Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Эколога-географическое направление в почвенной микробиологии 7
Вертикально-ярусный подход --..11
Географические закономерности распространения дрожжей 13
Широтно-зональные закономерности 15
Региональные различия дрожжевого населения 18
Географическое распространение разновидностей Cryptococcus albidus 22
Внутривидовая генетическая вариабельность дрожжей и ее связь с географическим распространением 25
Saccharomyces paradoxus 25
Cryptococcus neoformans 27
Candida sonerensis 29
Диморфные грибы рода Taphrina ЗО
Аскомицетовые дрожжи, выделенные из молочно го производства 31
Дрожжи родов Hanseniaspora-Kloeckera 32
Сравнительный анализ диких и культурных дрожжей рода Kluyveromyces 34
Объекты и методы исследования
Объекты и регионы исследования 36
Методы посева, учета и идентификации 41
Фенотипическая идентификация 42
Приготовление сред на ассимиляцию ароматических соединений и алдаровых кислот 44
Тесты на скрещивание .46
Генетическая идентификация
Выделение ДНК 47
Амплификация фрагментов ДНК 49
Проведение рестрикционного анализа 51
Кариотипирование 51
ПЦР с неспецифичными праймерами .53
Обработка изображений гелей 54
Генетическая идентификация 55
Определение нуклеотидных последовательностей 56
Таксономическая структура дрожжевого населения березняков Фенотипическая структура дрожжевых сообществ Общая численность 57
Разнообразие дрожжей 61
Таксономическая структура 64
Доминирующие виды 65
Различия в относительном обилии стенобионтных и индикаторных видов 68
Ординация дрожжевого населения березняков 72
Популяционно-генетическое исследование дрожжей 78
Аскомицетовые дрожжи 79
Базидиомицетовые дрожжи 86
Rhodotorula fujisanensis 88
Rhodotorula minuta 92
Фенотилический вид Sporobolomyces roseus 96
Анаморфные базидиомицетовые дрожжи рода Cryptococcus 100
Филобазидиевые криптококки Cryptococcus terricola 103
Дрожжи фенотипического вида Cryptococcus diffluens 107
Дрожжи фенотипического вида Cryptococcus albidus 112
Тремелловые криптококки
Cryptococcus podzolicus 118
Дрожжи фенотипического вида
Cryptococcus laurentii 12
Исследование структуры дрожжевых сообществ на основании данных молекулярной идентификации 130
Некоторые таксономические исследования 134
Виды близкие к Rhodotorula minuta 135
Асиимиляционные спектры недавно описанных Тремелловых криптококков 136
Физиологический спектр дрожжей вида
Cryptococcus victoriae 137
Сравнение физиологических свойств видов Cr. victoriae, Cr. carnescens и Cr. tephrensis 138
Сравнение физиологических свойств видов Cr. magnus и Cr. wieringae 140
Первое выделение дрожжей
Saccharomyces paradoxus в Западной Сибири 142
Идентификация дрожжей Rhodotorula spp. 145
Идентификация несовершенных аскомицетовых
дрожжей Candida spp. 146
Заключение 147
Выводы 148
Список литературы .150
Приложение 168
- Географические закономерности распространения дрожжей
- Приготовление сред на ассимиляцию ароматических соединений и алдаровых кислот
- Таксономическая структура дрожжевого населения березняков Фенотипическая структура дрожжевых сообществ Общая численность
- Асиимиляционные спектры недавно описанных Тремелловых криптококков
Введение к работе
К микроорганизмам обычно относятся как к абсолютным космополитам. Считается, что мельчайшие размеры способствуют их безграничному распространению и позволяют находить благоприятные микрозоны в любой, в среднем неблагоприятной для данного вида, среде. Это приводит к тому, что из разных типов почв мы постоянно выделяем одни и те же виды бактерий и микроскопических грибов. В то же время, показано, что обилие многих повсеместно распространенных видов почвенных микроорганизмов закономерно изменяется в зависимости от географической широты. Это позволяет говорить о применимости к микробным сообществам закона географической зональности (Мишустин, 1983; Чернов, 1993). Наиболее подробно исследованы в этом аспекте дрожжевые грибы (Бабьева, 1984; Babjeva, Chernov, 1995; Чернов, 2005).
