцию 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого псевдотуберкулезным микробом соотношения питательных основ и содержания в них аминного азота 51
3.3. Влияние химических соединений на способность псевдотуберкулезного микроба к редукции 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого 56
3.4. Ингибиторы посторонней микрофлоры 60
3.5. Другие факторы роста 63
ГЛАВА 4. Технология получения и характеристика питательной среды для выделения псевдотуберкулезного микроба 66
4.1. Состав питательной среды, технология ее приготовления 66
4.2. Физико-химические показатели среды 69
4.3. Биологические свойства среды 69
4.4. Дыхательная активность псевдотуберкулезного микроба, выращенного на сконструированной среде 79
4.5. Стабильность основных свойств питательной среды для выделения псевдотуберкулезного микроба при хранении 80
ГЛАВА 5. Испытание диагностической ценности сконструи рованной среды в лабораторных и полевых условиях 84
Заключение 93
Выводы 102
Список литературы 104
- Питательные среды для выделения и культивирования псевдотуберкулезного микроба
- Влияние на редукцию 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого псевдотуберкулезным микробом соотношения питательных основ и содержания в них аминного азота
- Физико-химические показатели среды
- Стабильность основных свойств питательной среды для выделения псевдотуберкулезного микроба при хранении
Введение к работе
Актуальность темы. Проблема псевдотуберкулеза в последние два десятилетия становится все более глобальной в плане как территориального распространения, так и интенсивности охвата населения. Эпидемические вспышки псевдотуберкулезной инфекции, возникающие в организованных коллективах, предприятиях общественного питания в разных странах мира, наносят значительный социально-экономический ущерб. В связи с выраженным полиморфизмом клинического течения заболевания лабораторная диагностика псевдотуберкулеза имеет решающее значение. При этом наряду с современными диагностическими методами - полимеразной цепной реакцией, иммунологическим исследованием - классическим и основным доказательством этиологической роли микроорганизма в возникновении инфекционного заболевания остаются выделение и идентификация возбудителя.
В настоящее время для выделения Yersinia pseudotuberculosis применяют дифференциально-диагностические питательные среды, предложенные Г.Д. Серовым с соавт. [69], Г.Я. Ценевой с соавт. [88, 90], среду Эндо, питательную среду для выделения возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза Государственного научного центра прикладной микробиологии (ГНЦПМ, г. Оболенск) [68] и другие. Псевдотуберкулезный микроб вырастает на этих средах, как правило, не ранее чем через 48-72 ч, что увеличивает сроки его выделения и идентификации. Из перечисленных сред только среды Эндо и ГНЦПМ являются средами промышленного изготовления и выпускаются в обезвоженном виде, что значительно упрощает их приготовление на этапе применения. Остальные питательные среды готовятся непосредственно в бактериологических лабораториях, что нередко оказывается затруднительным, особенно в полевых условиях, из-за необходимости подбора питательной основы, введения в основу компонентов среды, корректировки рН, фильтрации, стерилизации. Вследствие этого они менее стандартны, имеют небольшой срок хранения. Кроме того, в состав некоторых пита-
5 тельных сред входят дефицитное и дорогостоящее пищевое сырье и импортные реактивы.
В связи с отмеченным исследования, направленные на разработку эффективных, стандартных, стабильных и удобных в применении питательных сред для вьщеления и дифференциальной диагностики возбудителя псевдотуберкулеза в возможно короткие сроки из дешевого непищевого сырья отечественного производства, актуальны.
При целенаправленном усовершенствовании существующих и создании новых питательных сред необходимо учитывать физиологическое состояние микроба, важным показателем которого является дыхательная (окислительно-восстановительная) активность.
Цель исследования. Целью настоящего исследования является конструирование питательной среды для вьщеления псевдотуберкулезного микроба с учетом влияния ее компонентов на интенсивность окислительного метаболизма микроорганизма.
