Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Современные представления о бактерицидных системах клеток врожденного иммунитета 9
1.1.1. Бактерицидные системы нейтрофилов 10
1.1.2. Бактерицидные системы макрофагов 21
1.2. Антиинфекционная резистентность при псевдотуберкулезе 25
1.2.1. Участие клеток врожденного иммунитета в пато- и морфогенезе заболевания 26
1.2.2. Механизмы защитных реакций макроорганизма в зависимости от генетически детерминированной вирулентности бактерий рода Yersinia 29
Собственные исследования
Глава 2. Материал и методы
2.1. Инфекционные агенты и экспериментальные животные 36
2.2. Методы выделения фагоцитирующих клеток и их культивирование 37
2.3. Методы оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток 38
2.4. Методы микроскопии 43
2.5. Методы статистической обработки данных 45
Глава 3. Морфофункциональные изменения клеток врожденного иммунитета при заражении разными плазмидными вариантами yersinia pseudotuberculosis в системе in vitro 46
3.1. Морфологические изменения инфицированных клеток - нейтрофилов и макрофагов 48
3.2. Ферментативные изменения инфицированных нейтрофилов и макрофагов 62
Глава 4. Морфофункциональная характеристика эффекторных клеток воспаления при псевдотуберкулезной инфекции (система in vivo) 72
Глава 5. Клеточные повреждения в гистопатологии псевдотуберкулеза, вызванного разными плазмидными вариантами yersinia pseudotuberculosis 85
Заключение 98
Выводы 108
Список сокращений 110
Список литературы
- Антиинфекционная резистентность при псевдотуберкулезе
- Механизмы защитных реакций макроорганизма в зависимости от генетически детерминированной вирулентности бактерий рода Yersinia
- Методы оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток
- Ферментативные изменения инфицированных нейтрофилов и макрофагов
Антиинфекционная резистентность при псевдотуберкулезе
Известно, что для нейтрофилов характерны два хорошо различаемых состояния: исходное, с низким уровнем протекания метаболических процессов, и активированное, переход в которое обусловлен взаимодействием клеток с различными стимуляторами, в том числе и с бактериями (Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А., 1999; Conlan J.W., 1997). Наиболее яркий результат этого взаимодействия - усиление метаболизма, миграции, адгезии, дегрануляции и, в конечном счете, резкое увеличение потребления клетками глюкозы, кислорода, повышение активности ферментов, образование активных форм кислорода (АФК) и других прооксидантов, продуктов активации липо- и циклооксигеназ. Это явление, применительно к фагоцитам, получило название прайминга (Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А,. 1999; Pabst M.J., 1994), означающего подготовку и переход клеток в рабочее состояние. В дальнейшем следует фагоцитоз, осуществляемый с помощью механизма, действующего как замок-молния (от англ. zipper), т.е. последовательного распознавания патогенов рецепторами мембраны фагоцитов, после чего происходит поглощение микробов посредством инвагинации плазматической мембраны клеток и образование фагоцитарной вакуоли (Yoshida S. et al, 2009). Внезапность и скорость, с которыми развиваются данные реакции, послужили поводом назвать это явление «кислородным» или «респираторным взрывом» суть которого состоит в том, что фагоциты резко увеличивают потребление кислорода (Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А., 1999; Брудастов Ю.А. и др., 2008).
По мнению многих авторов (Klebanoff S.J., 2005; Labro М.Т., 2000; Witko-Sarsat V. et al., 2000), кислородзависимые и кислороднезависимые системы могут действовать как самостоятельно, так и синергично.
На данный момент накоплено множество подтверждений тому, что нейтрофилы человека являются как мишенью, так и источником различного рода цитокинов, хемокинов и факторов роста. Цитокины могут усиливать некоторые функции нейтрофилов, включая их способность к связыванию с клетками эндотелия и к синтезу АФК (Batandier С. et al., 2002; Bacellar О. et al., 2009).
