Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Нормальная микрофлора и пробиотическая коррекция дисбиозов (обзор литературы) 19
1.1. Значение резидентной микрофлоры 19
1.2. Коррекция микроэкологических нарушений 25
1.3. Биологические свойства бактерий рода Lactobacillus 27
1.4. Возможные причины недостаточной эффективности пробиотической коррекции дисбиозов 40
1.5. О методах изучения взаимоотношений лактобацилл 53
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 58
2.1. Материал 58
2.1.1. Микроорганизмы для микроэкологических исследований 58
2.1.2. Питательные среды 60
2.1.3. Экспериментальные животные 64
2.1.4. Антибиотики 64
2.1.5. Сорбирующие диски из картона 64
2.2. Методы исследования 65
2.2.1. Количественное определение и выделение чистой культуры кишечных лактобацилл 65
2.2.2. Количественное определение и выделение чистой культуры вагинальных лактобацилл 66
2.2.3. Количественное определение и выделение чистой культуры оральных лактобацилл 67
2.2.4. Идентификация лактобацилл 68
2.2.5. Получение «жидкого» пробиотика на основе лиофилизированных штаммов лактобацилл 73
2.2.6. Определение количества жизнеспособных лактобацилл в лиофилизированном препарате 74
2.2.7. Приготовление жидкого препарата резидентных лактобацилл и определение количества жизнеспособных клеток 74
2.2.8. Определение экзометаболитов лактобацилл 75
2.2.8.1 .Определение концентрации летучих жирных кислот 75
2.2.8.2. Определение способности лактобацилл к продукции перекиси водорода 77
2.2.8.3. Определение способности к кислотообразованию по Тернеру 79
2.2.8.4. Получение, фракционирование и изучение биологической активности фильтратов биомассы лактобацилл 79
2.2.9. Определение биосовместимости лактобацилл 80
2.2.10. Определение антагонистической активности лактобацилл в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий 82
2.2.11. Хранение штаммов лактобацилл 83
2.3. Экспериментальные модели кишечного лактодисбиоза 84
2.3.1. Тотальная лактодеконтаминация кишечника (ТДК) 84
2.3.2. Частичная лактодеконтаминация кишечника (ЧДК) 86
2.4. Статистическая обработка 86
ГЛАВА 3. Изучение биосовместимости и антагонизма лактобацилл 88
3.1. Количественный и видовой состав лактобацилл, изолированных от человека и экспериментальных животных 88
3.2. Экспериментальное обоснование выбора метода определения антагонизма лактобацилл 91
3.3. Взаимоотношения резидентных и пробиотических лактобацилл 96
3.4. Взаимоотношения между резидентными лактобациллами, изолированными от разных людей 108
3.5. Взаимоотношения лактобацилл, изолированных из разных биотопов у одного индивидуума 112
3.6. Взаимоотношения лактобацилл, принадлежащих к разным видам и штаммам 113
3.7. Взаимоотношения лактобацилл, изолированных от разных видов животных 116
3.7.1. Взаимоотношения резидентных лактобацилл матери и потомства у экспериментальных животных 118
3.8. Антагонизм лактобацилл в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов 123
3.9. Исследование экзометаболической активности резидентных и пробиотических лактобацилл 127
3.9.1. Продукция лактобациллами органических кислот и перекиси водорода 128
3.9.2. Исследование изо- и гомоантагонизма у пробиотических штаммов
лактобацилл 132
ГЛАВА 4. Экспериментальное исследование колонизации кишечника пробиотическими лактобациллами 139
4.1. Влияние пробиотиков на резидентную микрофлору здорового организма 139
4.2. Исследование колонизации пробиотическими лактобациллами тотально лактодеконтаминированного кишечника 148
4.3. Исследование колонизации пробиотическими лактобациллами
частично лактодеконтаминированного кишечника 159
ГЛАВА 5. Исследование биологической активности лиофилизированных и жидких препаратов пробиотических лактобацилл 168
5.1. Динамика накопления биомассы Lactobacillus acidophilus 317/402 при посеве лиофилизированной и жидкой культуры 169
5.2. Определение содержания летучих жирных кислот в «сухих» и «жидких» пробиотических препаратах 171
5.3. Исследования антагонистической активности лиофилизированного и жидкого препаратов пробиотических лактобацилл в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов 173
5.4. Исследование колонизационной активности лиофилизированного и жидкого препаратов гетеропробиотических лактобацилл на модели тотальной лактодеконтаминации кишечника 177
5.5. Исследование колонизационной активности лиофилизированного и жидкого препаратов гетеропробиотических лактобацилл на модели частичной лактодеконтаминации кишечника 186
ГЛАВА 6. Прикладные исследования, имеющие практическое значение 194
6.1. Способ получения жидкого лактобактерина на основе разных видов лактобацилл 194
6.2. Исследование скорости отмирания лактобацилл при хранении жидкого лактобактерина 199
6.3. Приготовление лактотампонов для применения в гинекологии 202
6.4. Оптимизация лиофильного высушивания пробиотических лактобацилл 204
Заключение 211
Выводы 222
Практические рекомендации 225
Список литературы 227
- Значение резидентной микрофлоры
- Питательные среды
- Количественный и видовой состав лактобацилл, изолированных от человека и экспериментальных животных
- Влияние пробиотиков на резидентную микрофлору здорового организма
Введение к работе
Многие фармакологические препараты, пищевые технологические добавки, промышленные яды, пестициды, радиация, несбалансированное питание, стрессы способны вызывать микроэкологический дисбаланс в организме человека (Воробьев А.А. и др. 1997; Митрохин С.Д., 2000, Шендеров Б.А., 2002). Одним из основных средств коррекции микроэкологических нарушений кишечника являются пробиотики - многочисленные препараты, биологически активные добавки и продукты питания на основе живых микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры человека и животных (Соколова К.Я., 2004; Шендеров Б.А., 2002; Fuller R., 1989; Forestier С. et al, 2001). Большой вклад в разработку концепции «пробиотики», в изучение и создание отечественных пробиотических средств внесли многие известные советские и российские ученые (Блохина И.Н., Бондаренко В.М., Воробьев А.А., Гончарова Г.И., Ерзинкян Л.А., Коршунов В.М., Куваева И.Б., Кудлай Д.Г., Ленцнер А.А., Микельсаар М.Э., Перетц Л.Г., Пинегин Б.В., Поспелова В.В., Соколова К.Я., Чахава О.В., Шендеров Б.А. и другие).