Задачи исследования. Для выполнения поставленной цели предусматривается решение следующих задач:
изучить дыхательную активность псевдотуберкулезного микроба в динамике роста на питательных средах разного состава, не содержащих ингибиторов, в различном температурном режиме;
оценить возможность использования гидролизатов казеина и кормовых дрожжей в качестве питательной основы среды для вьщеления псевдотуберкулезного микроба;
изучить влияние некоторых химических соединений на. редукцию псевдотуберкулезным микробом 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ) с целью их использования в качестве активаторов роста;
определить оптимальные состав и соотношение ингредиентов питательной среды;
разработать технологию изготовления питательной среды;
провести оценку ростовых свойств сконструированной среды;
исследовать диагностическую ценность сконструированной питательной среды в лабораторных условиях и при осложнении эпидемической ситуации по псевдотуберкулезу.
Научная новизна. Показана возможность целенаправленного конструирования питательной среды для выделения конкретного возбудителя инфекции путем активации его окислительного метаболизма. Выявлено стимулирующее действие на дыхательную активность и рост псевдотуберкулезного микроба марганца сернокислого, натрия лимоннокислого и глюкозы, что позволило использовать их для оптимизации состава питательной среды. Разработана оригинальная по составу и технологии изготовления питательная среда для бактериологической диагностики псевдотуберкулеза, обладающая достаточной чувствительностью и обеспечивающая высокую скорость роста при выращивании на ней возбудителя при 28 и 37 С. Получено решение от 25.09.2000 о выдаче патента по заявке на изобретение № 99111061/13 (011667) "Питательная среда для выделения псевдотуберкулезного микроба", приоритет от 26.05.99.
Научно-практическая ценность. Сконструирована на основе непищевого сырья отечественного производства питательная среда для выделения псевдотуберкулезного микроба, выпускаемая в обезвоженном виде с длительным сроком годности (срок наблюдения более 2 лет). Для практического применения питательную среду получают путем растворения и расплавления навески сухой среды в дистиллированной или водопроводной воде при температуре 100 С (время приготовления - 5-7 мин). Среда стандартна, не требует фильтрации, корректировки рН, стерилизации, добавления ex tempore ингредиентов, чувствительна, обеспечивает высокую скорость роста, характерную морфологию колоний и оптимальное физиологическое состояние микроба.
Разработаны "Методические рекомендации по применению питательной среды для выделения псевдотуберкулезного микроба", одобренные ученым советом Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (НИПЧИ Сибири и ДВ) (протокол № 8 от 14.09.99) и утвержденные директором . института.
Результаты исследования использованы при изготовлении экспериментально-производственных серий питательной среды для выделения Yersinia pseudotuberculosis и в научно-исследовательской работе.
Сконструированная питательная среда прошла испытания в лабораторных условиях и практических учреждениях ЦГСЭН. Во всех случаях получены положительные заключения, рекомендующие ее использование для выделения Y. pseudotuberculosis.
На защиту выносятся следующие положения:
Способ конструирования питательной среды для выделения псевдотуберкулезного микроба с учетом его биологических свойств.
Высокая эффективность сконструированной среды.
Преимущество предложенной питательной среды для выделения псевдотуберкулезного микроба перед отечественными питательными средами, применяемыми для бактериологической диагностики псевдотуберкулеза.
Апробация. Материалы диссертации обсуждены на:
Международной научной конференции "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микросистем". Махачкала, 1998;
Российской научной конференции "Актуальные вопросы инфекционной патологии". Барнаул, 1999;
Юбилейной научно-практической конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии". Оболенск, 1999;
научных конференциях, ученом совете НИПЧИ Сибири и ДВ (1989-2000 гг.).
8 Публикации. По материалам диссертации подготовлено 12 научных работ, 11 из
них опубликованы в центральной печати и региональных сборниках.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных экспериментальных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Объем рукописи составляет 120 страниц, включая 20 таблиц. Список цитированной литературы содержит 100 отечественных и 46 зарубежных источников.
Питательные среды для выделения и культивирования псевдотуберкулезного микроба
Возбудитель псевдотуберкулеза является микроорганизмом, не требовательным к питательным веществам [36, 69, 99]. Тем не менее, перед исследователями на протяжении нескольких десятков лет стояла задача создания чувствительных питательных сред с целью быстрого и надежного выделения псевдотуберкулезного микроба.
