Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1. Общие аспекты адаптации организма и системы детоксикации ксенобиотиков 14
1.1.1. Стресс-системы и стресс-лимитирующие реакции 15
1.1.2. Метаболизм и детоксикация ксенобиотиков... 21
1.2. Развитие химической патологии и апоптоз... 25
1.2.1. Первичные токсины и клеточные медиаторы 25
1.2.2. Основные про- и антиапоптические белки. Механизм развития апоптоза 60
1.3. Классификация токсинов и лабораторная диагностика интоксикации. 68
2. Собственные исследования 80
2.1. Материалы и методы исследования 80
2.2. Обоснование методологии использования интегрального подхода к оценке функционирования физиологических систем детоксикации крупного рогатого скота 95
2.3 Показатели свободнорадикальных реакций крови крупного рогатого скота в постнатальном онтогенезе и при разных физиологических состояниях 110
2.4 Корреляция показателей свободнорадикального окисления и антирадикальной защиты с уровнем веществ низкой и средней молекулярной массы крови крупного рогатого скота 130
2.5 Интегральные индексы функционирования физиологических систем детоксикации крупного рогатого скота на основе данных о содержании веществ низкой и средней молекулярной массы крови 156
2.6 Связывающая способность сывороточных альбуминов как критерий функционирования физиологических систем детоксикации крупного рогатого скота 182
2.7 Интегральные показатели функционирования физиологических систем детоксикации крупного рогатого скота на основе данных о содержании веществ низкой и средней молекулярной массы, общей концентрации альбуминов и показателей свободнорадикальньгх реакций крови 190
2.8 Сорбционная способность эритроцитов как интегральная характеристика функционирования физиологических систем детоксикации крупного рогатого скота 210
2.9 Метаболические реакции при ацетальдегидной интоксикации 214
3. Обсуждение результатов 245
Выводы 292
Практические предложения 295
Библиографический список. 297
Приложение 325
- Стресс-системы и стресс-лимитирующие реакции
- Обоснование методологии использования интегрального подхода к оценке функционирования физиологических систем детоксикации крупного рогатого скота
- Связывающая способность сывороточных альбуминов как критерий функционирования физиологических систем детоксикации крупного рогатого скота
- Метаболические реакции при ацетальдегидной интоксикации
Введение к работе
Значительные стрессовые нагрузки в современных условиях на организм сельскохозяйственных животных, в том числе крупного рогатого скота, могут понижать эффективность системы естественной деток-сикации и, в свою очередь, устойчивость организма к влиянию тосикан-тов. Поэтому для сохранения продуктивного здоровья животных необходим постоянный контроль над функционированием системы детокси-кации с учетом возрастных и других факторов. Кроме того, сведения об особенностях ее деятельности в зависимости от возраста и физиологического состояния следует учитывать при организации системы адаптационных мероприятий по ветеринарной защите здоровья животных.
В настоящее время для оценки системы детоксикации крупного рогатого скота в основном используют метаболические показатели, характеризующие функциональное состояние печени и почек, однако они не всегда обладают высокой диагностической надежностью. Совершенствованию этой оценки препятствует недостаточная изученность метаболических реакций, обеспечивающих детоксикацию, с помощью современных биохимических методов (с учетом возраста и физиологического состояния).
К универсальной системе детоксикации относится антиоксидантная система (АОС). В последние годы для оценки свободнорадикальных процессов тест-объекта все шире используется метод биохемилюминес-ценции [21, 27]. Однако у крупного рогатого скота с помощью этого метода в физиологических условиях не изучались возрастные изменения и особенности этих реакций при разных физиологических состояниях. Малочисленными являются сведения о показателях биохемилюминес-ценции крови животных при патологических состояниях [134].
Интегральный показатель на основе данных о содержании веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) считается универсальным биохимическим маркером, отражающим уровень патологического метаболизма, а, следовательно, и деятельность системы детоксикации [48, 69]. Но в литературе отсутствуют сведения об уровне ВНСММ и о его соотношении с состоянием свободнорадикальных процессов в крови крупного рогатого скота в постнатальном онтогенезе и при разных физиологических состояниях.
Недостаточно сведений о взаимосвязи интенсивности свободнорадикальных реакций с процессами катаболизма белков и энергетическим состоянием клетки при острой химической интоксикации.
Конъюгирование ксенобиотика с альбуминами является первым безопасным и эффективным механизмом детоксикации при окислении веществ в печени [53]. В то же время практически отсутствуют сведения об эффективной концентрации (ЭКА) и связывающей"способности сывороточных альбуминов (ССА) у крупного рогатого скота разного возраста в норме и при патологии.
Одним из интегральных показателей функционирования системы детоксикации животных является сорбционная способность эритроцитов (ССЭ). Однако данных об этом показателе у крупного рогатого скота в физиологических условиях в постнатальном онтогенезе до сих пор не имеется. Недостаточно сведений о сорбционной способности эритроцитов животных при патологических состояниях [78].