В качестве основы пробиотиков используются как гомопробиотические микроорганизмы (выделенные из организма хозяина того биологического вида, для лечения которого они предназначены), так и гетеропробиотические (выделенные из организма хозяина другого биологического вида) высокоантагонистические штаммы лактобацилл, бифидобактерий и энтерококков (Онищенко Г.Г. и др., 2002; Шендеров Б.А., 2002; Каиг LP. et al, 2002; Аппик H. et al, 2003).
Более чем тридцатилетний опыт применения пробиотических микроорганизмов показал несомненную их способность предотвращать или корректировать дисбиотические изменения в организме человека (Алешкин В.А. и соавт., 2004, Бондаренко В.М. и соавт., 2003, 2004; Воробьев А.А. и соавт., 2004; Шендеров Б.А., 1998, 2004), хотя механизмы позитивного эффекта пробиотиков на организм хозяина и его резидентные микробиоценозы до настоящего времени полностью не выяснены (Онищенко Г. Г. и соавт., 2002; Аппик Н. et al., 2003). Многие вопросы взаимодействия между резидентными и пробиотическими микроорганизмами, между последними и клетками организма хозяина (quorum sensing) также еще ждут своего решения (Шендеров Б.А., 2004; Sanders М.Е., 1999; Reid G, 1999; Lenoir-Wijnkoop 1., 2003; Na-kayamaJ., 2005).
Безопасность использования человеком пробиотических микроорганизмов является достаточно хорошо установленным фактом, однако некоторые представители молочнокислых бактерий при определенных обстоятельствах способны выступать в качестве оппортунистических патогенов (Шендеров Б.А., 2001; Salminen S. et al, 1998; Saarela M. et al, 2002). Длительное назначение больших доз пробиотических микроорганизмов может способствовать развитию дисбиотических изменений среди аэробных и микроаэро-фильных представителей кишечной микрофлоры (Лесняк СВ. и соавт., 1988).
В связи с этим, анализ опубликованных в последнее десятилетие данных позволяет согласиться с мнением В.М. Коршунова и соавт. (1999), М.К. Goverdhan и R.M. Chauhan (1997), что в проблеме коррекции резидентной микрофлоры пробиотиками накопилось множество ошибок, ложных теоретических и практических представлений.
Одной из главных причин неэффективности пробиотиков может быть чужеродность для человека входящих в их состав микроорганизмов (Коршунов В.М. с соавт., 1996; Субботин В.В, 1999; Larkin М., 1999). Вследствие этого разработка новых подходов к коррекции дисбиотических нарушений продолжает оставаться одной из актуальных задач медицинской микробиологии (Воробьев А.А. и соавт. 2000, 2004; Покровский В.И., 2002; Подопри-гора Г.И., 2003; Бондаренко В.М. и соавт., 2004; Annuk Н. et al. 2003; Lenoir-Wijnkoop 1., 2003). Цель исследования
На модели лактофлоры человека и животных экспериментально обосновать новые концептуальные принципы и практические подходы к селекции потенциальных пробиотических микроорганизмов, а также к индивидуализации применения пробиотиков для профилактики и лечения заболеваний, ассоциированных с дисбалансом нормальной микрофлоры, повышающие эффективность коррекции микроэкологических нарушений.
Задачи исследования:
1. Провести анализ количественного и видового состава индигенных лактобацилл, присутствующих в различных биотопах организма человека, крыс и мышей.
2. В опытах in vitro при совместном культивировании исследовать характер взаимоотношений индигенных лактобацилл, изолированных из различных биотопов одного хозяина, из одного биотопа различных хозяев, от животных одного потомства, а также между штаммами различной таксономической принадлежности.
3. В условиях совместного культивирования изучить характер и некоторые механизмы антагонистических и симбиотических взаимоотношений пробиотических и индигенных штаммов лактобацилл.
4. Исследовать влияние орально назначаемых пробиотических лактобацилл на количественный и качественный состав индигенной лактофлоры толстого кишечника здоровых животных.
5. Исследовать динамику колонизации пищеварительного тракта мышей пробиотическими лактобациллами на модели дисбактериоза кишечника, вызванного однократным и длительным введением антибиотиков
6. Провести сравнительное изучение способности к колонизации пищеварительного тракта лабораторных животных пробиотических штаммов лактобацилл, назначаемых в жидкой и лиофилизированной лекарственных фор 12 мах, а также степени выраженности их антагонистической активности в отношении оппортунистических патогенов.
7. Использовать антагонистические свойства лактобацилл в отношении условно-патогенных микроорганизмов и представителей нормальной лак-тофлоры как основу для скрининга потенциальных пробиотических штаммов лактобацилл и разработки новых принципов использования микроэкологических приемов, повышающих индивидуализацию и эффективность коррекции нарушений нормальной микрофлоры.