При конструировании такой питательной среды возникают определенные трудности, состоящие в том, что возбудитель псевдотуберкулеза относится к семейству энте-робактерий, поэтому физиологически и биологически очень близок к другим представителям этого семейства, в большинстве своем имеющим общую с ним среду обитания (кишечник человека и животных) и также, как и возбудитель псевдотуберкулеза, длительное время сохраняющимися и даже размножающимися в объектах окружающей среды. Следовательно, сопутствующая микрофлора всегда присутствует в исследуемом материале. Кроме того, представители рода Yersinia растут на питательных средах значительно медленнее, чем Е. coli, P. vulgaris и некоторые другие энтеробактерии.
Все вышесказанное затрудняет изоляцию псевдотуберкулезного микроба, а также ставит определенные задачи перед создателями сред для его выделения.
Сложность выделения возбудителя псевдотуберкулеза обусловливает необходимость применения методических приемов, основанных на физиологических особенностях Y. pseudotuberculosis и сопутствующей микрофлоры. В частности, при лабораторной диагностике псевдотуберкулеза используют его психрофильность, устойчивость к действию щелочи и относительную нетребовательность к питательным веществам.
Исследование материала, подозрительного на зараженность иерсиниями, как правило, ведется двумя способами: методом холодового обогащения на средах накопления с последующим высевом на селективные или дифференциально-диагностические среды и методом прямого посева на питательные среды для выделения и дифференциальной диагностики иерсиний.
Методика холодового обогащения, предложенная J.S. Paterson, R.A. Cook [134], заключается в том, что возбудитель псевдотуберкулеза при биологически низкой температуре, опережая рост других микроорганизмов, успешно размножается в бедной органическими веществами среде.
Средами накопления являются фосфатно-буферный раствор (ФБР), буферно-казеиново-дрожжевая среда, среда Серова жидкая, среда Раппопорт жидкая, 1 %-ная пептонная вода с добавлением 1 мл 1 %-ного спиртового раствора кристаллического фиолетового на 1 л среды, магниевая среда [34].
На средах накопления микроб подращивают при температуре 4-8 С в течение 7-15 дней. Высевы на агаризованные среды проводят на 2-3, 5 и 7-е сутки, а из ФБР - дополнительно на 10-15-е сутки.
Для сокращения сроков выделения иерсиний предложен ряд методов, позволяющих получить чистую культуру в более сжатые сроки.
Ф.Г. Дятлов с соавт. [ЗО], Г.Я. Ценева с соавт. [89] для повышения интенсивности размножения иерсиний предложили вводить в фосфатно-буферный раствор 0.2 % гид-ролизата казеина и 0.5 % экстракта дрожжей, благодаря чему модифицированная среда накопления по эффективности на 50 % превосходит исходную фосфатно-буферную смесь, а сроки выделения сокращаются в 2-3 раза.
В качестве среды накопления рекомендован также фосфатно-буферный раствор с добавлением 0.2 % бентонина, в который исследуемый материал вносят в соотношении 1:1. Посевы инкубируют 18-20 ч при температуре 25-29 С. Этот способ, по мнению авторов, позволяет повысить чувствительность среды в 3.7 раза и ускорить бактериологическую диагностику в 7.5 раз [6]. Однако апробация среды с бентонитовыми глина 23 ми, проведенная в НИПЧИ Сибири и ДВ, не выявила преимуществ ее перед другими средами накопления иерсиний [54].
Для повышения скорости роста микроба на питательных средах, применяемых в диагностике кишечного иерсиниоза, к забуференному 0.9 %-ному раствору натрия хлорида или среде Эндо предложено добавлять по 4 мг натриевой соли рибонуклеиновой кислоты на 1 мл среды. На той и другой средах культуры псевдотуберкулезного микроба выделяли на второй-третий день исследования [61].
При выделении возбудителей иерсиниоза и псевдотуберкулеза из воды Г. С. Андреева с соавт. [8] рекомендовала использовать жидкую среду Серова в концентрированном виде, а 1 %-ную лептонную воду заменить 10 %-ным раствором пептона. Применение таких сред позволило увеличить объем исследуемой воды в одной пробе с 5-10 мл до 450 мл и,таким образом,во много раз увеличить вероятность положительного результата.