Сравнительно-географический анализ дрожжевых сообществ, рассматриваемых в биогеоценотическом масштабе, может основываться на разных методических подходах. Один из них - оценка численности и видового состава дрожжей в ряду субстратов, которые соответствуют последовательным стадиям деструкции растительных остатков (живые части растений -отмирающие части - растительный опад - разлагающиеся растительные остатки в почве). Показано, что зональные типы биогеоценозов существенно различаются по характеру изменения структуры дрожжевых сообществ в таких пространственно-сукцессионных рядах (Babjeva, Chernov, 1995; Чернов, 2005). В то же время, это заключение базируется в основном на детальных исследованиях дрожжевого населения всего в нескольких географических пунктах, представляющих различные зональные подразделения (Чернов, 2000). Поэтому остается открытым вопрос, чем обусловлены обнаруженные отличия; широтно-зональными факторами среды или же просто большим пространственным удалением, то есть наличием географических барьеров для расселения дрожжевых грибов. Другими словами, имеющиеся данные не позволяют ответить на вопрос, насколько отличает-
6 ся дрожжевое население почв одного типа, в сходных биогеоценозах, в пределах одной природной зоны, но значительно удаленных пространственно.
Другая проблема исследования закономерностей географического распределения микроорганизмов связана с существенными изменениями критериев их таксономической дифференциации. В последнее время в микробиологии бурно развивались молекулярно-биологические методы, которые существенно изменили представление о природе вида у микроорганизмов, в частности, дрожжей. На первый план вышла концепция «элементарных» монофилетических видов, то есть таких групп близкородственных штаммов, внутри которых полностью отсутствует филогенетическая структура, выявляемая на основании анализа нуклеотидных последовательностей в наиболее консервативных генах. Оказалось, что виды дрожжей, выделяемые на основании морфо-физиологических признаков, представляют совокупность многих таких «элементарных» видов, по-видимому, больше соответствующих популяционному, или даже клональному уровням. При клональном типе расселения вероятность обнаружить тот же клон (геновид) будет значительно больше в том месте, где он был обнаружен ранее, независимо от экологических условий. Следовательно, географическое распределение таких геновидов должно зависеть не только от экологических факторов, но и от конкретного местоположения, близости к центрам их возникновения.
Настоящая работа посвящена сравнительному анализу структуры дрожжевого населения в двух сходных, по растительному покрову и типу почв, но географически удаленных, биогеоценозах. В качестве примера были выбраны березняки, которые широко распространены на территории России, включая ее Азиатскую часть. В работе проводится сравнительный анализ дрожжевого населения в пространственно-сукцессионных рядах этих биогеоценозов, как на основе традиционных подходов к видовой дифференциации по морфолого-физиологическим признакам, так и с помощью современных молекулярно-филогенетических критериев.
Благодарности
Я очень признателен своим учителям и наставникам И.П.Бабьевой и
Ф И.Ю.Чернову за внимание и помощь в работе, начиная со студенческих лет.
Применение молекулярно-биологических методов исследования для
анализа дрожжевого населения березняков стало возможным, благода
ря знаниям и практическим навыкам, полученным на научной школе по
Молекулярной экологии, таксономии и систематике дрожжей. Препода
ватели: К.Куртцман (С. Kurtzman), Д.Фелл (J.W. Fell), М.А.Лачанс
(М.А. Lachance), Т.Бэкаут (Т. Boekhout), М.Вайс (М. Weift), А.Фонсека
(A. Fonseca), Ж.П.Сампайо (J.P. Sampaio). Практическая часть исследо
вания популяционной структуры дрожжевых грибов была осуществлена
в Новолиссабонском Университете, Португалия (Universidade Nova de
ф Lisboa, FCT/CREM), благодаря помощи и поддержке И.Спенсер-Мартине
(Isabel Spencer-Martins), А.Фонсека (A. Fonseca), Ж.П.Сампайо (J.P. Sampaio), Ж.Инасио Силва (J. Inacio Silva), Л.Алвеш (L. Alves).