Научная новизна
В условиях экспериментов in vitro и в наблюдениях на лабораторных животных установлено широкое распространение антагонистических взаимоотношений (бионесовместимости) между пробиотическими и индигенны-ми штаммами лактобацилл, между резидентными лактобациллами, изолированными из разных анатомических областей отдельных индивидуумов, крыс и мышей. Степень выраженности антагонизма между лактобациллами зависела также от видовой и штаммовой принадлежности исследованных культур. Лактобациллы, изолированные от животных одного потомства, практически были полностью совместимы друг с другом. В условиях эксперимента впервые показано существование врожденной способности потомства к активной селекции резидентных лактобацилл пищеварительного тракта, сходных с материнскими. Полученные данные позволяют прийти к заключению, что бионесовместимость резидентных микроорганизмов с представителями того же вида, но другого происхождения является общебиологическим механизмом колонизационной резистентности, поддержания гомеостаза микроэкологической системы организма хозяина.
Экспериментально установлено, что сохранность гетеро- и гомопро-биотических лактобацилл в кишечнике здорового реципиента при оральном введении носит транзиторный характер. Элиминация пробиотических лактобацилл из кишечника здоровых животных обусловлена ограниченной биоло 13 гической емкостью биотопов и антагонистическими взаимоотношениями с резидентной микрофлорой.
На модели лактофлоры впервые обоснован принципиально новый подход к селекции пробнотических штаммов и лечебно-профилактическому назначению пробиотиков, основанный на трансплантационном принципе совместимости входящих в них микроорганизмов с резидентной микрофлорой хозяина. Экспериментально доказана целесообразность и высокая эффективность использования традиционных гомопробиотиков для коррекции микроэкологических нарушений на основе учета их антагонистических и синер-гидных взаимоотношений с индигенными штаммами лактобацилл.
Предлагается при выборе пробиотиков для минимизации возможности возникновения микроэкологических нарушений в лактофлоре хозяина перед их назначением предварительно исследовать in vitro характер взаимоотношений (биосовместимость) входящих в них пробнотических штаммов микроорганизмов с индигенными лактобациллами будущего реципиента. Разработан простой «инвитровый» прием определения биосовместимости резидентных и пробнотических лактобацилл, позволяющий с минимальными временными и экономическими затратами осуществлять подбор пробнотических средств и продуктов питания для индивидуализации бактериотерапии и бактериопро-филактики.
Предложен модифицированный лабораторный прием оценки антагонистических свойств пробнотических лактобацилл в отношении патогенных и оппортунистических микроорганизмов. Показано, что в условиях in vitro исследованные штаммы лактобацилл были наиболее эффективны в отношении грамнегативных бактерий; степень выраженности их антагонистической активности имела штаммоспецифический характер.
Антагонистические свойства лактобацилл, присутствующих в жидкой лекарственной форме более выражены, чем у тех же штаммов, находящихся в лиофилизированном состоянии; это может быть связано с присутствием в жидких формах пробиотиков более высоких концентраций уксусной, молоч- ной кислот, перекиси водорода, а возможно и других антагонистических и иных регуляторных субстанций-метаболитов.
Практическая значимость работы
Исследования проводились в рамках НИР в соответствии с комплексным планом ГОУ ДПО НГИУВ «Охрана здоровья трудящихся основных производств Юга Кузбасса» и комплексной темой «Состояние здоровья детского населения и организация медицинской помощи детям крупного промышленного города Западной Сибири» (Государственный регистрационный №01.9.50005326).
Разработаны оригинальные по составу питательные среды, способы взятия и сохранения биологического материала для селективного выделения лактобацилл, простые в исполнении методики количественного анализа лак-тофлоры, присутствующей в полости рта, влагалища, кишечника человека и грызунов, адаптированные к работе в условиях практических бактериологических лабораторий.
Предложен простой и экономически обоснованный лабораторный прием селекции потенциальных пробиотических штаммов лактобацилл, основанный на оценке их биосовместимости с индигенными лактобациллами хозяина при совместном культивировании in vitro. Создана коллекция культур лактобацилл, обладающих различными формами и степенью выраженности биосовместимости.
Разработана модификация прямого метода определения антагонистической активности пробиотических лактобацилл in vitro в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Предложена технология получения лабораторных партий жидких и сухих лекарственных форм лактобактерина. Показано, что свежеприготовленные жидкие формы пробиотических препаратов по своей антагонистической активности превышают таковую лиофилизированных лактоба 15 цилл. Модифицирован способ лиофнлизации культур лактобацилл, позволяющий проводить герметизацию флаконов в воздушной среде и обеспечивающий сохранение жизнеспособности бактерий в течение двух лет.
Получены патенты РФ на 4 изобретения и удостоверения ГОУ ДПО НГИУВ на 12 рационализаторских предложений.
Комплекс изобретений «Способ выделения лактобацилл из организма человека, способ получения жидкого лактобактерина на новых питательных средах и его использование для лечения дисбактериозов» награжден дипломом III степени на региональном конкурсе «Инновации и изобретения года -2003», проводимом администрацией Кемеровской области и Кемеровским областным советом ВОИР, г. Кемерово, 2004.