Более сложной по составу солевой средой, чем рассмотренные выше, является среда, включающая натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий хлористый, магний сернокислый [46], однако существенных преимуществ перед другими эта накопительная среда не имеет.
Оригинальный метод ингибиции посторонней микрофлоры разработал В.И. Дунаев с соавт. [29]. В соответствии с рекомендациями авторов, инфицированный материал вносят в дистиллированную воду и посевы инкубируют при температуре минус 6-12 С в течение 24 ч, затем при температуре минус 30 С 30 мин. Далее исследуемый материал оттаивают при 4-8 С, подращивают при комнатной температуре в течение 24-36 ч и пересевают на агаризованные среды. При описанной процедуре выделение чистой культуры возможно через 3-4 сут.
При выдерживании сред накопления с посевами инфицированного материала в течение 48 ч при 6 С и 24 ч при 26 С с последующим посевом на агаризованные диф 24 ференциально-диагностические среды выделение чистой культуры достигается на 4-5 сут [59,123].
Вслед за обогащением в средах накопления при биологически низкой температуре логически следует высев материала на среду, обладающую способностью дифференцировать псевдотуберкулезный микроб и сопутствующую микрофлору. Принцип создания таких сред - внесение ингибиторов посторонней микрофлоры или стимуляторов роста возбудителя псевдотуберкулеза, а также веществ, способствующих дифференциации Y. pseudotuberculosis от посторонних микроорганизмов.
За рубежом для выделения и дифференциальной диагностики возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза более или менее широко применяют селективную иерсиниозную среду, диоксихолат-цитрат-маннитол агар, агар Лейфсона, Мас-Conkey s агар, пектиновый агар [145], цефсулоидин-иргазан-новобиоцин агар (CJN) [126], Salmonella-Schigella агар (SS-агар), m-MAC, диоксихолат-цитрат-лактоза агар, Schilmann-CJN [111, 117], триптический соевый агар с добавлением 6 %-ного дрожжевого экстракта, лизин-аргининовый агар с солями железа [112].
В России в 1948 г. В.М. Туманский [84] предложил питательную среду для выделения иерсиний, в которой ингибитором посторонней микрофлоры является кристаллический фиолетовый (1:100000).
Влияние на редукцию 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого псевдотуберкулезным микробом соотношения питательных основ и содержания в них аминного азота
Основным требованием при конструировании питательных сред является использование доступного, дешевого непищевого сырья отечественного производства. В связи с этим в качестве основы питательной среды для выделения псевдотуберкулезного микроба нами апробированы сухие гидролизаты казеина и кормовых дрожжей, производимые в соответствии с РП № 983-00 [65]. Выбор этих гидролизатов не был случайным, ибо они уже применяются в качестве белковых основ при производстве ряда микробиологических сред, в том числе питательной среды для выделения и культивирования Y. pestis (ВФС-42-3204-98) - представителя рода Yersinia.
Казеин (ГОСТ 17726-81) является побочным продуктом молочной промышленности, который получают из обезжиренного коровьего молока путем коагуляции содержащегося в нем белка. Известно, что казеин на 90 % состоит из белка, а его ферментативные гидролизаты содержат необходимые для роста микроорганизмов аминокислоты, в частности, - триптофан и лизин.
По данным лаборатории питательных сред НИПЧИ Сибири и ДВ [23], гидролизаты казеина, полученные с помощью поджелудочной железы крупного рогатого скота, содержат 16-18 аминокислот, нуклеиновые кислоты, микроэлементы - магний (0.69 мг/л), кальций (0.8 мг/л), медь (0.65 мг/л), цинк (4.9 мг/л), железо (6.4 мг/л), фосфор (0.71 мг/л), калий (0.14 мг/л), натрий (1.9 мг/л).
