Введение к работе
Актуальность проблемы. Инфекционные болезни, возбудители которых циркулируют в природе, остаются сложной проблемой, несмотря на все усилия по борьбе с ними. Нарастающая в последние десятилетия тенденция сосредоточения очагов природных инфекций на территориях, освоенных или осваиваемых человеком, заставляет искать закономерности их формирования и устойчивого функционирования.
Устойчивость паразитарной системы трансмиссивных заболеваний обеспечивается сложными взаимодействиями гетерогенных структур — популяций основных компонентов очага: возбудителей, переносчиков и прокормителей. Несмотря на большое количество исследований в этой области, представления о структурных компонентах природных очагов недостаточно полны и требуют дополнительных комплексных исследований, касающихся функционирования и контроля эпидемической напряжённости природных очагов и очагов, подвергшихся антропогенной трансформации.
Наиболее патогенными для человека из природно-очаговых трансмиссивных инфекций переносимых клещами являются флавивирусы. Для России наибольшую медицинскую значимость имеет вирус клещевого энцефалита (Korenberg E.I., Kovalevskii Y.V., 1999), который был открыт в 1937 году на Дальнем Востоке как этиологический агент клещевого энцефалита (Павловский, 1940). ВКЭ принадлежит к группе вирусов одноимённого комплекса и вызывает у людей заболевание центральной нервной системы с уровнем смертности 1—2 % для европейского и сибирского генотипа и 30 % -для дальневосточного генотипа (Gritsun T.S. et al., 2003). Передача ВКЭ осуществляется членистоногими переносчиками - клещами семейства Ixodidae.
В настоящее время заболеваемость КЭ она остаётся стабильно высокой и составляет 2,4-2,6 чел. на 100 тыс. населения (3200-3700 случаев в год), но в некоторых регионах Урала, Сибири и Дальнего Востока она в несколько раз превышает среднюю по РФ и достигает 30-35 чел. на 100 тыс. населения. Ежегодно в РФ до 350 тысяч человек подвергаются нападению клещей, а значит, и риску заболевания клещевыми инфекциями, список которых
ежегодно увеличивается. Для одних, вновь выявленных инфекций, роль в инфекционной патологии человека установлена, а для других вопрос патогенности остаётся открытым.
В настоящее время существует несколько видов риккетсий, патогенность которых для человека не подтверждена. Требуются дополнительные исследования этой группы клещевых инфекций для уточнения спектра циркулирующих в России видов и уточнения их патогенности для человека.
Наиболее актуальными вопросами молекулярной эпидемиологии клещевых инфекций являются уточнение их ареалов, генотипов возбудителей этих инфекций, а также видового состава и границ распространения переносчиков.
Известно, что членистоногие переносчики могут влиять на свойства ВКЭ (Вотяков, 2002), в силу чего знание их генетических характеристик может быть полезным при изучении механизмов адаптации возбудителей к различным видам хозяев и формирования их патогенетических свойств. При этом информация о генетических характеристиках иксодовых клещей, распространённых в России, практически полностью отсутствует.
Всё также остаётся актуальной проблема вакцинопрофилактики: доля привитых, подвергшихся нападению клеща, не превышает 10 % даже для районов, неблагополучных по КЭ. Если ранее вакцинопрофилактика проводилась только для людей профессионально связанных с лесом, то сейчас к группе риска можно отнести всё население эндемичных по КВЭ районов. Поэтому необходим генетический контроль производственных штаммов, используемых для вакцинации населения. Исходя из выше изложенного, нами было решено подойти к решению обозначенных проблем комплексно. Отсюда вытекает несколько поставленных целей для моего диссертационного исследования.
Цели исследования: оценить уровень заражённости клещей вида Ixodes persulcatus и определить спектр инфекций в иксодовых клещах, собранных в
пограничных районах ареала - на территории Республики Коми в 2010 году;
определить генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита и риккетсий, циркулирующих в выбранных для исследования природных очагах;
провести молекулярно-генетическую видовую идентификацию иксодовых клещей, участвующих в трансмиссии инфекций, в природных очагах Западной Сибири;
дать генетическую характеристику производственного штамма 205 вируса клещевого энцефалита из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор».
В связи с поставленными целями предстояло решить ряд задач.
Задачи исследования:
создать коллекцию ДНК и РНК, выделенных из индивидуальных иксодовых клещей, собранных в природных очагах Западной Сибири и Северо-Восточного региона Европейской части России;
выявить РНК ВКЭ и ДНК бактерий в коллекционных образцах с помощью ПЦР;
определить ігуклеотидньїе последовательности фрагментов геномов, выявленных в образцах коллекции, вариантов ВКЭ и риккетсий и провести их молекулярно-генетический анализ;
охарактеризовать межвидовую и внутривидовую вариабельность иксодовых клещей /. pavlovskyi и /. persulcatus, собранных на юге Западной Сибири в 2011-2012 гг., участвующих в трансмиссии клещевых инфекций, по нуклеотидным последовательностям митохондриальных геномов;
провести определение полной нуклеотиднои последовательности генома референс-штамма 205 ВКЭ из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор» и его сравнительный анализ.