Исторически сложилось, что кислородзависимая система является уникальной и ее реактивное действие внутриклеточно ограничено в нейтро филах, а также в некоторых других фагоцитирующих клетках (Johansson A. et al., 1995; Granfeldt D. et al 2002). Кислородзависимая бактерицидная система нейтрофилов (Witko-Sarsat V. et al., 2000; Брудастов Ю.А. и др., 2008) включает: 1. Систему НАДФН - производных оксидантов; 2. Миелопероксидазно-Н202-хлоридную систему) - путь образования гидроксильного радикала при участии МПО.
НАДФН-производные оксиданты Активизация метаболизма кислорода, рассматриваемая как респираторный взрыв, в первую очередь запускает НАДФ-оксидазу, также известную как фагоцитарная оксидаза или оксидаза кислородного взрыва (Кулинский В.И., 1999; Babior В.М., 2004; A. Vazquezorres et al., 2000). Субклеточная локализация этого комплекса хорошо изучена в нейтрофилах и его присутствие отмечается, помимо плазмалеммы, на мембранах азурофильных гранул (Babior В.М.,2004; Witko-Sarsat V. et al., 2000). Комплекс включает 4 белковых компонента, молекулярные массы которых вошли в их названия - р40р ох, (РНОХ - расшифровывается как PHagocyte Oxidase I фагоцитарная оксидаза); p40phox, p47phox, и p67phox - являются цитозольными, a p22phox и gp91phox - мембранными белками. Все они в совокупности составляют гетеродимерный флавогемопротеин, известный как цитохром Ь558 (Babior, В.М.2004; Clark RA. 1999; Bey E.A. et all 2004, Takehiko Ueyama 2007). Разделение двух групп компонентов по локализации в отдельных субклеточных компартментах фагоцитов гарантирует инактивацию оксидаз, находящихся в состоянии «redox» (покоя). При активизации нейтрофилов р47р ох фосфорилируется, и цитозольные компоненты мигрируют в плазматическую мембрану, где соединяются с цитохромом Ь558 для сборки активной оксидазы.
Во многих литературных источниках (Witko-Sarsat V. et al, 2000, Allen L. A. et al., 2005, Filina J.V. et al., 2014) указывается, что продукт восстановления НАДФ-оксидазного комплекса супероксидный радикал - CV является начальным материалом для продукции обширного ряда реактивных оксидантов, включающих окисленные галогены, свободные радикалы и синглетный кислород. Эти окислители используются для уничтожения поглощенных микроорганизмов. Но они также вызывают повреждения окружающих тканей (Labro М.Т. 2000; Witko-Sarsat V. et al., 2000), вследствие чего их формирование должно быть отрегулированным (Batandier С. et al., 2002).
Преобразование супероксидного аниона - 02" в следующий мощный окислительный компонент - перекись водорода Н2Ог - может происходить спонтанно или катализироваться супероксиддисмутазой. Известны четыре потенциальных механизма преобразования перекиси водорода в фагоцитах (Hampton М.В., Kettle A.J., 1998; Klebanoff S.J., 2005). При этом у нейтрофилов существует два механизма производства гидроксильных радикалов: 1) супероксид-зависимая реакция (реакция Фентона) между перекисью водорода и соответствующим металлопереносящим катализатором (Kjeldsen L. et al., 1993) и 2) реакция НОСІ с супероксидом при участии ионов железа - реакция Осипова (Осипов А.Н., 1993).
Первый механизм реализуется при участии сульфата железа, где донором электрона является свободный радикал-анион супероксид -Ог , результатом которого является образование гидроксильного радикала (ОН ) (Кулинский В.И., 1999): Н202+ Fe2+ = ОН + 2HO"+Fe3+
Этот вторичный радикал с коротким диапазоном действия чрезвычайно реактивный, способен реагировать с большинством биологических молекул, вызывает модификацию и повреждение ДНК, инактивацию ферментов, пероксидацию липидов, а также генерирует вторичные радикалы из бикарбонатов, хлоридов и других соединений. Посредством вышеописанного механизма клетки накапливают в больших количествах гидроксильные радикалы. Реакция Фентона может протекать более ярко in vivo при условии, что молекулы или клетки-мишени снабжают нейтрофилы железом (Rosen G.M. et al., 1995; Miller R.A., Britigan B.E., 1997).