Кормовые дрожжи (ГОСТ 20083-74) представляют собой порошок коричневого цвета, содержащий от 36 до 44 % белка. Их получают на гидролизных заводах из технически чистых культур дрожжей, выращенных на различных субстратах гидролизно-спиртового и гидролизно-дрожжевого производств. Нами проведена сравнительная оценка пригодности кормовых дрожжей, производимых различными заводами Иркутской области, для получения ферментативных гидролизатов и их возможного использования при приготовлении питательных сред для возбудителей бактериальных инфекций [41].
Ферментативные гидролизаты кормовых дрожжей получали по методике, изложенной в авторском свидетельстве № 742463 [3]. В полученных гидролизатах определяли рН, содержание общего и аминного азота, пептонов и хлоридов. Аминокислотный состав гидролизатов изучали на аминокислотном анализаторе Т-339 (Микротехника, ЧССР).
Химическая характеристика гидролизатов, полученных из кормовых дрожжей разных заводов Иркутской области, представлена в таблице 6.
Из материалов таблицы следует, что в результате ферментативного процесса образуются гидролизаты средней степени расщепления, содержащие как свободные аминокислоты, так и продукты полураспада белка - пептоны, что отвечает основным требованиям, предъявляемым к питательным основам.
Общеизвестно, что ценность питательных основ в значительной мере определяется их аминокислотным составом. Приведенные в таблице 7 материалы показывают, что по качественному аминокислотному составу гидролизаты казеина и кормовых
дрожжей практически равноценны, за исключением отсутствия в первом цистеина. В количественном отношении различия более существенны. Казеиновые гидролизаты значительно (в 2-5 раз) превосходят дрожжевые по содержанию большинства аминокислот - серина, треонина, глицина, лейцина, изолейцина, лизина, аргинина, триптофана, гистидина, глутамина, но уступают по содержанию треонина. Очевидно отсюда, что при объединении гидролизатов казеина и кормовых дрожжей аминокислотный состав и в качественном, и в количественном отношениях взаимно дополняется, что позволяет сделать питательную основу более соответствующей задачам исследования. Гидролизаты кормовых дрожжей производства разных заводов по химическим показателям различаются незначительно. Они, по нашим данным, имеют сходный аминокислотный состав (содержат до 18 аминокислот), включают комплекс витаминов группы В, биостимуляторы, микроэлементы - магний (1.6 мг/л), кальций (0.55 мг/л), медь (0.65 мг/л), цинк (4.5 мг/л), железо (13.7 мг/л), фосфор (0.93 мг/л), калий (1.6 мг/л), натрий (2.0 мг/л). Однако по физическим свойствам, в частности по окраске, гидролизаты кормовых дрожжей Тулунского завода как более светлые наиболее пригодны при производстве питательных сред для возбудителей бактериальных инфекций.
Опыт многолетнего успешного использования ферментативных гидролизатов казеина и кормовых дрожжей для приготовления питательных сред для культивирования и дифференциальной диагностики возбудителей бактериальных инфекций свидетельствует о том, что по химическому составу ферментативные гидролизаты вполне обеспечивают физиологические потребности микроорганизмов. Результаты, полученные нами при определении дыхательной активности Y. pseudotuberculosis в динамике роста при разных температурах, показали возможность использования ферментативных гидролизатов казеина и кормовых дрожжей при конструировании питательной среды для его выделения.
Физико-химические показатели среды
Чувствительность является одним из важнейших показателей качества диагностических питательных сред. Чувствительность сконструированной среды изучали с использованием широкого спектра штаммов возбудителя псевдотуберкулеза, по антигенной структуре относящихся к I, II, III, V, VI серологическим вариантам. Поскольку морфология псевдотуберкулезного микроба зависит от наличия родоспецифической плазмиды вирулентности иерсиний молекулярной массой 45-47 MDa, в работе использовали 3 штамма Y. pseudotuberculosis, содержащих плазмиды - 91 (р47), И-716 (р47:82), И-722 (рЗ,4:47), - и 7 плазмидонегативных штаммов (И-53, И-66, И-67, И-68, И-70,И-199,И-685).
В качестве контрольной применяли питательную среду для культивирования чумного микроба, серия 19 (ФС 42-3609-98), не содержащую ингибиторов.