Это показывает необходимость в разработке нового более совершенного методологически обоснованного подхода к оценке функционирования системы детоксикации крупного рогатого скота.
Цель исследования
Разработка интегрального подхода к оценке функционирования системы детоксикации организма крупного рогатого скота в постнатальном онто генезе для совершенствования в современных условиях адаптационной стратегии защиты здоровья и продуктивности животных.
Задачи исследования:
1. Обосновать методологию использования интегрального подхода к оценке функционирования системы детоксикации организма к-рупного рогатого скота.
2. Дать интегральную оценку интенсивности свободноради-кальных процессов крови крупного рогатого скота в физиологических условиях и при метаболических нарушениях. Разработать интегральный показатель сбалансированности реакций свободнорадикального окисления биомолекул и состояния антирадикальной системы для характеристики системы детоксикации организма животных.
3. Установить степень сопряжения интенсивности процессов свободнорадикального окисления и активности антиоксидантной защиты с уровнем соединений низкой и средней молекулярной массы крови крупного рогатого скота в физиологических условиях и при сдвигах в обмене веществ.
4. Разработать интегральные индексы для характеристики системы детоксикации организма крупного рогатого скота на основе данных о содержании ВНСММ крови в физиологических условиях и при метаболических нарушениях.
5. Охарактеризовать эффективную концентрацию и связывающую способность сывороточных альбуминов крупного рогатого скота в физиологических условиях и при сдвигах в обмене веществ и оценить эффективность использования этих показателей для характеристики системы детоксикации организма животных.
6. Разработать интегральные показатели для оценки функционирования системы детоксикации организма крупного рогатого скота на основе данных о содержании ВНСММ и альбуминовых показателях крови.
7. Оценить сорбционную способность эритроцитов крови крупного рогатого скота в норме и при сдвигах в метаболизме; на основании этих данных установить целесообразность использования интегрального показателя ССЭ для характеристики функциональной системы деток-сикации организма животных.
8. Охарактеризовать функционирование про- и антиоксидант-ных систем, процессы катаболизма белков и энергетическое состояние клетки в эксперименте при острой ацетальдегидной интоксикации.
Научная новизна
С помощью интегрального подхода расширены представления о функционировании в физиологических условиях антиоксидантной системы крупного рогатого скота в постнатальном онтогенезе. Впервые показано, что интегральные показатели сыворотки крови, характеризующие интенсивность свободнорадикальных процессов и состояние антиоксидантной системы, стабилизируются к 2- и 6-месячному возрасту телок соответственно. У коров в наиболее напряженные для организма физиологические периоды процессы пероксидации протекают на стационарном и низком уровне, а активность антирадикальной защиты усиливается.
Впервые получены сведения об уровне веществ низкой и средней молекулярной массы у клинически здорового крупного рогатого скота с учетом возраста и физиологического состояния. Установлено, что содержание этих веществ в плазме и эритроцитах крови телок стабилизируется к 1-й 6-месячному возрасту соответственно. В крови коров в периоды заключительного этапа сухостойности и новотельности содержание молекул низкой и средней молекулярной массы снижается.
Впервые установлена взаимосвязь интенсивности протекания свободнорадикальных реакций с уровнем веществ низкой и средней молекулярной массы в крови животных в физиологических условиях и при метаболических нарушениях. При активации свободнорадикальных процессов усиливается образование этих веществ и сорбция их эритроцитами крови. При состоянии окислительного стресса наблюдается повышенное содержание соединений низкой и средней молекулярной массы в плазме и эритроцитах крови.
Выявлены особенности реакций конъюгирования естественных метаболитов с альбуминами сыворотки крови у крупного рогатого скота в физиологических условиях. Впервые показано, что эффективная концентрация и связывающая способность этих белков практически не изменяется у телок разного возраста так же, как и у коров при разных физиологических состояниях. Установлено снижение эффективной концентрации и нарушение связывающей функции альбуминов при нарушенном метаболизме.
Обнаружены возрастные изменения показателя сорбционной способности эритроцитов у клинически здорового крупного рогатого скота. Впервые показано, что его числовые значения с 1-месячного возраста телок находятся практически на постоянном уровне. Сорбционная способность эритроцитов коров практически не изменяется при разных физиологических состояниях. При состоянии окислительного стресса значения этого показателя увеличиваются.
Получены новые данные о сопряжении свободнорадикальных реакций с процессами катаболизма белков и энергетическим состоянием клетки в норме и при острой интоксикации ацетальдегидом.
Методологически обоснована целесообразность и доказана в исследованиях эффективность использования нового интегрального подхода к оценке функциональной системы детоксикации крупного рогато го скота. Интегральный подход разработан на основе показателей крови, характеризующих интенсивность свободнорадикальных процессов, состояние антиоксидантнои системы, содержание веществ низкой и средней молекулярной массы в плазме и эритроцитах, эффективную концентрацию и связывающую способность альбуминов.