Работа была выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, федеральной целевой программы «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 годы», фонда «Acordo Cultural Portugal - Russia» (GR1CES) и помощи атташе посольства Португалии М.Гоувейа Фернандес.
Я хотел бы поблагодарить сотрудников и аспирантов ФГУП ГосНИИ Генетика Г.И.Наумова, Е.С.Наумову, В.И.Кондратьеву, Ю.В.Иванникову, Н.Н.Сухотину, И.В.Коршунову, Д.О.Газдиева, Е.В.Серпову за помощь в работе с аскомицетовыми дрожжами.
Я благодарен заведующему кафедрой биологии почв МГУ
им.Ломоносова проф. Д.Г.Звягинцеву и всему коллективу кафедры за
ценные рекомендации и постоянную помощь. Благодарю И.А.Максимову
и А.М.Глушакову за практические советы и поддержку в работе. Сбор
I материала в Западносибирском регионе стал возможен благодаря помо-
щи профессора НҐУ Игоря Васильевича Стебаева.
*
Географические закономерности распространения дрожжей
Вертикально-ярусный подход к изучению структуры микробных сообществ заключается в одновременном исследовании микробных комплексов в пределах всех ярусов биогеоценоза: надземном (филлоплана древесных и травянистых растений), наземном (опад, подстилка, моховой и лишайниковый покров), почвенном (включая все генетические горизонты). Основанием подобного подхода является соображение о том, что растительные сообщества, благодаря своей вертикально-ярусной организации, определяют в целом пространственную организацию микробных сообществ в биогеоценозе.
Вертикально-ярусный подход сформировался на кафедре биологии почв при исследовании закономерностей распределения почвенных дрожжей. Систематические исследования, начатые И.П.Бабьевой и И.С.Решетовой в конце 50-х гг., сводились к определению простых валовых показателей (численность, видовой состав) дрожжевых сообществ в почвах различных природных зон и через несколько лет привели к представлению об автохтонных и аллохтонных дрожжах в почве (Бабьева, 1976; 1984). Однако наряду с истинными педобионтами, из почвы, в значительно большем разнообразии, выделялись дрожжи, имеющие явные адаптивные признаки, свидетельствующие об их приспособленности к совершенно другой среде обитания, а именно к филлосфере. Об этом говорили такие свойства многих видов, как интенсивная пигментация колоний, формирование активно отстреливающихся баллистоспор, ярко выраженная сахаролитическая стратегия, проявляющаяся в активной ассимиляции простых Сахаров и отсутствии мощной гидролитической ферментной системы. Такие виды, часто преобладающие в дрожжевом населении почвы, явно попадали в почву с растительным опадом (Бабьева, 1976). Поэтому уже в начале 70-х годов были предприняты первые попытки выйти за пределы собственно почвенных исследований и, одновременно с почвой, изучать дрожжевое население различных частей растений и растительные остатки для получения более глубоких представлений о закономерностях формирования природных сообществ дрожжевых грибов (Бабьева и др., 1973). Эти исследования положили начало циклу работ по сравнительному изучению распространения дрожжей, рассматриваемых в масштабе целых биогеоценозов, включая почву и надземные растительные субстраты (пространственно-сукцессионные ряды). С этих позиций были изучены биогеоценозы всех зон от тундры до пустыни (Бабьева, 1984).
Вертикально-ярусный подход был применен для изучения не только дрожжевых грибов, но и других групп микроорганизмов. С позиций этого подхода проводились сравнительно-географические исследования бактериальных сообществ (Лысак, Добровольская, 1982; Черняковская и др., 1990; Головченко и др., 1993; 1995; Добровольская и др.,1994; 1995; 1996). Это же направление прослеживается в работах, посвященных изучению актино-мицетных комплексов в биогеоценозах различных природных зон (Зенова, 1984; 1998; Зенова, Звягинцев, 1994; Зенова и др., 1996), а также при изучении распределения мицелиальных грибов (Мирчинк, Бабьева, 1981).