Чувствительность сконструированной среды определяли при посеве из разведений бактериальной культуры 10"6 и 10 7 и оценивали по максимальному разведению культуры, при котором на всех засеянных чашках обнаруживали рост микроба при температуре инкубации 28 и 37 С, скорость роста - по минимальному времени инкубации посевов, достаточному для выявления роста культуры. Характер роста псевдотуберкулезного микроба и морфологию колоний изучали визуально и просмотром с применением светового микроскопа.
Установлено, что при температуре 28 С через 18 ч культивирования на всех засеянных чашках появляется росинчатый рост возбудителя псевдотуберкулеза. Через 22-24 ч колонии на опытной среде имели достаточные размеры (от 1.0 до 1.5 мм), типичные морфологию и цвет, что позволяло выделить культуру. Таким образом, скорость роста псевдотуберкулезного микроба на опытной среде составляла 24 ч.
По количеству выросших при температуре инкубации 28 С колоний псевдотуберкулезного микроба предлагаемую питательную среду можно характеризовать как высокочувствительную: рост регистрировали на всех засеянных чашках при посеве 10 м.к. У разных штаммов вырастало от 6.0 до 9.7 (в среднем 8.311.4) колоний. По этому показателю сконструированная среда не отличается существенно от контрольной (8.111.2). При температуре культивирования 37 С, как и при 28 С, отчетливый, видимый без микроскопа росинчатый рост псевдотуберкулезного микроба и на экспериментальной, и на контрольной средах появляется через 18 ч инкубации. Через 24 ч формируются типичные колонии возбудителя псевдотуберкулеза размером 1.0-1.5 мм.
При посеве на испытуемую и контрольную среды по 10 микробных клеток при температуре 37 С вырастает в среднем соответственно 6.0±1.0 и 6.1+1.2 колоний, причем различия в показателях чувствительности статистически не достоверны (табл. 12).
На испытуемой среде, как и на контрольной, одинаково успешно удается определить рост возбудителя псевдотуберкулеза не только в гладкой (S), но и в переходных (OS, OR) и шероховатой R-формах.
На сконструированной питательной среде плазмидосодержащие штаммы (Т+) Y. pseudotuberculosis независимо от температуры культивирования (28 или 37 С) образуют колонии несколько меньших размеров (0.5-1.0 мм), чем штаммы, не имеющие плазмид (Т). Колонии при микроскопии - выпуклые, зернистые, темного цвета.
При выращивании параллельно на испытуемой и контрольной средах плазмидо-содержащего штамма Y. pseudotuberculosis 91 (р47) при температуре 28 С на контрольной среде отмечена диссоциация клеток на Т+- и Т-варианты при стабильном характере свойств штамма на испытуемой среде. При температуре 37 С диссоциацию названного штамма отмечали как на контрольной, так и на сконструированной средах. Штамм И-722 при культивировании при температуре 37 С расщеплялся на Т+- и Т"-колонии только на контрольной среде. 4.3.2. Ингибирующие и дифференцирующие свойства среды
При изучении этих показателей на сконструированную и контрольную - питательная среда с бромтимоловым синим Г.Я.Ценевой с соавт. (СБС) - среды высевали как чистые культуры Y. pseudotuberculosis И-199, так и в смеси с Y. enterocolitica 76, Е. coli К-12 и P. vulgaris 14. Посевная доза при посеве чистых культур составляла 10 м.к. в 0.1 мл, при посеве смесей посевная доза микробов-ассоциантов превышала посевную дозу возбудителя псевдотуберкулеза в 10 раз. Контроль посевной дозы осуществляли высевом на питательную среду для культивирования чумного микроба, серия 19 (ФС 42-3609-98). Результаты опытов учитывали через 24 и 48 ч инкубации посевов при температуре 28 С.
Ингибирующее действие сконструированной среды на псевдотуберкулезный микроб и микробы-ассоцианты оценивали сравнением количества и размеров колоний, выросших на испытуемой среде и среде, не содержащей ингибиторов (контроль посевной дозы). Дифференцирующие свойства среды при посеве смесей определяли по величине, структуре и цвету колоний, изменению цвета среды под колониями или вокруг них, наличию или отсутствию у колоний выпуклого темного центра.