В реакции Осипова гидроксильный радикал образуется преимущественно при участии ионов хлора. При взаимодействии ионов железа (Fe2+) с гипохлоридом, гидроксильный радикал выделяется с более высоким выходом (в 20 раз выше), чем в реакции Фентона.
В современной литературе термин АФК - активные формы кислорода -охватывает более широкий диапазон, чем свободные радикалы кислорода (-02 и -НО"), так как кроме последних включает молекулы Н202, синглетный кислород 02\ озон 03 и гипохлорид НОСІ (Кулинский В.П., 1999). В тканях АФК вызывают образование органических гидропероксидов ROOH, липидов, белков, ДНК, что называется перекисным окислением (пероксидацией) (Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А., 1999; Кулинский В.И., 1999). Перекисное окисление происходит вследствие чрезмерного накопления АФК при оксидативном стрессе, а факторы и вещества, предшествующие этому, называют прооксидантами. Поскольку свободные радикалы и перекись водорода вызывают пероксидацию липидов и денатурацию белков, создаются условия для лизиса клеточных мембран - начального этапа цитотоксического действия (Druge W., 2002). На этом этапе активность перекиси водорода усиливается ее взаимодействием с системой миелопероксидазы (МПО) (Klebanoff S.J., 2005).
Механизмы защитных реакций макроорганизма в зависимости от генетически детерминированной вирулентности бактерий рода Yersinia
Кусочки внутренних органов фиксировали в 10% формалине, забуференном по Лилли (1969). Проводка и заливка материала в парафин-воск и приготовление срезов выполнялись по схеме Меркулова с применением ксилола (Саркисов Д. С, 1996). Приготовление, депарафинирование и окрашивание парафиновых срезов гематоксилином-эозином проводилось согласно общепринятым методам (Саркисов, 1996).
Для иммуноморфологической идентификации апоптоза применяли TUNEL-метод согласно протоколам методических рекомендаций Эллиниди с соавт. (2002). После депарафинирования срезы кипятили в микроволновой печи в течение 10 мин в 0,01М цитратном буфере. После промывки в 2-х сменах дистиллированной воды и в 3-х сменах рабочего TpHC-NaCl-буфера, срезы инкубировали с раствором фермента проназы («DAKO» Дания, 0,1 г/мл) на протяжении 20 мин при комнатной температуре. Далее, после промывания, их 20 мин обрабатывали раствором перекиси водорода. После этого на срезы наносили нормальную блокирующую сыворотку и инкубировали во влажной камере 30 мин при комнатной температуре. Следующим этапом было нанесение 30-40 мкл рабочего раствора Monoclonal Antierminal deoxynucleotidyl transferase (Tdt) и инкубация во влажной камере 1 ч при 37оС. Затем срезы промывались в 3-х сменах рабочего TpHC-NaCl-буфера и покрывались раствором вторых биотилированных антител на 30 мин. После трехкратной промывки рабочим буфером срезы инкубировали с авидин-биотин-пероксидазным комплексом 30 мин при комнатной температуре. Далее после промывания срезы окрашивали диаминобензидином с последующей докраской ядер гематоксилином Майера.
Непрямой метод флюоресцирующих антител (нМФА). После истечения срока заражения, покровные стекла с адгезированными на них макрофагами высушивали на воздухе и фиксировали в течение 5 сек по собственной модификации в 96 0 этаноле при +4 ОС. Это позволило сохранить антиген бактерий на плазматической мембране клеток. Для выявления антигенов в макрофагах применяли гомологичную псевдотубекулезную антисыворотку производства ФГУП СПбНИИВС ФМБА РОССИИ. В качестве вторичных антител использовали диагностическую флюоресцирующую сыворотку против иммуноглобулинов G мыши (ICN), по стандартной методике (Кармышева В.Я., 1979). Препараты исследовали в люминесцентном микроскопе с возбуждающими фильтрами ФС, СС, ЭС и запирающим фильтром типа ЖС=18 + ЖС=19 под иммерсионным водным объективом.
Учет результатов проводили визуально на основании оценки цвета, интенсивности и морфологии флюоресцирующих участков в люминесцентном микроскопе. На 100 макрофагов, идентифицируемых с помощью фазовоконтрастной микроскопии, вычисляли процент антигенпозитивных клеток. В качестве контрольных препаратов использовали незараженные культуры макрофагов.