По результатам исследований изданы и используются в преподавании методические рекомендации и пособия: «Лактобациллы в бактериологической диагностике и бактериотерапии вагинального лактодисбиоза», Новокузнецк, 1999, «Введение в экологию резидентной микрофлоры человека», Новокузнецк, 2001, «Резидентная микрофлора и соматическая патология», Новокузнецк, 2002, «Микроэкологические нарушения, принципы и средства их коррекции», Новокузнецк, 2002, «Питательные среды, методики культивирования и определения антагонистической активности резидентных и пробио-тических лактобацилл, приготовления лактобактерина», Новокузнецк, 2004, «Лактобацнллы в исследовании и коррекции микроэкологических нарушений», Новокузнецк, 2005.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследований использованы и внедрены в работу бактериологической лаборатории Муниципального лечебно-профилактического учреждения «Зональный перинатальный центр» г. Новокузнецка, в производстве пробиотического препарата «Нормофлорин-Л» (ООО «БИФИЛІОКС», Москва), в научной работе и преподавании на кафедрах микробиологии, акушерства и гинекологии, медицинской экологии, эпидемиологии и здорового образа жизни Новокузнецкого ГИУВа.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Штаммы лактобацилл животного происхождения, в том числе изолированные от человека, по антагонистическим взаимодействиям друг с другом могут быть разделены на совместимые, несовместимые и синергидные. У свежевыделенных лактобацилл межштаммовые антагонистические взаимоотношения являются преобладающими; в их основе лежит продукция органических кислот, лактоцинов, перекиси водорода и других микробных субстанций как в отдельности, так и в комплексе.
2. Интрагастральное введение бионесовместимых пробиотических лактобацилл в значительных количествах и на протяжении длительного времени нередко сопровождается развитием кратковременного дисбаланса в резидентной лактофлоре. Из этого следует, что лекарственные препараты, БАДы, продукты функционального питания, приготовленные с использованием высоко антагонистических пробиотических штаммов лактобацилл, способны выступать в качестве своеобразных биологических дисбиотических агентов; кратковременное их введение в умеренных количествах существенно не влияет на качественный и количественный состав резидентной лактофлоры кишечника здорового хозяина.
3. Для минимизации возможности возникновения микроэкологических нарушений в резидентной лактофлоре хозяина при выборе назначаемых про-биотиков предлагается предварительно исследовать in vitro характер взаимоотношений входящих в них микроорганизмов с индигенными лактобацилла-ми будущего реципиента.
4. Показано, что после продолжительного введения антибиотиков (селективная тотальная лактодеконтаминация) и последующего орального введения пробиотических микроорганизмов кишечник мышей кратковременно колонизируется бионесовместимыми гомо- и гетеропробиотическими лакто 17 бациллами. После однократного введения антибиотиков (селективная частичная лактодеконтаминация) бионесовместимые пробиотические лактоба-циллы не приживаются и восстановление численности лактофлоры происходит за счет пролиферации индигенных лактобацилл.
5. В толстом кишечнике потомства лабораторных животных, полученных в результате инбридинга, преобладают индигенные лактобациллы, принадлежащие к одному виду и биосовместимые с материнскими и между особями выводка. Полученные данные подтверждают роль иммунологической толерантности в колонизационной резистентности и формировании резидентной микрофлоры.
6. Содержание антагонистических субстанций в жидких формах про-биотических препаратов значительно превышает таковое, присутствующее в лиофилизированных препаратах, приготовленных на базе тех же штаммов пробиотических культур лактобацилл. Колонизирующая способность лиофилизированных пробиотических лактобацилл значительно ниже, чем при использовании тех же микроорганизмов, применяемых в жидкой форме.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на: юбилейных научно-практических конференциях, посвященных 45- и 50-летию кафедры клинической лабораторной диагностики Новокузнецкого ГИДУВа (г. Новокузнецк, 1997, 2002); Всероссийской конференции «Актуальные проблемы здравоохранения Сибири» (Ленинск-Кузнецкий, 1998); заседаниях ученого Совета ГОУ ДПО НГИУВ (Новокузнецк, 1999, 2005); на VIII Российско-Японском Международном медицинском симпозиуме «Здоровье населения Сибири, Дальнего Востока и Японии. Итоги XX века» (Благовещенск, 2000); Международном симпозиуме «Федеральный и региональный аспекты государственной политики в области здорового питания» (Кемерово, 2002); Международных конференциях «Современные Технологии восстановительной медицины (диагностика, оздоровление, реабилитация)» (Сочи, 2003; 2004); научно 18 практической конференции «Новые медицинские технологии как эфектив-ный путь повышения качества медицинской помощи. Решения и проблемы» (Кемерово, 2004); XI Конгрессе детских гастроэнтерологов России «Актуальные вопросы абдоминальной патологии у детей. Детская гастроэнтерология 2004» (Москва, 2004); Международной конференции «Пробиотики, пре-биотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004); Симпозиуме с международным участием «Эффективные технологии организации медицинской помощи населению», посвященном 75-летию Городской больницы №1 (Новокузнецк, 2004); Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004); Кузбасской научно-практической конференции, посвященной 75-летию МЛПУ ГКБ №2 «Медицинская стратегия в новом веке» (Новокузнецк, 2004); VII Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2005».
Публикации
По теме диссертации опубликовано 64 работы, в том числе 4 патента и 13 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 6 учебно-методических рекомендаций и пособий.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 265 страницах, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 58 таблицами, 18 рисунками. Список литературы включает 343 источника, в том числе 212 работ отечественных и 131 - иностранных авторов.
Значение резидентной микрофлоры
Экологический подход к сохранению здоровья и экологическое мышление все больше проникают в методологию и практическую деятельность клинической медицины [1, 201]. За последние годы появились новые данные о характере взаимоотношений в системе макроорганизм-микроорганизм, позволяющие по-новому оценить роль нормальной микрофлоры в физиологии и патофизиологии человека и животных [156,158, 171, 172,200].
Микробная экосистема млекопитающих формировалась на протяжении миллионов лет. При этом происходила селекция микроорганизмов, способных к обитанию в определенных биотопах организма хозяина [153].