Стратиграфический анализ микробных сообществ в разных типах биомов позволил выявить ряд закономерностей в пространственной организации микробных комплексов (Бабьева, 1984а; Звягинцев и др., 1991; Чернов, 1993; Зенова, Звягинцев, 1994; Babjeva, Cher 14 nov, 1995), показав, что принципы вертикальной дифференциации сообществ, выявленные на примере растений и животных, распространяются и на микроорганизмы. С позиций вертикально-ярусного подхода удалось установить также ряд закономерностей в географическом распределении микробных сообществ, рассматриваемых в масштабе всего биогеоценоза. Наиболее изученными в этом плане оказались дрожжевые грибы (Чернов, 2005).
Приготовление сред на ассимиляцию ароматических соединений и алдаровых кислот
Приготовление жидких сред, алдаровые кислоты (муциновая и сахарная к-та)
0,75 г источника углерода растворить в 270 мл воды Довести рН до 3,8
Поместить по 4,5 мл раствора в каждую пробирку и автоклави-ровать
Добавить стерильно в пробирку 0,5 мл 10Х YNB Тесты на агаризованных средах, алдаровые кислоты (L-, D-, т-Тартроновые к-ты, малеиновая к-та)
В колбу налить 240 мл воды, добавить 4,5 г агара и проавток лавировать
« После стерилизации дать колбе немного остыть и добавить в нее по 30 мл раствора источника углерода и 10Х YNB
Разлить по чашкам
Тесты на агаризованных средах, алдаровые кислоты (муциновая к-та, сахарная к-та)
В колбе, содержащую 220 мл воды, растворить 0,75 г источни ка углерода (для этого понизить рН до 3,8)
В другую колбу поместить 50 мл воды и 4,5 г агара Автоклавировать
После стерилизации дать колбам немного остыть и слить колбы вместе
Добавить в нее 30 мл 10Х YNB
Разлить по чашкам
Конечная концентрация в среде 0,25% источника углерода. Тесты на азаризованных средах, ароматические соединения (пирокатехиновая, р-Гидроксибензойная, т-Гидроксибензойная, галловая, салициловая, гентизиновая к-ты; катехол)
В колбу налить 240 мл воды, добавить 4,5 г агара и проавток-лавировать
После стерилизации дать колбе немного остыть и добавить в нее 30 мл раствора источника углерода
Разлить по чашкам Концентрированные растворы азотной (YNB) и углеродной (YCB) основы готовятся в 10Х концентрации и стерилизуются фильтрованием.
Тесты на скрещивание.
Для штаммов, относящихся к виду Rh. fujisanensis, анаморфы вида Curvibasidium cygneicoilum, проводили тесты на скрещивание с типовыми штаммами, представляющими два типа спаривания.
Скрещивание проводили на среде MYP или на следующей среде: Глюкоза-0,02% Соевый пептон - 0,25% Дрожжевой экстракт- 0,05% Агар -1,5%
Тест на скрещивание осуществляли следующим образом (Рисунок 2). На чашку Петри, разделенную на две части (1), помещают немного биомассы исследуемого штамма (в обе половины) и биомассу тест-штамма (разные типы спаривания в каждую половину) (2). Исследуемую культуру смешивали с культурой типового штамма на площади примерно 25% поля соответствующей половины чашки (3), а затем, предварительно прокалив петлю, проводили из каждой смеси культур в радиальном направлении три тонкие полоски (4). Чашки инкубировали в холодильнике до срока 4 недели. Положительный результат скрещивания, - образование мицелия, содержащего телиоспоры, наблюдали, начиная примерно с 14 дней. Рисунок 2.
Для сравнительного анализа базидиомицетовых дрожжей экстракцию ДНК из чистых культур проводили по следующей методике:
Дрожжи инкубировали на среде MYP при комнатной температуре.