Метод лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Для лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (ЛСКМ) использовали установку LSM510META (Carl Zeiss, Германия) на основе инвертированного микроскопа Axiovert 200М и блока лазеров (Аг+ - лазер с генерацией на длинах волн 458, 477, 488 и 514 нм, HeNe - лазер с генерацией на длине волны 543,5 нм и HeNe - лазер с генерацией на длине волны 633 нм). Для измерений использовали ЮОхмасляно-иммерсионный объектив С - Plan-Apochromat (числовая апертура 1,4), обеспечивающий разрешение около 0,3 мкм в плоскости объектива и около 0,6 мкм вдоль оптической оси объектива при сканирующем возбуждении. Размер конфокальных изображений, как правило, составлял 1024x1024 вокселей, а время измерения одного изображения - около 25 с. Для регистрации в клетках меченного антигена Y. pseudotuberculosis использовали возбуждение 543 нм (-20 мкВт на образце, 100 %). Световое излучение клеток проходило через одно из дихроичных зеркал: NT 80/20, HFT 545; после чего, с помощью дихроичного зеркала NFT 545 и узкополосного фильтра ВР 560-615, выделяли спектральный диапазон 560-615 нм, соответствующий эмиссии Alexa Fluor 546.
Метод трансмиссионной электронной микроскопии. Культуру клеток после инкубации в течение различных временных промежутков фиксировали комплексным фиксатором, предложенным Ито с соавт. (Уикли Б., 1975). Фиксатор готовился на основе 0,2 М какодилатного буфера рН=7,4, включал 3 % параформальдегида и 0,02 % пикриновой кислоты. Через 18 ч проводили дофиксацию в 1% растворе Os04 (Serva) - 1,5 ч, затем дегидратацию в этаноле с возрастающей концентрацией и заключали в White Resin (Sigma). Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме LKB -V (Швеция). Образцы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по стандартной методике (Уикли Б., 1975) и просматривали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония) при увеличении от 4 000 до 15 000 и ускоряющем напряжении 80 кВ.
Метод люминесцентной микроскопии. Для определения формы гибели фагоцитов перитонеального экссудата применяли методы витального окрашивания культуры клеток (макрофагов и нейтрофилов).
Для выявления некротически поврежденных клеток использовали краситель акридиновый оранжевый (Serva, США). Клеточный осадок путем центрифугирования промывался дважды в фосфатном буфере, содержащем 2% эмбриональной сыворотки, после чего в соотношение 1:2 вносился раствор 0.1 % Triton Х-100, 0.08 N НС1, 0.15М NaCl на основе дистиллированной воды, с экспозицией 15 сек. Затем в соотношение 1:2 добавлялся холодный раствор акридинового оранжевого (5 mg/ml), на основе цитратного буфера рН=6.0, включающего 1 mM EDTA-Na, 0.15М NaCl, 0.2М NaP04. При нарушении проницаемости плазмалеммы клетки приобретали способность к свечению в красно-оранжевом спектре, тогда как жизнеспособные клетки имели зеленое свечение. Препараты анализировали через 15 минут под люминесцентным микроскопом с использованием 777 фильтров. Определялся процент поврежденных клеток, который выражался в виде индекса некроза (ИН).
Для выявления апоптотически измененных клеток применяли метод окрашивания красителем Hoechst 33342 (Sigma). Для этого фиксированный (2,68 г какодилата натрия, 1,9 г хлорида натрия, 11,8 г параформальдегида в 200 мл дистиллированной воды) клеточный осадок путем центрифугирования промывали дважды в фосфатном буфере, после чего вносили раствор Hoechst (1мг/мл) на основе фосфатного буфера рН=7,2. Клеточную суспензию инкубировали в течение 15 минут при 370С. Препараты исследовали под люминесцентным микроскопом, с помощью фазового контраста подсчитывали 100 клеток, и из них, по наличию специфического свечения, определяли процент апоптотически измененных клеток (ИА, %).