В микробиоценозах организма человека выделяют постоянно обитающие виды бактерий (автохтонная, резидентная, индигенная, облигатная микрофлора) и встречающиеся непостоянно (аллохтонные, факультативные, транзитные микроорганизмы) [25, 63, 200]. Считают, что любые микроорганизмы, обнаруживаемые в пищеварительном тракте здорового человека в количествах менее 106КОЕ/г, являются транзиторными и их влияние на физиологические функции организма хозяина незначительно [151].
Резидентная микрофлора представляет собой чрезвычайно сложную и в высшей степени взаимосвязанную экосистему, функционально тесно взаимодействующую с организмом хозяина. Она обладает значительной устойчивостью к воздействию экзо - и эндогенных факторов, сохраняя относительно стабильный качественный и количественный состав. Состояние динамического равновесия между организмом хозяина, микроорганизмами, его заселяющими, и окружающей средой, при котором здоровье человека находится на оптимальном уровне, принято называть «эубиоз» [96]. Однако чрезмерно сильные или длительные эндогенные или экзогенные неблагоприятные воздействия могут превышать адаптационные возможности макроорганизма и приводить к возникновению стойких нарушений в его нормальном биоценозе [109, 125, 190, 200, 201]. К экзогенным неблагоприятным факторам относят климатогеографические и экологические условия, такие как химические загрязнения, радиационные воздействия, нарушения в режиме питания, медикаментозная, особенно антибактериальная терапия, характер и качество питания, профессионально-бытовые особенности, санитарно-гигиенические условия и многие другие [117, 118, 119, 125, 164]. Эндогенными факторами, способствующими изменениям нормальных микробиоценозов, служат инфекционные и соматические болезни, а также наличие врожденных и приобретенных иммунодефицитов [14, 134, 145, 186, 201]. У детей раннего возраста особенности формирования резидентных микробиоценозов могут быть связаны с несовершенством защитных механизмов организма, а также с факторами риска, которым подвергается ребенок во время беременности и после рождения [25, 168, 237].
Отклонения от состояния эубиоза в специальной литературе имеют различные обозначения. В отечественной литературе наиболее популярными терминами являются дисбиоз и дисбактерпоз [139]. Дисбиоз представляет собой состояние экосистемы, при котором нарушается функционирование всех ее составных частей - организма человека, его микрофлоры и окружающей среды, а также механизмов их взаимодействия, что ведет к возникновению заболевания. Под дисбактериозом кишечника понимают количественные или качественные изменения типичной для данного биотопа нормофло-ры человека или животных, возникающие в результате воздействия на макро-и микроорганизм различных факторов экзогенного и эндогенного характера, влекущие за собой выраженные клинические проявления со стороны макроорганизма или являющиеся следствием каких-либо патологических процессов в организме [43]. Чаще всего под дисбактериозом понимают стойкие из 21 менения резидентной микрофлоры [139]. Кратковременные нарушения обозначают как дисбактериальные реакции. Дисбактериоз кишечника в настоящее время рассматривается как симптомокомплекс, следствие неблагоприятных воздействий, но не как заболевание [88, 192].
Нормальная (резидентная) микрофлора является компонентом, генетически связанным с макроорганизмом и способным оказывать влияние на все физиологические функции хозяина [155, 172, 200, 202, 254]. Результаты расшифровки генома бактерий и человека показали, что организм последнего содержит нуклеотидные последовательности, характерные более чем для 200 бактериальных генов, а также для 500 видов ретровирусов, которые, очевидно, заимствованы у микроорганизмов в процессе филогенеза [156, 199, 219, 220, 276].
Механизмы формирования индивидуальных резидентных микробиоценозов пока известны только в общих чертах [145]. Считается, что in utero плод стерилен и формирование его индигенной микрофлоры начинается в момент родов и немедленно после рождения [138]. Показано, что главным источником микрофлоры детей, родившихся естественным путем, служат резидентные бактерии влагалища, кожи и фекалий матери [109]. Это подтверждается сходством плазмидного профиля энтеробактерий и бифидобактерий, выделенных из полости рта и толстого кишечника родильниц и фекалий новорожденных [327]. Основным путем заселения пищеварительного тракта бактериями является оральный [138]. Фекалии детей с врожденной атрезней пищевода длительное время остаются стерильными [67].