Перенести и растворить клеточную массу (взять с чашки Петри стерильной петлей количество равное примерно двум захватам петлей) в микропробирке, содержащей 500 pi лизирую-щего буфера
Добавить в микропробирку стеклянную дробь (425-600 мм диаметром) в количестве эквивалентном объему 200 pi
Взболтать на вортексе на полной скорости (2500-3000 об/мин) 3 мин.
Таксономическая структура дрожжевого населения березняков Фенотипическая структура дрожжевых сообществ Общая численность
Рассмотрим вначале характер распределения общей численности дрожжей. В исследованных березняках численность дрожжей достигала максимальной величины на надземных живых частях растений и закономерно убывала по мере деструкции растительного материала (Рисунок 3).
Новосибирская обл. Московская обл.
При этом величины общей численности дрожжей на одинаковом типе субстрата в каждом из березняков достоверно не различались. Как видно из результатов дисперсионного анализа общая численность дрожжей определяется только стадией пространственно-сукцессионного ряда и не зависит от географического положения пункта (Таблица 5).
При раздельном учете живых и сухих частей растений в Западной Сибири, большая численность дрожжевых грибов была отмечена на сухих частях растений, находящихся на корню, чем на зеленых частях растений. Чтобы проверить это предположение мы провели статистическую оценку достоверности различий между средними значениями численности дрож жевых грибов на всех типах субстрата в пространствен но-сукцессионном ряду. Сравнение средних проводили по критерию Стьюдента (Дмитриев, 1995). В таблице 6 приведены значения величин t-критерия и уровня значимости для всех проанализированных субстратов.
Как видно, среднее значение величины общей численности дрожжей, выделенных с мертвых сухих частей растений, была достоверно выше в Новосибирской области, чем в Подмосковье. Численность дрожжей на других типах субстрата достоверно не отличалась. В то же время, на большом статистическом материале было показано, что численность дрожжей в горизонте А дерново-подзолистых, подзолистых и бурозем-ных почв достоверно ниже в более континентальных районах Сибири по сравнению с лесными почвами предгорий Карпат, Русской равнины и Приморья (Чернов, 2000). В нашей работе было отмечено большое количество образцов с нулевой численностью. Это, в свою очередь, является причиной снижения величины средней численности дрожжей. Подходов к учету образцов с нулевой численности может быть несколько: принимать такую численность за нулевую или равной 102, в соответствии с минимальной разрешающей способностью метода посева. В образцах, где дрожжевые грибы были обнаружены, численность их была такой же, но в Сибирском регионе доля образцов с низкой и нулевой численностью была заметно выше.
Кроме того, хотелось бы отметить особенности распределения величины общей численности дрожжевых грибов в ряду субстратов, соответствующих различным стадиям деструкции растительного материала. Для зоны смешанных лесов характерно плавное снижение численности дрожжей по мере деструкции растительных остатков (Максимова, 2001; Максимова, Чернов, 2004). Максимум выделяемых дрожжей соответствует живым частям растений. В исследованном березняке из Московской области заметно плавное снижение численности дрожжевой микро 61 флоры от живых частей растений к минеральным горизонтам почв с небольшим увеличением численности в гумусовом горизонте почв. В варианте березняка из Новосибирской области отмечен не типичный для лесной полосы характер распределения дрожжевых грибов на различных типах субстрата. Максимум численности наблюдается здесь не на живых частях растений, а на мертвых. Подобный характер распределения неоднократно отмечался для зон с более экстремальными условиями и более коротким вегетационным периодом, то есть для тундры (Чернов, 1985) и пустыни (Чернов и др., 1997; Чернов, 2000).