Адекватное усиление функционирования физиологических систем детоксикации можно выявить по интенсификации реакций свободнора-дикального окисления. О неадекватном их усилении позволяет судить значительная активация в крови свободнорадикальных процессов, истощение антиоксидантнои системы, повышенное содержание веществ низкой и средней молекулярной массы в плазме, снижение сорбционной емкости эритроцитов, эффективной концентрации и связывающей способности альбуминов.
Практическая значимость
Результаты исследований используются в лабораторной диагностике для оценки функционирования системы детоксикации организмов человека и животных. Имеется патент «Способ оценки эндотоксикоза организма». Поданы заявки на изобретения: № 2003122548, приоритет от 18.07.2003 («Способ диагностики эндотоксикоза организма»); № 2003111900, приоритет от 12.09.2003 («Способ диагностики эндотоксикоза у коров с острым гнойно-катаральным эндометритом»), № 2004100926, приоритет от 09.01.2004 («Способ диагностики степени интоксикации организма»).
Коэффициент сбалансированности, представляющий собой отношение показателей состояния антиоксидантнои системы и интенсивности процессов пероксидации, является объективным критерием оценки антиоксидантного статуса и рекомендуется для своевременного выявления оксидативного стресса в организме животных.
Интегральные индексы на основе данных о содержании веществ низкой и средней молекулярной массы крови крупного рогатого скота позволяют оценить соотношение между активностью протеазной и ан-типротеазной систем.
Эффективная концентрация и связывающая способность альбуминов сыворотки крови крупного рогатого скота являются важными методами диагностики сдвигов в обмене веществ.
Разработанные интегральные индексы на основе изучения баланса между накоплением веществ низкой и средней молекулярной массы в крови и сорбцией этих соединений эритроцитами и альбуминов крови позволяют выявлять уровень патологического обмена.
Модифицированный в работе спектрофотометрический метод определения сывороточных альбуминов крупного рогатого скота является точным, воспроизводимым, экспрессным и может быть широко использован в ветеринарной лабораторной диагностике.
Новые данные, полученные с помощью интегрального подхода к оценке функционирования системы детоксикации крупного рогатого скота, могут послужить методологической основой для обоснования эффективной стратегии ветеринарной защиты сохранения здоровья животных и повышения продуктивности.
Результаты исследований используются в лекционных курсах, ла-бораторно-практических занятиях по физиологии и биохимии на кафедрах нормальной и патологической физиологии, химии ФГОУ ВЕЮ «Омский государственный аграрный университет»; физиологии, биохимии и химии ФГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия»; биологии ФГОУ ВПО «Омский государственный педагогический университет»; физиологии и биохимии животных ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет». Они отражены в учебном пособии для студентов, рекомендованном Учебно-методическим объе динением вузов РФ по образованию в области зоотехнии и ветеринарии (Практикум по биохимии печени и почек / И.П. Степанова [и др.]. — Омск: ИВМ ОмГАУ, 2003 .-108 с).
Основные положения, выносимые на защиту
1. Интегральные характеристики крови, отражающие функционирование естественной системы детоксикации организма крупного рогатого скота — интенсивность свободнорадикальных процессов и состояние ан-тиоксидантной системы, содержание веществ низкой и средней молекулярной массы, эффективная концентрация и связывающая способность альбуминов, и сорбционная способность эритроцитов, изменяются в по-стнатальном онтогенезе и зависят от физиологического состояния животных.
2. Свободнорадикальные реакции, протекающие в крови крупного рогатого скота, сопряжены с процессами образования и связывания веществ низкой и средней молекулярной массы.
3. Интегральный подход к оценке функционирования физиологической системы детоксикации крупного рогатого скота, заключающийся в комплексном использовании показателей крови: свободнорадикального окисления, состояния антиоксидантной системы, содержания веществ низкой и средней молекулярной массы и альбуминов, является методологически обоснованным и эффективным.
Адекватное усиление функционирования физиологических систем детоксикации можно выявить по интенсификации реакций свободнорадикального окисления. О неадекватном его усилении позволяет судить значительная активация в крови свободнорадикальных процессов, истощение антиоксидантной системы, повышение содержания веществ низкой и средней молекулярной массы, изменение сорбционной емкости эритроцитов, снижение эффективной концентрации и связывающей способности альбуминов.
Апробация работы
Основные результаты представлены на XVIII съезде Российского физиологического общества (Казань, 2002), на ІУсьезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002), на II Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2000) и других Всероссийских научных и научно-практических конференциях и симпозиумах.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 324 страницах печатного текста, содержит 82 таблицы, 76 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов исследования, 8 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и приложения. Библиографический список включает 270 источников, в том числе 142 на русском языке.