Методы оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток
При контакте со слабовирулентным вариантом pVM82 MDa Y. pseudotuberculosis наблюдалась активная наработка АМФ (аденозинмонофосфотазы) фагоцитами через 3 и 6 часов после инфицирования (рис. 12), индекс стимуляции составлял 33,3±0,89% и 56,4±0,76% относительно контроля. Это свидетельствовало о стимуляции клеток в ответ на контакт с патогеном. При инкубации с вирулентным штаммом уже в первые часы отмечалось накопление фермента в культуре нейтрофилов. Максимальные показатели стимуляции составляли 41,2±1,43% и 43,5±0,75% через 1,5 ч и 2 ч после контакта клеток с бактериями. Следует отметить, что при заражении культуры макрофагов Y. pseudotuberculosis в начальные сроки наблюденияпоказатели достоверно не отличались от контроля. При взаимодействии макрофагов с бактериями слабовирулентного варианта индекс стимуляции максимально повышался через 2 ч инкубации до 31,6±0,73%. При контакте культуры с вирулентным вариантом pYV48 : pVM82 MDa повышение значений индекса стимуляции отмечалось только через 3, 5 и 7 суток после инфицирования, показатели составляли 15,9±0,53%; 21,3±0,33% и 13,07±0,59% соответственно.
Подобная реакция клеток отмечалась в отношении фермента СДГ (сукцинатдегидрогеназы), который участвует в дыхательной цепи митохондрий. В начальные сроки после заражения наблюдалась наработка фермента в нейтрофилах (рис. 13), более выраженная в отношении штамма, содержащего
Активность СДГ у фагоцитов, зараженных зараженных: а) слабовирулентным вариантом Y. pseudotuberculosis pVM 82 MDa; б) вирулентным вариантом Y. pseudotuberculosis pYV48: pVM 82 MDa. плазмиды pYV48: pVM82 MDa. Максимальные значения индекса стимуляции у нейтофилов отмечались через 2 часа после заражения и составляли 23±0,65% при контакте со слабовирулентным и 27,9±0,99% - с вирулентным штаммом Y. pseudotuberculosis. В культуре макрофагов максимальные показатели индекса стимуляции составили соответствовенно 17,12±0,54% и 16,43±0,71% через 3 часа ведения эксперимента.
В макрофагах, зараженных Y. pseudotuberculosis наблюдалось понижение количества и другого митохондриального фермента - ЦХО (цитохромоксидазы), независимо от плазмидной характеристики бактерий (рис. 14). Это указывает на выраженный цитотоксический эффект бактерий. Индекс стимуляции был ниже или в пределах контроля на протяжении всего срока наблюдения.
При исследовании ферментативной активности нейтрофилов большое значение имеет оценка активности МПО (миелопероксидазы), которая принимает участие в преобразовании супероксидного аниона 02, осуществляя, таким образом, защиту клетки от избыточного количества реактивных посредников кислорода. Показатели активности данного фермента (рис. 15а) нейтрофилов были высокими на протяжении всего периода наблюдения независимо от плазмидной характеристики Y. pseudotuberculosis. При контакте клеток со слабовирулентным вариантом pVM 82 МДа, максимальные значения индекса стимуляции достигали 41,1± 0,43% после 4 ч инкубации. При исследовании культуры нейтрофилов после заражения вирулентным вариантом Y. pseudotuberculosis pYV48 : pVM82 MDa максимальные значения индекса стимуляции определялись через 2 часа контакта и составляли 35,86±1,04%. Все это указывает на выраженную защитную реакцию клетки в ответ на заражение.
При стимуляции нейтрофила в секреторных гранулах параллельно с активацией ферментов кислородзависимой системы происходит повышение синтеза антимикробных неферментных белков, относящихся к кислороднезависимой системе. Эти протеины способны играть роль медиатора воспаления. Катионные белки являются специфическим маркером нейтрофилов. При заражении Y. pseudotuberculosis (pVM82 MDa) в нейтрофилах выявлялся т%
Ферментативная активность нейтрофилов, зараженных разными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis: а) внутриклеточная активность МПО; б) внутриклеточная продукция неферментных катионных белков. экзоцитоз катионных белков (рис. 156) во внеклеточное пространство в период до 1,5 - 2 ч контакта. Максимальное значение индекса стимуляции составило 27,11±0,96% через 2 ч контакта. В культуре нейтрофилов, взаимодействовавших с вирулентнымвариантом, значения индекса стимуляции находились в пределах контроля. Таким образом, результаты исследования выявили отчетливое стимулирующее воздействие слабовирулентного штамма Y. pseudotuberculosis pVM82 MDa на синтетическую активность нейтрофилов.