Питательные среды
Для рутинной микробиологической работы по выделению лактобацилл из клинического материала и в опытах по изучению антагонизма лактобацилл использованы питательные среды (№1-10), разработанные самостоятельно, следующего состава: №1. (Патент № 2154822), г/л: гидролизат обезжиренного молока жидкий 225,0 ± 25,0; аутолизат дрожжей концентрированный 110,0 ± 10,0; агар 0,8; вода дистиллированная до 1 литра; раствор едкого натра 20 % до рН среды 5,4 ±0,1. №2. (Патент № 2154822): плотная питательная среда, отличается от состава №1 увеличением количества агара до 20 г. №3. Жидкая питательная среда для накопления биомассы лактобацилл: отличается от состава №1 повышенным значением/?// (до 6,4 ±0,1). №4. Плотная питательная среда, отличается от состава №3 увеличением количества агара до 20 г. №5. (Патент № 2178171), г/л: гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный 30,0 ± 3,0; кислота уксусная ледяная 3,4 ± 0,1; аутолизат дрожжей концентрированный 110,0 ± 10,0; агар технический 0,8; вода дистиллированная до 1 литра; раствор едкого натра 20 % дорН среды 5,4 ±0,1. №6. (Патент № 2178171): плотная питательная среда, отличается от состава №5 увеличением количества агара до 20 г. №7. (Патент № 2244744), г/л: гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный 30,0 ± 3,0; аутолизат дрожжей концентрированный 110,0 ± 10,0; агар пищевой 0,8; раствор едкого натра 20 % до рН среды (6,4 ± 0,1); вода дистиллированная до 1 литра. №8. (Патент № 2244744): плотная питательная среда, отличается от состава №7 увеличением количества агара до 20 г. №9. (Патент № 2193060), г/л: аутолизат дрожжей концентрированный 110,0 + 10,0; лактоза 10,0 ± 2,0; кислота уксусная ледяная 3,8 + 0,4; агар технический (ГОСТ 17206-84) 0,8; отвар крупы сои (аминный азот 38-40 мг%) до 100 %; рН среды 5,4 ± 0,1. №10. (Патент № 2193060): плотная питательная среда, отличается от состава №9 увеличением количества агара до 20 г. №11. Для видовой дифференциации лактобацилл по минимальному набору тестов в качестве основы использовали среду, рекомендованную фирмой «Bio-Merieux» (API-50 CI1L) следующего состава, г/л: пептон 5; панкреатический гидролизат казеина 10; экстракт пекарских дрожжей 5; цистеин 0,25; аскорбиновая кислота 0,25; Твин-80 1 мл; калия фосфат двузамещенный 2; ацетат натрия трехводный 0,5; цитрат аммония двузамещенный 2; магния сульфат семиводный 0,2; марганца сульфат четырехводный 0,05; бромкрезо-ловый пурпурный 0,17; воды дистиллированной до 1000 мл;/?// 6,8 - 7,2; стерилизация при 0,5 атм. в течение 20 мин. На основе питательной среды №11 приготовляли растворы девяти углеродсодержащих соединений, а именно: 1% растворы восьми углеводов 1) /,-(+)-арабиноза; 2) D-фруктоза; 3) Сахароза; 4) Л-(+)-мальтоза; 5) a- D-Melezitose; 6) Cellobiose; 7) 0-(+)-сорбит; 8) D-Salicin и 9) раствор эскулина 0,5%, в который дополнительно вводили железо лимоннокислое в количестве 0,05%. Полученные растворы углеводов стерилизовали нагреванием на водяной бане в течение 20 минут. №12. Для постановки опытов отсроченного антагонизма была использована питательная среда следующего состава: пептон 0,5 %; глюкоза 0,5 %; дрожжевой аутолизат концентрированный 2 %; гидролизат молока 10 %; цистин 0,04 %; Агар 2 %; Na2HPOr2H20 0,047 %; КН2Р04 0,145 %; вода дистиллированная до 100 %;рН среды 6,2 ± 0,1 [59]. В опытах по исследованию антагонистической активности лактобацилл использованы также плотная питательная среда МРС-5 и гидролизно-молочная среда (ГМС) [180]. При исследовании чувствительности и селективности разработанных питательных сред в качестве сред сравнения применяли среду МРС-2 производства Нижегородского государственного предприятия по производству бактерийных препаратов «ИмБио», молочно-дрожжевую среду [180], а также плотные питательные среды МРС-4 и «Лактобакагар» (Оболенск). Характеристика сырья и полупродуктов, употребляемых для приготовления питательных сред, представлена в табл. 2. Таблица 2 Характеристика сырья и полупродуктов Наименование Документация, регламентирующая качество, производитель Примечание А. Сырьё Нижегородское гос. предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио» Аминный азот 1485 мг% Гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный Молоко сухое обезжиренное ГОСТ 10970-87 Массовая доля основного вещества 98% Молоко коровье стерилизованное ТУ 9222-033-05268977-02 Жирность 0,5% Продолжение табл. Хлебопекарные прессованные дрожжи ТУ 9182-023-02068315-98 Влажность 75 % Крупа соя ГОСТ 17109-88, 1 сорт(ТОО Новочемровское,Алтайский край) Пищевой продукт Гидролизат обезжиренного молока жидкий Отвар крупы сои Патент №2193060 Аминный азот 38-40 мг% Аутолизат дрожжей концентрированный Патент №2154822 Аминный азот 580-600 мг% Примечание: Гидролизат обезжиренного молока жидкий из молока коровьего стерилизованного (ТУ 9222-033-05268977-02) приготовляют по методике, указанной в методических рекомендациях [56]. 2.1.3. Экспериментальные животные Исследования осуществлены на 287 беспородных белых мышах (197 взрослых мышей с массой тела 18-25г и 90 мышат в возрасте 3 недель) и 123 белых крысах линии ВИСТАР (17 взрослых самок с массой тела 90-150г и 106 крысят в возрасте 1 месяц). Для получения сравнительных данных в экспериментах использованы белые мыши и крысы вивариев ГОУ ДПО НГИУВ Росздрава, НИХФИ, Новокузнецкой городской ветеринарной бактериологической лаборатории, ветеринарных бактериологических лабораторий г. Прокопьевска, Чистогорского свинокомплекса. 2.1.4. Антибиотики: 1) Амикацин сульфат 0,5 г. [АКО "Синтез" г. Курган]. 2) Ампиокс-натрий 0,5 г [0,5 г активных веществ. Состав: ампициллина Na-соли 0,3335 г, оксациллина Na-соли 0,1665 г. Фирма "Брынцалов А"]. 3) Таблетки нистатина 250000 ЕД, в оболочке, № 20 [ОАО "Биосинтез" г. Пенза, средний вес таблетки 135 мг; 1000 ЕД содержится в 0,54 мг таблетки]. 2.1.5. Сорбирующие диски из картона Сорбирующие диски диаметром 12 мм из фототехнического картона (ГОСТ 6722-75) получали при помощи стандартной ружейной высечки промышленного производства 32 калибра. Для устранения гидрофобности диски помещали на 2 часа в эфир, высушивали при комнатной температуре, стерилизовали в чашках Петри в автоклаве, при 1,1 атм. (120 С) в течение 40 мин., подсушивали до постоянной массы в термостате в течение 24 часов, и использовали в течение 3 дней. Сорбционная емкость диска составляла 0,05 мл жидкости [54]. При необходимости диски можно стерилизовать повторно.