Публикации. Материал, представленный в диссертации, отражен в 45 публикациях, включая монографию и 6 статей в ведущих научных. изданиях и журналах, Перечень которых утвержден ВАК Минобразования России. Всего автором опубликовано 63 печатные работы.
Стресс-системы и стресс-лимитирующие реакции
Любые сильные воздействия окружающей среды (острая гипоксия, тепловой шок, холод, боль, цитотоксические препараты, ионы тяжелых металлов, ионизирующее излучение, разнообразные ксенобиотики и т.д.) вызывают стандартную стресс-реакцию, которая характеризуется увеличением продукции и высвобождением стресс-гормонов: кортико-стероидов, катехоламинов, проламина, гормона роста и др. Эти гормоны, в свою очередь, вызывают каскад биохимических процессов, приводящих в конечном итоге к мобилизации организма в ответ на экзогенный или эндогенный стрессор. Однако эти реакции не являются специфическими, т.е. в ответ на самые различные неблагоприятные факторы индуцируются одни и те же, выработанные и закрепленные в процессе эволюции, процессы. Если говорить об их физиологическом проявлении, то на первой стадии стресса или, как ее назвал Г. Селье, «реакции тревоги», продолжающейся 48 часов от начала воздействия стрессора, отмечается быстрое уменьшение размеров тимуса, селезенки, лимфатических узлов, печени, исчезновение жировой ткани и др.
О биохимическом «поведении» организма в условиях стресса и пойдет речь в данной работе. Но сначала необходимо в самых общих чертах вспомнить механизм развития стресса.
Стресс-реакция, или стресс, активирует регуляторную стресс-систему, которая осуществляет «настройку» органов и тканей, вовле ченных в адаптацию, на функционирование в новых условиях. Эта система состоит из центрального звена и двух периферических ветвей.
Центральное звено находится в головном мозге в гипоталамусе и других отделах ствола мозга и объединяет 3 группы нейронов: вырабатывающие кортикотропин-рилизинг-гормон (КРГ), стимулирующий секрецию адренокортикотропного гормона (АКТГ); вырабатывающие гормон ар-гинин-вазопрессин (АВ); синтезирующие катехоламины.
Периферические ветви стресс-системы представлены двумя основными отделами: гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковым, эффекторами которого являются гормоны глюкокортикоиды и симпато-адреналовым, эффекторами которого являются адреналин и нор адреналин.
Основным результатом активации стресс-системы является увеличенный выброс главных стресс-гормонов: глюкокортикоидов, катехола-минов, которые способствуют мобилизации функций органов и тканей, ответственных за адаптацию, и обеспечивают увеличение их энергообеспечения. Как показали исследования последних 10 лет, в стресс-реакцию вовлечены вещества, потенцирующие или опосредующие эффекты стресс-системы, в частности, ангиотензин II и цитокины.
Интенсивность стресс-реакции определяется соотношением активации стресс-системы, реализующей ответ организма на стрессор и «стресс-лимитирующих систем», которые могут ограничивать активность первых [72, 74, 143].
К основным центральным стресс-лимитирующим системам относятся ГАМК-эргическая, опиоидная системы и др., на которых мы не будем заострять внимание. Действие стресс-системы на уровне органов и тканей ограничивают локальные стресс-лимитирующие системы. К ним относятся: простагландиновая, антиоксидантная, аденозинэргическая, системы генерации оксида азота (II) и стресс-белков теплового шока (Hsp70 - heat shock protein). Ответные реакции клеток на воздействие стрессора зависят от силы, типа и продолжительности действия последнего. В развитии этих реакций, согласно концепции Ф.З. Меерсона (1993), существуют два этапа: срочной, но несовершенной, и долговременной, устойчивой адаптации: Срочный этап возникает непосредственно после начала действия раздражителя и реализуется на основе готовых, ранее сформировавшихся биологических механизмов. В этот период деятельность организма нередко протекает на пределе его физиологических возможностей.
Долговременная адаптация представляет собой постепенно развивающийся ответ организма на многократное либо длительное действие внешнего фактора. Она реализуется за счет формирования или усиления физиологических механизмов, позволяющих в течение определенного времени оставаться здоровым даже в условиях, ранее несовместимых с жизнью.
Следует заметить, что генетическая программа организма предусматривает включение не только готовых механизмов адаптации, но и возможность их формирования под влиянием различных факторов среды. Однако результаты фенотипической адаптации не передаются по наследству, поскольку в быстро и постоянно меняющихся условиях жизнедеятельности следующему поколению обязательно встретятся новые факторы, которые заставят организм формировать собственные специализированные реакции для адаптации и поддержания гомеостаза.
Фактически, срочная и долговременная адаптации являются по-следовательными этапами одного и того же процесса - адаптационного повышения устойчивости организма к повреждающим факторам. Тем не менее, эти этапы вовлекают разные механизмы и имеют различную биологическую значимость.