Стабильность основных свойств питательной среды для выделения псевдотуберкулезного микроба при хранении
С целью углубленной объективной оценки мы совместно с сотрудниками отдела микробиологии чумы НИПЧИ Сибири и ДВ в сравнительных экспериментах изучили и сопоставили ростовые свойства сконструированной питательной среды для выделения псевдотуберкулезного микроба, с одной стороны, и широко применяемых в бактериологической практике сред: Г.Д. Серова с соавт., Г.Я. Ценевой с соавт. (СБС), питательной среды для выделения возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза -ГНЦПМ (г. Оболенск).
Поскольку известно, что на морфологию колоний Y. pseudotuberculosis влияет наличие родоспецифической плазмиды вирулентности иерсиний молекулярной массой 45-47 MDa [10, 95, 96], в опыты наряду со штаммом Y. pseudotuberculosis И-53, лишенным плазмиды, включили плазмидосодержащие штаммы И-716 (р47:82), И-722 (рЗ,4:47) и 91 (р47). Культуры выращивали при 28 и 37 С в течение 48 ч, результаты роста учитывали через 18, 24 и 48 ч, колонии просматривали с помощью светового микроскопа (окуляр 7, объектив 8) и визуально. Ростовые свойства питательных сред оценивали согласно существующим рекомендациям по контролю питательных сред по биологическим показателям [48]. Результаты исследования представлены в таблице 19.
Через 18 ч инкубации посевов при 28 С (в таблице не нашло отражения) рост мелких (диаметром менее 0.5 мм) колоний наблюдали только на испытуемой среде для выделения псевдотуберкулезного микроба.
Через 24 ч инкубации при 28 С на всех - опытной и контрольных - средах при посеве 10 и 100 м.к. формировались колонии, поддающиеся визуальному количественному учету. С некоторым отставанием по скорости роста развивались на среде Серова: через 24 ч не рос ни один из четырех штаммов при посеве 10 м.к.; при посеве 100 м.к. не рос 85 ли плазмидосодержащие штаммы Y. pseudotuberculosis. На средах ГНЦПМ и СБС росли все опытные штаммы при посеве 10 и 100 м.к.
Примечание: (-) отсутствие видимого роста
Колонии, выросшие на сконструированной среде, серовато-голубоватого цвета с темным, исчерченным, выпуклым центром и обширной полупрозрачной периферией с волнистым краем. Колонии возбудителя псевдотуберкулеза на среде Серова - сухие, бледно-вишневого цвета, матовые, с неровными краями и темным центром, легко сдвигаются по поверхности агара бактериологической петлей. На СБС колонии Y. pseudotuberculosis - мелкие, сухие, выпуклые, матово-голубые, с фестончатыми краями и приподнятым темным центром. На среде ГНЦПМ все исследуемые штаммы псевдотуберкулезного микроба формируют однородные колонии, окрашенные в голубовато-зеленый цвет, блестящие, с темным центром и фестончатым краем. Через 24 ч выращивания колонии Y. pseudotuberculosis на сконструированной среде и питательной среде для культивирования чумного микроба по размеру (d 1.0 мм) превосходят колонии, выросшие на средах Серова, СБС и ГНЦПМ, диаметр которых был значительно меньше 1.0 мм, что затрудняло их изоляцию и выделение.
Через 48 ч выращивания на сконструированной среде и питательной среде для культивирования чумного микроба колонии возбудителя псевдотуберкулеза также имели более крупные размеры (диаметр 2-3 мм), чем на средах Серова, СБС и ГНЦПМ (диаметр 1-2 мм, 1-3 мм, 1-2 мм соответственно).