Для комплексной оценки активности кислородзависимого метаболизма фагоцитов, зараженных Y. pseudotuberculosis, нами были проведены цитохимические исследования суммарной активности ферментов дыхательной цепи. Одним из методов исследования степени генерации АФК является реакция восстановления нитросинего тетразолия - НСТ-тест. По НСТ - показателям реакция клеток была более интенсивной при контакте со слабовирулентным штаммом иерсиний (рис. 16). Причем у нейтрофилов она наступала в более ранние сроки. Максимальные показатели у макрофагов составляли 21,48±0,56% через 1ч контакта со слабовирулентным pVM82 MDa и 38,699±0,77% через 2ч - с вирулентным pYV48: pVM82 MDa вариантом Y. pseudotuberculosis. При исследовании кислородзависимого метаболизма зараженных бактериями нейтрофилов было определено максимальное повышение суммарной активности ферментов дыхательной цепи в НСТ - тесте до 33,2±0,88% через 2 ч контакта со слабовирулентным и 29,97±0,67% после 1,5 ч контакта с вирулентными вариантами бактерий.
В литературе последних лет особое значение в бактерицидной функции нейтрофилов и макрофагов придается нитроксидным радикалам. В отличие от активности исследованных ферментов кислородзависимого метаболизма, в фагоцитах, зараженных бактериями, динамика наработки метаболитов NO (рис. 17) была иной, с постепенным повышением содержания метаболитов NO. Причем, уровень нитритов значительно нарастал к концу срока наблюдения (6ч до 36,08±0,26% у нейтрофилов и после 24 ч до 41,33±0,43 у макрофагов) при контакте с авирулентным штаммом Y. pseudotuberculosis.
Ферментативные изменения инфицированных нейтрофилов и макрофагов
Резистентность псевдотуберкулезного микроба к фагоцитозу, проявляющуюся в его способности к факультативному паразитированию в фагоцитах и вследствие этого играющую важную роль в патогенезе инфекции, связывают с наличием в его составе двух плазмид - pYV 45 и pVM 82 MDa (Коновалова, 2002; Шурыгина и др., 2003). При этом авторы утверждают, что клинико-морфологические проявления заболевания и бактерицидный потенциал фагоцитов более выражены при инфицировании штаммом Y. pseudotuberculosis, содержащим обе плазмиды. Вместе с тем, авторы вынесли лишь косвенное заключение о вкладе плазмиды pVM 82 MDa в патогенные свойства возбудителя инфекции, поскольку в сравнительных исследованиях использовали штаммы с плазмидой pYV45 MDa или pYV 45: pVM 82 MDa, но не одноплазмидный вариант pVM 82 MDa Y. pseudotuberculosis.
В настоящей работе впервые проведено сравнительное комплексное исследование морфо функциональной активности фагоцитов, инфицированных Y. pseudotuberculosis, с учетом значимости плазмидной характеристики возбудителя в реализации антиинфекционной защиты организма. В экспериментах были использованы вирулентный вариант Y. pseudotuberculosis, содержащий две плазмиды pYV 45 MDa: pVM 82 MDa, и слабовирулентный вариант, содержащий единственную плазмиду pVM 82 MDa.
При исследовании морфофункциональных изменений клеток врожденного иммунитета, зараженных разными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis в системе in vitro, при одинаковой физиологичной бактериальной нагрузке 10 микробных клеток (м.к.) на один фагоцит установлено, что фагоцитарные показатели у макрофагов были выше, чем у нейтрофилов. При этом ими активнее поглощался и обезвреживался одноплазмидный штамм pVM 82 MDa, тогда как двухплазмидный штамм pYV45: pVM82 MDa оказывал цитотоксическое действие на макрофаги. На фоне низкой фагоцитарной активности у нейтрофилов определялась ферментативная стимуляция, более выраженная в отношении вирулентного двухплазмидного штамма Y. pseudotuberculosis.