На срочном этапе происходит активация стресс-лимитирующих систем, мобилизация энергетических и структурных ресурсов, что в конечном итоге приводит к быстрым изменениям активности основных липидзависи-мых мембранных белков, ферментов, рецепторов и каналов ионного транспорта, увеличению синтеза вторичных мессенджеров и активации клеточного метаболизма.
Вслед за мобилизацией этих механизмов реализуется фаза активации генов, которая играет ключевую роль в переходе от срочного этапа адаптации к долговременному.
По самым общим представлениям в ходе адаптации происходит последовательная координированная активация вначале ранних регуля-торных генов, кодирующих протоонкогены и стресс-белки Hsp70, а затем поздних структурных генов, кодирующих Са2+-АТРазу, антиокси-дантные ферменты и т.д. Причем, активация ранних генов и увеличение синтеза Hsp70 и протоонкогеїюв является неспецифическим звеном адаптации, т.е. это компенсаторно-приспособительная реакция в ответ на действие самых разных факторов. _.,
Последующая активация поздних структурных генов является специфической. Например, при адаптации к гипоксии активируются гены, кодирующие белки, вовлеченные в транспорт молекулярного кислорода, рост коронарных сосудов и эритропоэз; при адаптации к холоду активируются гены, кодирующие термогенин, липопротеинлипазу и другие белки и ферменты, которые обеспечивают увеличение продукции тепла и рост бурой жировой ткани и т.д.
Обоснование методологии использования интегрального подхода к оценке функционирования физиологических систем детоксикации крупного рогатого скота
Поэтому он осуществляет роль «дальнобойного оружия», вызывающего окислительную модификацию отдаленно расположенных ферментов и макромолекул.
Пероксид водорода образуется не только ферментом COD, но и некоторыми другими энзимами. Таким свойством обладает, например, фермент циклооксигеназа. Избытком образующегося пероксида водорода циклооксигеназа вызывает собственную деструкцию, «выключая» тем самым синтез простагландинов, когда влияния этих физиологически активных соединений организму больше не требуется. Показано, что подобным удивительным свойством обладает и фермент монооксигеназа (цитохром Р-450), который в процессе метаболизма ксенобиотиков также продуцирует пероксид водорода. Исчерпав субстрат окисления, пероксид водорода инактивирует фермент и прекращает его деятельность. Таким образом, инактивация ряда ферментов пероксидом водорода представляет собой физиологический механизм регуляции их деятельности. Однако под влиянием факторов окружающей среды образование Н202 может оказаться чрезмерным.
К вторичным радикалам относятся, прежде всего, гидроксильный радикал (НО») и с некоторыми оговорками липидные радикалы (LO , L»), участвующие в реакциях цепного окисления ненасыщенных жирно-кислотных цепей липидов, биологических мембран и липопротеинов плазмы крови. Они образуются из пероксида водорода, либо пероксидов липидов, либо гипохлорита под влиянием ионов металлов переменной валентности, особенно ионов железа Fe (реакция Фентона): В качестве третичных можно рассматривать радикалы, которые образуются при действии вторичных радикалов на молекулы антиокси-дантов и других легкоокисляющихся соединений. Следует подчеркнуть принципиальную разницу в биологическом действии первичных и вторичных радикалов. Первичные радикалы специально вырабатываются нашим организмом и выполняет жизненноважньте функции, в частности, защиты от микроорганизмов (супероксид) и регуляции кровяного давления (оксид азота), тогда так вторичные радикалы оказывают цитотоксическое. действие и, как правило, наносят организму большой вред. Роль же третичных радикалов может быть разной. Таким образом, АФК, являясь продуктами нормального клеточного метаболизма, постоянно генерируются в организме в результате окислительно-восстановительных реакций. Системы, участвующие в образовании интермедиатов кислорода, и процессы, связанные с окислительной деструкцией биологически активных соединений, условно объединяют в понятие прооксидантная система. При действии на организм различных неблагоприятных факторов реакции образования АФК резко усиливаются. При этом интермедиаты кислорода могут оказывать токсическое действие, вызывая, в частности, окислительную модификацию биополимеров: белков, липидов, нуклеиновых кислот, углеводов. Для предотвращения структурных изменений столь важных макромолекул клетка создала себе целую систему, призванную обезвреживать АФК и разрушать пероксидные соединения. Этот комплекс реакций, встречающихся во всех живых организмах от растений до высших животных и человека, рассматривается как универсальная биологическая система естественной детоксикации и обозначается термином анти оксидантная система (АОС). Действие этой системы определяет в известной мере развитие адаптационных и компенсаторных процессов при действии химических веществ на организм и повышает его устойчивость к действию токсикантов [121, 122]. По современным представлениям система антиоксидантной защиты в клетке состоит из