При культивировании посевов при 37 С в течение 18 ч рост штаммов Y. pseudotuberculosis на всех средах отсутствовал. Через 24 ч появлялся визуально регистрируемый росинчатый рост колоний на сконструированной (за исключением штамма И-722), Серова и питательной среде для культивирования чумного микроба, однако на среде Серова скорость роста возбудителя была несколько ниже, чем на сконструированной среде и питательной среде для культивирования чумного микроба. На СБС и среде ГНЦПМ возбудитель псевдотуберкулеза не рос. Показатели чувствительности сред и скорость роста бактерий в этих условиях не зависели от плазмидного состава псевдотуберкулезного микроба. К 48 ч выращивания на опытной и контрольных средах, кроме СБС, количество колоний достигало максимума у всех штаммов, а размеры колоний к этому сроку при 28 и 37 С были одинаковы. На СБС рост всех штаммов при посеве 10 и 100 м.к. по-прежнему отсутствовал. На среде ГНЦПМ не регистрировали рост У. pseudotuberculosis 91.
Выявлена зависимость характера формируемых колоний псевдотуберкулезного микроба от плазмидного спектра штаммов. Колонии, сформированные плазмидосодер-жащими клонами (Т+), характеризовались мелкими размерами (0.5-1.0 мм), при микроскопии они выпуклые, зернистые, темного цвета. Диссоциация клеток в направлении Т+— Т-вариантов при 28 С наблюдалась на средах Серова, СБС и питательной среде для культивирования чумного микроба у штамма Y. pseudotuberculosis 91 (р47). На сконструированной нами среде и среде ГНЦПМ колонии в этих условиях однородны по величине и морфологии. При 37 С диссоциация клеток штамма отмечалась на сконструированной, Серова и питательной среде для культивирования чумного микроба. Клетки штамма Y. pseudotuberculosis И-716 (р 47:82) ни при 28, ни при 37 С не диссоциировали и вырастали на всех питательных средах в виде однородных по морфологии колоний. Плазмидсодержащие клетки еще одного - Y. pseudotuberculosis И-722 (р 3,4:47) - при 28 С ни на одной питательной среде не диссоциировали, а при 37 С расщеплялись на Т+ и Т -варианты только на среде для культивирования чумного мик-. роба. У штамма Г. pseudotuberculosis И-53, клетки которого не содержат плазмид, диссоциации не наблюдалось.
В результате проведенной работы установлено, что на сконструированной среде одинаково хорошо растут все испытанные штаммы возбудителя псевдотуберкулеза, независимо от его биологических свойств, при температуре 28 и 37 С. Вероятно, благоприятные условия роста микроба обусловлены наличием в среде компонентов, активизирующих окислительно-восстановительные процессы микроорганизма, которые в значительной степени определяют темп роста клетки.
Созданная нами питательная среда для выделения псевдотуберкулезного микроба прошла комиссионные испытания в Центре государственного санитарно-эпидемиологического надзора (ЦГСЭН) в Иркутской области, в эпидемиологическом отделе НИПЧИ Сибири и ДВ, при вспышке иерсиниоза в школе-интернате № 6 г. Зимы Иркутской области, ЦГСЭН в г. Зиме и Зиминском районе. Акты.испытания прилагаются.
Специалисты лаборатории особо опасного отдела ЦГСЭН при апробации среды (акт испытания от 22.12.99) использовали 16 штаммов Y. pseudotuberculosis и 60 штам 88 мов Y. enterocolitica , выделенных в Иркутской области (гг. Иркутск, Усть-Илимск, Же лезногорск, Зима). В качестве контрольной служила среда Г.Д. Серова с соавт.
При выращивании штаммов псевдотуберкулезного микроба при температуре 28 С через 18 ч появлялся росинчатый рост на сконструированной среде и отсутствовал - на среде Серова. Через 24 ч на сконструированной среде возбудитель псевдотуберкулеза вырастал в виде суховатых колоний бледно-голубого цвета с интенсивно окрашенным в синий цвет центром, исчерченной поверхностью и неровным краем, диаметром до 1.0 мм. Колонии Y. enterocolitica к этому сроку имели ровные края, достигали в диаметре 1.0-2.0 мм и были окрашены в голубой цвет. На среде Серова колонии Y. pseudotuberculosis появлялись лишь через 48 ч культивирования при 28 С.
В акте испытания сконструированной среды отмечено, что среда проста в приготовлении, обладает элективностью и может использоваться в практических лабораториях для выделения иерсиний.