Асиимиляционные спектры недавно описанных Тремелловых криптококков
В последнее время были сделаны описания на основании различий в нуклеотидных последовательностях новых видов дрожжей, которые по фенотипическому описанию соответствуют крупным широко распространенным видам. Важно, что установить экологическую роль таких близкородственных видов, приуроченность к субстрату или даже конкретному виду растений (Inacio, 2005) возможно лишь при крупномасштабных исследованиях. С другой стороны, показано наличие генетической изменчивости, связанной с действием географических факторов, описано существование популяций у некоторых широко распространенных видов дрожжевых грибов (Saccharomyces paradoxus, Kluyveromyces lactis, De-baryomyces hansenii, Hanseniaspora spp.). Однако, установление подобных явлений стало возможным только благодаря анализу большого числа изолятов, выделенных в различных регионах и из различных субстратов. Поэтому природа и таксономический статус близкородственных видов могут быть установлены только на большой выборке. В результате все большее значение приобретает поиск признаков, с помощью которых можно было бы быстро провести идентификацию большого числа изолятов, не прибегая к секвенированию. Для аскомицетовых видов дрожжей таким методом стал рестрикционный анализ (Esteve-Zarzoso etal., 1999; Fernandez-Espinar etal., 2000; Fernandez-Espinar et.al., 2004; Frutos et.al., 2004). Для нескольких таксонов базидиомицетового аффинитета было предложено использовать ассимиляционные тесты с ароматическими соединениями и алдаровыми кислотами (Fonseca, 1992; Sampaio, 1999; Fonseca et.al., 2000b). Однако последнее не было использовано для многих новых групп близкородственных видов.
Виды близкие к Rhodotorula minuta
В ходе нашего исследования были выделены дрожжи, соответствующие описанию Rhodotorula minuta, которые идентифицировали как Rh.slooffiae и Rh.pinicola. Вид Rh.pinicola был выделен из ксилемы одной из азиатских сосен и описан на трех штаммах (Zhao et.al., 2002). Авторами были предложены физиологические критерии для идентификации нового вида в сравнении с другими представителями клада Naohidea-Minuta, однако только для типовых штаммов. В работе по характеристике дрожжевого сообщества заповедника Serra da Arrabida приведен большой материал по ассимиляционным тестам штаммов, идентифицированных как Rh.slooffiae (Іпасіо, 2003).
Нами было проведено сравнение существующих литературных данных с собственными, полученными для 10 штаммов Rh.pinicola и Rh.slooffiae. Результаты тестов, которые были предложены в качестве дифференцирующих (Zhao et.al., 2002) представлены в таблице:
Таким образом, в качестве дифференцирующего признака для разделения видов может использоваться только ассимиляция лизина в качестве источника азота.
Асиимиляционные спектры недавно описанных Тремелловых криптококков
Для новых видов, соответствующих стандартному описанию Crypto-coccus laurentii (Cr.flavescens, Cr.carnescens, Cr.tephrensis, Cr.victoriae) не было получено результатов ассимиляции ароматических соединений и алдаровых кислот в качестве источников углерода. Ранее их успешно использовали для диффернцирования филобазидиевых криптококков, среди Тремелловых дрожжей данные были известны только для типовых культур Cr.laurentii и Cr.podzolicus (Fonseca et.al., 2000b).
Нами было проведено сравнение типовых штаммов некоторых описанных недавно видов дрожжей, соответствующих фенотипическому описанию Cr.laurentii по физиологическим ассимиляционным тестам на утилизацию ароматических компонентов и алдаровых кислот. Из результатов, представленных в таблице видно, что для исследованных штаммов, свойственен одинаковый ассимиляционный спектр, характерный для Тремелловых криптококков в целом.
Физиологический спектр дрожжей вида Cryptococcus victoriae
Физиологические характеристики дрожжей Cr.victoriae были исследованы в нескольких работах (Monies et.al., 1999; Thomas-Hall et.at., 2002). В то же время, количество штаммов, использованных в этих работах составляет всего 4. С другой стороны, ареал распространения этого вида достаточно обширный: Арктика, Антарктика (Thomas-Hall et.al., 2002), Германия (Herzberg et.al., 2002), Австралия (Prakitchaiwattana et.al., 2004), Европейская часть России и Сибирь (собственные данные). В ходе нашего исследования были получены результаты ассимиляционных тестов для более 20 штаммов этого вида. Отмечена высокая степень полиморфизма, в том числе и по спектру потребляемых субстратов.