неферментативного и ферментативного звеньев, согласованное действие которых обеспечивает неспецифическую резистентность организма. [186, 199, 240, 264, 265]. Неферментативное звено представлено водо- и жирорастворимыми антиоксидантами. Водорастворимыми являются низкомолекулярные небелковые соединения на основе глутатиона, а также аскорбиновая кислота (витамин С). Жирорастворимые антиоксиданты включают: вещества из группы витамина Е, стероидные гормоны, витамины А и К, флавоноиды (витамин Р) и полифлавоноиды (убихинон). Эти вещества являются либо ловушками свободных радикалов, либо разрушают пероксидные соединения. Ферментативное звено антиоксидантной защиты представлено окси-доредуктазными (глутатионредуктаза) а также антирадикальными и антипе-роксидными (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза и др.) ферментами. Так, в частности, супероксиддисмутаза обеспечивает превращение супероксидного анион-радикала в менее активный окислитель — пе-роксид водорода. Образующийся пероксид водорода элиминируется каталазой и пе-роксидазами, восстанавливающими Н2О2 до Н20. В этих реакциях принимает участие трипептид глутатион, обладающий редуцирующими свойствами. Катализируется процесс селензависимой глутатионперок-сидазой, в связи с чем селену в последнее десятилетие уделяется большое внимание как микроэлементу, обладающему антиоксидантными свойствами. Недостаточное содержание селена в рационах питания на селения России позволило отнести его к категории эссенциальных пищевых веществ. Кроме того, в экспериментальных исследованиях установлено, что под влиянием отрицательных факторов окружающей среды потребность в селене увеличивается. Окисленный глутатион восстанавливается глутатионредуктазой с использованием НАДР»Н, образующегося в пентозомонофосфатном цикле. Следует отметить, что в системе антиоксидантной защиты клетки отсутствуют ферменты, способные обезвреживать гидроксильные радикалы. Однако своевременная элиминация 02 и Н2О2 в норме делает невозможным образование НО» [3,208]. Торможение образования вторичных радикалов может быть достигнуто связыванием и удалением ионов железа Fe2+. К этой группе ан-тиоксидантов относится, в частности, природное соединение, содержащееся в мышечной ткани, дипептид карнозин (Р-аланил-гистидин) [23]. Действия ферментов-антиоксидантов тесно связаны друг с другом и четко сбалансированы между собой. Нарушение соотношения ферментативных, а также ферментативных и неферментативных компонентов антиоксидантной защиты может приводить к дополнительной генерации активных форм кислорода и являться одним из проявлений окислительного стресса [9, 219, 240].
Связывающая способность сывороточных альбуминов как критерий функционирования физиологических систем детоксикации крупного рогатого скота
Сущность оценки окислительного стресса, предложенной М.М Абакумовым и др. [92], состоит в определении показателей свобод нора-дикальных реакций (диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, степени окисленности общих липидов) и уровня эндогенных антиокси-дантов (а-токоферола, церулоплазмина) с последующим вычислением интегрального показателя.
Д.И. Кузьменко и Б.И. Лаптевым (1999) разработан индекс, количественно характеризующий резерв липидов сыворотки для пероксидно-го окисления. Параметр представляет собой отношение концентрации малонового диальдегида в сыворотке после стимуляции перекисного окисления ионами Fe + к исходному уровню диальдегида в этой же пробе.
В.П. Арсютов и др. [90] предлагают способ прогнозирования развития послеоперационных осложнений. Сущность изобретения заключается в определении активности ксантиноксидазы в сыворотке крови. Активность фермента оценивается по отношению мочевой кислоты (продукта реакции) к ксантину (субстрату). Повышение или снижение каталитической функции энзима служит плохим прогностическим признаком.
В последние годы активно разрабатывается новый подход к тестированию свободнорадикальных реакций, основанный на регистрации спонтанной или активированной хемилюминесценции биообъекта. Изучению сверхслабого свечения биообъектов посвящены работы В.А. Ба-рабоя и др. [9], Ю.А. Владимирова [22, 23], Е.Е. Дубининой [39], Т.Д. Журавлевой [28], Л М. Балинера и др. [8].
В.А. Кратасюк и др. [2] для определения степени тяжести состояния больных с эндотоксикозами при инфекционно-воспалительных заболевания предлагают метод индуцированной хемилгоминесценции. Для этого регистрируют интенсивность свечения тест-объекта, содержащего люциферазу и её субстраты, до и после введения сыворотки крови обследуемого. Затем рассчитывают отношение интенсивности хемилюми-несценции тест-объекта в присутствии сыворотки к величине этой интенсивности без сыворотки. При значениях полученного отношения ин-тенсивностей 0,26+0,32 определяют состояние обследуемого как удовлетворительное, при значениях 0,32+0,37 - как переход к средней тяжести, при значениях 0,37+0,49 - как состояние средней тяжести, при значениях 0,49+0,5 - как переход к тяжёлому и при значении свыше 0,5 - как тяжёлое.