Научно-практическая значимость
Впервые проведено комплексное исследование природного очага клещевых инфекций в Республике Коми. В клещах I. persulcatus обнаружен генетический материал возбудителей восьми клещевых инфекций: вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp. Уровень инфицированности клещей для разных инфекций колебался от 11,3 % до 1,2 % в зависимости от вида возбудителя. Уровень смешанных клещевых инфекций достигал 5,6 %.
Впервые проведена оценка генетического разнообразия вируса клещевого энцефалита, РНК которого выявлена в иксодовых клещах, собранных в центральных и южных районах Республики Коми.
Впервые показано, что в иксодовых клещах Республики Коми циркулирует сибирский и дальневосточный генотип ВКЭ, причём доминирует дальневосточный, доля которого достигает 81,2 % от числа клещей, генотипированных по ВКЭ. Во всех исследованных образцах иксодовых клещей европейский генотип ВКЭ обнаружен не был.
Анализ нуклеотидной последовательности 5'-НТО геномной РНК ВКЭ, выделенной из индивидуальных клещей, показал высокий уровень вариабельности некоторых участков Y-структуры 5'-НТО. Вариабельность элементов В2, CI, CS В наблюдалась в более чем 50% образцов. Анализ конформации района 5'-НТО геномной РНК ВКЭ показал, что наблюдаются существенные изменения вторичной структуры этого района РНК. Полученные данные подтверждают гипотезу, что вариабельность и конформация 5'-НТО геномной РНК ВКЭ имеют принципиальное значение для адаптации вируса к активной репликации в клетках различных видов.
Установлено, что ДНК Rickettsia spp. встречается в клещах, грызунах и птицах, обитающих в г. Томске и его пригородах, Республике Коми и Республике Молдова. ДНК Rickettsia spp. была обнаружена в 12,7-5,9 % образцов. Анализ нуклеотидных последовательностей генов gltA и отрА, кодирующих цитратсинтазу и белок А наружной мембраны, позволил
б
установить, что на территории Республики Коми циркулируют два вида риккетсий - R. raoultii и R. tarasevichiae, на территории Томска - R raoultii, R. tarasevichiae, R slovaca. С помощью филогенетического анализа показано, что восемь томских изолятов кластеризовались с последовательностью Rickettsia sp. Н820 (JF714220), которая является кандидатной для выделения в новый вид риккетсий.
Проведён анализ генома штамма 205 ВКЭ, используемого в настоящее время для производства вакцины против клещевого вирусного энцефалита из двух вирусных коллекций, прошедших разную пассажную историю. Анализ показал их высокую гомологию и высокий уровень консерватизма штамма 205. Полученные данные по генетическим характеристикам производственного штамма 205 ВКЭ могут быть использованы для стандартизации производства вакцины против клещевого вирусного энцефалита.
Впервые определены полные нуклеотидные последовательности генов субъединицы 1 цитохромоксидазы (COI) и 16S рРНК митохондриальной ДНК клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus, собранных на юге Западной Сибири в 2011-2012 гг. Анализ нуклеотидных последовательностей исследованных митохондриальных генов иксодовых клещей показал, что уровень межвидовых отличий клещей /. pavlovskyi, I. persulcatus и /. ricinus, варьировал от 8 до 12 %, а уровень внутривидовой изменчивости - от 0,58 % до 1,93 %. Полученные данные могут быть использованы для проведения генетических исследований биоразнообразия различных видов клещей, обитающих в Евразии.
Положения, выносимые на защиту
В Республике Коми в клещах /. persulcatus обнаружены генетические маркёры восьми инфекций: вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp.
Установлено, что на территории Республики Коми циркулируют ВКЭ дальневосточного и сибирского генотипа.
Доказано, что элементы СІ, В2, CS В Y-структуры 5'-НТО геномной РНК ВКЭ природных образцов высоковариабельны, при этом вторичная структура 5'-НТО природных вариантов существенно отличается от вторичной структуры 5'-НТО лабораторных штаммов.
Генетические маркёры Rickettsia spp. выявлены в пробах клещей, грызунов и птиц, обитающих в биотопах г. Томска и его пригородах и в клещах Республики Коми.
С помощью секвенирования показано, что полные нуклеотидные последовательности геномной РНК штамма 205 ВКЭ из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор» и производственного штамма 205 из коллекции НПО «Вирион», опубликованной в 1991 г., имеют высокий уровень гомологии.
Установлено, что уровень межвидовых и внутривидовых отличий по нуклеотидным последовательностям генов COI и 16S рРНК митохондриального генома клещей /. pavlovskyi и /. persulcatus подтверждает правильность таксономического разделения двух рассматриваемых видов и позволяет использовать фрагменты последовательностей этих генов в качестве генетического маркёра для видовой идентификации иксодовых клещей.
Вклад автора:
Расчёт и тестирование олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для генотипирования иксодовых клещей; создание коллекции образцов ДНК/РНК, выделенных из иксодовых клещей; проведение ПЦР; определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование) и их анализ, выполнены лично автором.
Выявление РНК/ДНК-маркёров трансмиссивных инфекций в образцах коллекции, расчёт олигонуклеотидных праймеров для определения полной нуклеотидной последовательности штамма 205 вируса клещевого энцефалита выполнено совместно с канд. биол. наук Чаусовым Е.В. и Карташовым М.Ю.
Структура диссертации