При светооптическом и электронно-микроскопическом изучении взаимодействия макрофагов и нейтрофилов с Y. pseudotuberculosis следует отметить, что в отношении вирулентного pYV45 : pVM82 MDa варианта отмечался незавершенный фагоцитоз, что подтверждалось большим количеством делящихся бактерий во внеклеточном пространстве на протяжении всего срока наблюдения. Отмечалась экскреция нейтрофилами биологически активного компонента во внеклеточное пространство. С увеличением срока наблюдения часть бактерий претерпевала ультраструктурные изменения клеточной стенки, свидетельствующие об их L-трансформации по сферопластному типу.
Одним из методов исследования уровня генерации активных метаболитов кислорода является реакция восстановления нитросинего тетразолия - НСТ-тест. Установлено, что НСТ - показатели были выше при контакте клеток со слабовирулентным pVM 82 MDa плазмидным вариантом Y. pseudotuberculosis. Причем, по сравнению с макрофагами, у нейтрофилов эти показатели повышались в более ранние сроки после заражения.
При контакте фагоцитов с вышеуказанными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis также отмечалось повышение активности эктофермента плазмалеммы АМФ, что свидетельствовало о стимуляции клеток в ответ на заражение патогеном. Причем, в нейтрофилах активация фермента наблюдалась в первые часы после заражения, тогда как в макрофагах в эти же сроки активность АМФ достоверно не отличалась от контроля.
Наряду с этим, отмечалось аналогичное повышение активности фермента кислородзависимой системы - сукцинатдегидрогеназы в клетках, зараженных Y. pseudotuberculosis. Известно, что этот фермент является компонентом дыхательной цепи митохондрий. Так, в нейтрофилах в начальные сроки наблюдения обнаруживалась более высокая активность СДГ при заражении вирулентным плазмидным вариантом бактерий pYV48:pVM82 MDa. Тогда как в макрофагах, зараженных Y. pseudotuberculosis, наблюдалось снижение активности как сукцинатдегидрогеназы, так и другого митохондриального фермента -цитохромоксидазы, независимо от плазмидной характеристики бактерий.
Миелопероксидаза, присутствующая в азурофильных гранулах нейтрофилов, принимает участие в преобразовании супероксидного аниона кислорода в гипохлорную кислоту, осуществляя, таким образом, защиту клетки от избыточного количества реактивных посредников кислорода. Показатели активности этого фермента были высокими на протяжении всего периода наблюдения при контакте нейтрофилов со слабовирулентным pVM82 MDa вариантом и в более поздние сроки при заражении вирулентным вариантом pYV45 : pVM82 MDa Y. pseudotuberculosis. Эти данные указывают на некоторые различия динамики защитной реакции нейтрофилов в зависимости от вирулентных свойств бактерий.
При стимуляции нейтрофила в секреторных гранулах происходит повышение синтеза антимикробных белков, относящихся к кислороднезависимой системе. Эти протеины способны играть роль медиатора воспаления и являются специфическим маркером нейтрофилов (V.Witko-Sarsat at all, 2000, Lehrer, R.I., 1999). При заражении слабовирулентным вариантом pVM82 MDa штаммом Y. pseudotuberculosis в нейтро филах выявлялся экзоцитоз катионных белков во внеклеточное пространство до 1,5 - 2 ч контакта. В культуре нейтрофилов, контактировавших с вирулентным вариантом pYV48: pVM82 MDa, значения индекса стимуляции находились в пределах контроля.
В литературе последних лет особое значение в бактерицидной функции нейтрофилов и макрофагов придается нитроксидным радикалам. В отличие от активности исследованных ферментов кислородзависимого метаболизма в фагоцитах, зараженных бактериями Y. pseudotuberculosis, динамика наработки метаболитов NO была иной. Уровень нитритов значительно нарастал к концу срока наблюдения (6 ч в нейтрофилах и после 24 ч в макрофагах). Это указывало на экскрецию нитритов во внеклеточное пространство в начальные сроки после инфицирования и интенсивное накопление их к концу срока наблюдения.