Следующая группа методов диагностики эндотоксикоза основана на изучении аффинности сывороточных альбуминов. Наиболее распространенными среди этих методов являются тесты токсемии, основанные на изучении эффективной концентрации альбуминов сыворотки крови, т.е. концентрации свободных центров связывания данных белков [4, 38, 64, 120, 209]. Эффективная концентрация альбуминов может быть понижена, например, вследствие значительного выхода альбуминов в межклеточное пространство из-за патологических отклонений микроциркуляции. Она также может быть понижена вследствие уменьшения их общей концентрации в крови, в частности, гипоальбуминемия характерна для нефротического синдрома, ожогов, сепсиса и др.
Известен метод оценки транспортной функции сывороточных альбуминов, предложенный М.А. Андрейчиным, Г. П. Китай и Я.В. Корбы-ло [1]. Он позволяет оценить степень нагруженности альбуминов транспортируемыми веществами, в частности, токсинами различной природы и основан на взаимодействии альбуминов с красителями. Авторы метода определяют связывающую функцию сывороточных альбуминов, используя раствор Конго-рота. У здоровых лиц этот показатель равен 32,48 ±0,78 г/л, что принято ими за норму. При различных видах патологии связывающая способность альбуминов нарушается. Наиболее выраженное снижение сродства альбуминов к красителям наблюдается в сыворотке крови при почечной и печёночной недостаточности. Однако аффинность белка зависит не только от тяжести патологического процесса, но и от индивидуальных особенностей. Следовательно, этот показатель не всегда может служить достоверным критерием оценки тяжести состояния при эндотоксикозе.
Перспективными считаются методы диагностики эндотоксикоза, основанные на определении содержания цитокинов. Способ ранней диагностики сепсиса у новорожденных, предложенный В.В. Эстриным и др., заключается в исследовании уровней интерлейкина-8 и фактора некроза опухоли. Значительное повышение концентрации этих белковых биорегуляторов указывает на развитие септической инфекции [88].
Н.Н. Кузнецов и др. предлагают рефрактометрический способ диагностики эндогенной интоксикации у детей с соматической, хирургической и инфекционной патологией [91]. Определяют посредством рефрактометрии показатель преломления плазмы крови и в зависимости от его значений ранжируют синдром эндогенной интоксикации на 4 степени.
Способ параклинической оценки тяжести эндотоксикоза при патологическом течении беременности заключается в исследовании спектрограмм плазмы и эритроцитов крови, подсчете числа тромбоцитов и определении артерио-венозной разницы по кислороду с последующим вычислением диагностического индекса. По значениям индекса диагностируют компенсированную фазу эндотоксикоза или делают заключение о его манифестации [89].
П.И. Миронов и др. разработали способ диагностики тяжести эндогенной интоксикации при острых гнойно-септических заболеваниях у детей [86]. Сущность изобретения заключается в следующем. Проводят электрофорез сыворотки крови больного. Анализируют полученную электрофореграмму. При наличии на электрофореграмме белковых компонентов с молекулярной массой более 12 кД диагностируют тяжелую эндогенную интоксикацию с формированием органной недостаточности.
В настоящее время в качестве маркера, позволяющего определить степень тяжести эндогенной интоксикации без учета этиологических и нозологических особенностей заболеваний, широко используется содержание веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) в биологических жидкостях. Наибольшее распространение получил скри-нинговый метод определения ВНСММ, предложенный Н.И. Габриэлян и др. [32]. Принцип метода заключается в осаждении белков раствором трихдоруксуснои кислоты, с последующим определением ВНСММ плазмы крови путем прямой спектрофотометрии при длине волны 254 нм. В этом случае уровень содержания этих веществ выражают в единицах оптической плотности. Недостаток этой методики заключается в том, что при этом методе определяются не сами токсические пептиды, а производится определение показателя оптической плотности, зависящего от содержания в крови целого ряда веществ, способных поглощать на этих длинах волн УФ-лучи (мочевая кислота, креатинин, продукты распада нуклеиновых кислот).
Метаболические реакции при ацетальдегидной интоксикации
Установлена условно-вероятная линейная взаимосвязь между значениями показателя, характеризующего свободнорадикальную перокси-дацию, и содержанием ВНСММ плазмы и эритроцитов. Коэффициент Пирсона принимает соответственно значения 0,47 и 0,49 (р 0,05). Также обнаружена условно-вероятная корреляция между показателем антиоксидантной активности сыворотки крови и уровнем соединений низкой и средней молекулярной массы в плазме и эритроцитах крови, коэффициент линейной корреляции в обоих случаях равен 0,49 (р 0,05). Таким образом, при ацетальдгиднои интокикации в организме животных существует сопряжение между активацией свободнорадикальных процессов, состоянием АОС, усиленным образованием ВНСММ и сорбцией этих веществ эритроцитами крови.