Количественный и видовой состав лактобацилл, изолированных от человека и экспериментальных животных
Наши исследования дают основание полагать, что одной из причин неэффективности использования пробиотических лактобацилл может служить их видовая гетерогенность с индигенными лактобактериями. Однако видовая принадлежность индигенных лактобацилл, обитающих в основных биотопах организма человека, мало изучена и при проведении пробиотикотерапии в настоящее время не учитывается. Немногочисленны сведения о резидентной лактофлоре основных видов лабораторных животных, что затрудняет планирование и трактовку результатов экспериментальных микроэкологических исследований. В связи с изложенным, нами проведено изучение видового состава индигенных лактобацилл у человека и экспериментальных животных.
Выделение чистых культур индигенных лактобацилл и их видовую идентификацию осуществляли по п. 2.2.1. - 2.2.4. В результате проведенных исследований выявлено, что в трех изученных биотопах организма человека обитает 11 преобладающих видов рода Lactobacillus. Однако при наличии общего сходства имеются и значительные различия. Так, в полости рта отсутствовали виды L. cellobiosus, L. delbrueckii, L. leishmanii и L. paracasei, обнаруженные среди кишечных лактобацилл. В вагинальном секрете не обнаружены L. buchneri и L. salivarius, характерные для полости рта и кишечника. Наиболее разнообразен видовой состав индигенных лактобацилл кишечника человека. В этом анатомическом отделе организма доминировали L. acidophilus (19,64%), L. plantarum (15,17%) и L. salivarius (13,18%). Видовой состав лактобацилл, выделенных из слюны человека, включал 8 видов, из которых преобладали L. casei (22,47%), L. salivarius (19,26%), L. fermentum (17,43%) (табл. 5).
Примечание: Абс. - абсолютное число; лактобациллы других видов, встречающиеся в количестве менее 2% от числа изученных. Другие представители рода Lactobacillus встречались значительно реже. Видовой спектр вагинальных лактобацилл человека включал 7 видов, среди которых доминировали L. acidophilus (54,18%) и L. brevis (11,01%). Таким образом, проведенное исследование свидетельствует о существовании в каждом биотопе организма человека специфического видового состава индигенных лактобацилл.
Исследования видовой принадлежности лактобацилл, обитающих в кишечнике лабораторных животных, демонстрируют картину, аналогичную таковой у человека, и подтверждают существование ранее выявленных закономерностей (табл. 6). Вместе с тем, можно отметить, что в кишечнике животных каждого вида, в отличие от человека, преобладают индигенные лак 90 тобациллы, относящиеся к видам L. fermentum и L. plantarum у крыс и L. cellobiosus у мышей.
Примечание: Абс. - абсолютное число; лактобациллы других видов, встречающиеся в количестве менее 1,4% от числа изученных. Проведенное нами исследование показало, что видовой состав индигенных лактобацилл каждого биотопа довольно разнообразен и специфичен. Преобладание определенных видов индигенных лактобацилл в разных анатомических областях свидетельствует о разных условиях существования (табл. 5). В каждой анатомической области существует собственная популяция индигенных лактобацилл, адаптированных к специфическому тканевому субстрату и условиям обитания, и отличающаяся по биологическим свойствам от родственных видов, обитающих в других экологических нишах организма. Важнейшим фактором, определяющим позитивный или побочный эффекты, сроки приживления или элиминации пробиотических микроорганизмов после их применения, является состояние колонизационной резистентности реципиента. Последняя,- в свою очередь, связана с теми биологическими свойствами пробиотических лакто- и бифидобактерий и индигенных представителей кишечной микрофлоры, которые определяют характер взаимоотношений между ними (антагонистические, синергидные, индиферент-ные) и, как следствие, конкурентноспособность или совместимость в соответствующей экологической нише.
С учетом вышеизложенного нами изучены взаимоотношения лактоба-цилл, входящих в состав коммерческих пробиотических препаратов, и индигенных лактобацилл, изолированных из различных биотопов человека и животных. В главе 1 (п. 1.5.) дана характеристика методов определения антагонизма лактобацилл в отношении других видов микроорганизмов и отмечены некоторые недостатки метода отсроченного антагонизма, одним из которых является возможное влияние состава плотной питательной среды на результаты исследования.
Для экспериментальной проверки зависимости проявлений антагонизма лактобацилл от состава питательной среды была изучена способность Lactobacillus acidophilus 317/402 подавлять рост 8 штаммов тест-культур {Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli 0124, E. coli M-17, Yersinia enterocolitica, Proteus rettgeri, Pseiidomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus 209) при разной концентрации глюкозы в питательной среде.
На первом этапе для постановки опытов использовали плотную питательную среду (состав №12, по п. 2.1.2.), содержащую 0,5% глюкозы. Опыт был поставлен традиционно: сначала засевали штрихом по центру чашки L. acidophilus 317/402 и инкубировали в течение 24 часов в микро-аэрофильных и капнофильных условиях при 37С. Затем перпендикулярными штрихами к полоске роста штамма-продуцента подсевали тест-культуры. В качестве аутоконтроля был произведен посев перпендикулярным штрихом и L. acidophilus 317/402, чашку вновь инкубировали в аналогичных условиях, затем измеряли зону задержки роста тест-культур, в мм (табл. 7).