В целом результаты эксперимента на крысах показывают, что однократное пероральное введение ацетальдегида в дозе 1/2 LD5o приводит к интенсификации свободнорадикальных реакций уже через 0,5 часа, что в свою очередь вызывает повышенное образование молекул низкой и средней молекулярной массы. Система антиоксидантной защиты активируется через 1 час, причем, максимальные изменения приходятся на 4- 6 часов после введения токсического агента. К окончанию эксперимента, то есть через 24 часа, интенсивность реакций пероксидации, состояние системы антирадикальной защиты и содержание ВНСММ в крови лабораторных животных нормализуются.
В связи с тем, что при ацетальдегидной интоксикации в крови активируются процессы пероксидации липидов и повышается уровень соединений низкой и средней молекулярной массы, представлялось интересным выяснить, каким образом эти процессы связаны с энергетикой клетки, о которой судили по содержанию в ней нуклеотидов и компонентов их метаболизма.
Среди нуклеотидов особая роль принадлежит производным аде-нина — АТР и продуктам ее дефосфорилирования. Поскольку многие ферменты, лимитирующие скорость катаболических и анаболических реакций, чувствительны к концентрации АТР и продуктов ее дефосфорилирования - AMP, ADP, то регуляция метаболических процессов, сопровождающихся накоплением или утилизацией макроэргических фосфатных связей, должна зависеть от энергетического заряда системы ATP-ADP-AMP, который при стационарном состоянии клеток поддерживается на определенном постоянном уровне [148].
Снижение величины энергетического заряда включает процессы, связанные с наработкой АТР, являющейся основным источником энергии почти во всех биосинтетических реакциях и одновременно тормозит реакции, идущие с использованием данного макроэрга. В тех случаях, когда энергетический заряд данной системы выше нормальных величин, наблюдается стимуляция процессов фосфорилирования субстратов, что приводит к образованию ADP или AMP в случае пирофосфат-ного расщепления АТР.
В дышащих митохондриях скорость переноса электронов, а, следовательно, и образования АТР определяется в первую очередь величиной отношения ATP/ADP. Причем показано, что добавление к изолированным митохондриям даже незначительных количеств ADP сразу же доводит скорость дыхания митохондрий до максимальной величины.
Уровень АТР в клетках может поддерживаться за счет двух резервных систем: первая - креатинкиназная ферментативная система, которая катализирует реакцию образования АТР за счет ADP и креатинфосфата; вторая — аденилаткиназная, представленная в основном в печени, в результате действия которой AMP фосфорилируется до ADP. Эта реакция важна тем, что она.способствует повышению концентрации ADP, которая выполняет важнейшую функцию сигнализации об истощении клеточных энергетических ресурсов и действует как мощный положительный фактор на некоторые ключевые ферменты катаболизма углеводов, ведущих к образованию дополнительных количеств АТР. Повышение концентрации ADP при постоянном гидролизе АТР активирует механизм окислительного фосфорилирования, а также повышает каталитическую функцию регу-ляторных ферментов цикла трикарбоновых кислот и гликолиза.
Аденозиндифосфат регулирует не только скорость поглощения кислорода митохондриями, но и контролирует изоцитратдегидрогеназ-ную реакцию, являясь ее аллостерическим активатором. При любых метаболических условиях, вызывающих усиленное разрушение АТР и, следовательно, сопровождающихся накоплением ADP, увеличивается скорость реакций цикла Кребса, так как отношение ATP/ADP регулирует активность цитратсинтетазы, являющейся первичным звеном цикла трикарбоновых кислот.
Повышение скорости реакций данного цикла вызывает ускоренный перенос электронов в дыхательную цепь и, как следствие усиление окислительного фосфорилирования. В результате наработки АТР концентрация ADP снижается, что приводит к падению каталитической функции изоцитратдегидрогеназы.
Непосредственным метаболитом, вовлекающимся в цикл Кребса, является ацетил-КоА - конечный продукт сложных превращений, катализируемых пируватдегидрогеназным комплексом, активность которого также находится в зависимости от отношения АТР/АДР.
Концентрации АТР, величине отношения ATP/ADP и энергетическому потенциалу адениннуклеотидов пропорциональна скорость синтеза белков в изолированных клетках печени. Дня образования пептидных связей при синтезе белков необходима предварительная активация аминокислот, что происходит за счет макроэргических связей молекул АТР. Причем показано, что ни один из других рибонуклеозидтрифосфатов не заменяет АТР в активации аминокислот для процессов биосинтеза высокомолекулярных пептидов.
Наличие многочисленных участков действия нуклеотидов в процессе метаболизма, который находится под контролем соотношения высоко- и низкоэнергетических компонентов, способствует тому, что биосинтез этих соединений регулирует значительное число систем, обеспечивающих образование нуклеотидного «фонда» с тем соотношением компонентов, которое соответствует потребностям данного вида клеток.