Представленные в табл. 7 результаты позволяют констатировать, что пробиотический штамм L. acidophilus 317/402 активно ингибирует рост всех тест-культур, но при этом обращает на себя внимание результат контрольного опыта - подавление роста и самого пробиотика (аутоантагонизм). Полученные данные позволили предположить, что выявленный антагонизм может быть результатом неспецифического подавляющего действия кислых продуктов метаболизма глюкозы, диффундирующих в среду от штриха посева L. acidophilus 317/402.
Влияние пробиотиков на резидентную микрофлору здорового организма
Пробиотики являются основным средством профилактики дисбакте-риозов [198, 244, 245]. Однако научные данные о воздействии пробиотиков на резидентную микрофлору здоровых индивидуумов, которые являются главными потребителями этих продуктов, не позволяют составить ясного представления о судьбе введенного пробиотика [151, 268, 273, 278].
Ранее, в эксперименте на здоровых добровольцах, нами было показано, что ежедневное, на протяжении 6 дней, введение 15 млрд. КОЕ гомопробио-тического штамма Lactobacillus acidophilus 317/402, бионесовместимого по типу «пробиотик против хозяина», не приводит к изменению суммарного содержания лактобацилл. При этом было отмечено, что появление пробиотиче-ских лактобацилл в фекалиях обследуемых сопровождалось снижением количества аутолактобацилл. После отмены пробиотика в течение нескольких суток пробиотические лактобациллы полностью элиминировались из кишечника реципиентов, а содержание индигенных лактобацилл полностью восстанавливалось [54]. До приема пробиотика в опытах in vitro было установлено, что Lactobacillus acidophilus 317/402 обладал антагонистической активностью в отношении штаммов резидентных лактобацилл всех участников эксперимента.
Полученные данные позволяют предполагать, что явление бионесовместимости, имеющее место между резидентными лактобациллами нового хозяина и гомопробиотическим штаммом Lactobacillus acidophilus 317/402, оказало влияние на колонизирующую способность последнего. Возможно, доза вводимого пробиотика (15 млрд. КОЕ в сутки) была недостаточной для его успешной колонизации [54].
В связи со сказанным, исследования влияния пробиотика на резидентную микрофлору здорового были продолжены в экспериментах на животных. Было изучено влияние дозы и степени чужеродности гетеро- и гомопробио-тических лактобацилл на способность их к колонизации кишечника хозяина.
Эксперименты проведены на 50 беспородных белых мышах обоего пола массой 20-22г, в возрасте 2 месяца. Подготовка мышей к эксперименту осуществлялась в условиях, указанных в п. 2.3.1. В течение трех дней до начала опыта у каждого животного определяли индивидуальный титр лактобацилл в фекалиях и выделяли чистую культуру резидентных лактобацилл по методике, описанной в главе 2, п. 2.2.1. У всех мышей количество лактобацилл в фекалиях составляло не менее 108 КОЕ/г.
Видовую идентификацию лактобацилл осуществляли по п. 2.2.4.2. Все животные были разделены на 5 групп по 10 особей в каждой. Видовой состав резидентных лактобацилл, выделенных у здоровых подопытных белых мышей представлен в В качестве гетеропробиотика использовали жидкий препарат кишечных лактобацилл человека Lactobacillus acidophilus 317/402, приготовленный из лиофилизированного «Narine» ТУ 9383-003-04868221-97 (изготовитель ГП НПО «Вирион» г. Томск) на питательной среде № 8 по методике, описанной в главе 2, п. 2.2.5. При необходимости корректировали концентрацию полученной биомассы до 1 млрд. КОЕ/мл добавлением рассчитанного количества питательной среды №8.
В качестве гомопробиотика использовали штамм Lactobacillus plantanim КМ, выделенный из кишечника белой мыши. Жидкий гомопробио-тический препарат получали по методике, изложенной в главе 2, п. 2.2.7. Пробиотики вводили мышам однократно в количестве 4 и 15 млрд. КОЕ. Для получения необходимых концентраций исходную биомассу (1 млрд. КОЕ/мл) Lactobacillus acidophilus 317/402 и Lactobacillus plantanim КМ в асептических условиях разливали по 4 и 15 мл в центрифужные пробирки (по 10 пробирок для соответствующей группы мышей) и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок из каждой пробирки смешивали с 1-1,5 г стерильного сухого корма и скармливали мышам натощак.
Для облегчения дифференциации пробиотических лактобацилл от резидентных, группы мышей №1 и №2 формировали из животных, у которых резидентные лактобациллы не относились к виду Lactobacillus acidophilus, а в группах мышей №3 и №4 - резидентные лактобациллы не относились к виду Lactobacillus plantanim (табл. 33). Мыши 1-й и 2-й групп однократно получали гетеропробиотик Lactobacillus acidophilus 317/402 в количестве 4 и 15 млрд. КОЕ, соответственно. Мыши 3-й и 4-й групп получали гомопробиотик L. plantanim КМ в таких же количествах. Контролем служили мыши 5-й группы, которым вводили стерильную воду.
Оба пробиотика были бионесовместимы с индигенными лактобацил-лами подопытных мышей по типу «пробиотик против хозяина», что исполь зовали в качестве дополнительной биологической метки штаммов для дифференциации пробиотических и индигенных лактобацилл. В связи с тем, что мыши отличаются быстрым продвижением содержимого кишечника, эффект от введения пробиотика оценивали через 2, 4, 6, 8, 10 часов, затем через 1 и 2 суток по изменению суммарного титра лактобацилл (общего количества индигенных и пробиотических лактобацилл) Lg КОЕ/г в фекалиях мышей (табл. 33).
