Введение к работе
Актуальность проблемы. Грипп в его зоонозной, сезонной эпидемической и пандемической формах остается серьезной угрозой здоровью населения. Непрерывная циркуляция вирусов гриппа в природе, главным образом среди водоплавающих птиц, и способность к реассортации способствуют появлению новых вариантов вируса с пандемическим потенциалом. Если вирус приобретает способность эффективно передаваться от человека к человеку, он может вызвать вспышку заболевания. Слабый популяционный иммунитет не в состоянии защитить население от нового вируса, и он быстро распространяется по странам и континентам. В отличие от сезонного пандемический грипп поражает преимущественно молодых людей и лиц среднего возраста. Опыт пандемий XX века показал, что они существенно отразились на здоровье людей и повлекли значительные экономические потери.
В 1947 г. Всемирной организацией здравоохранения была создана «Глобальная система надзора за гриппом» (с мая 2011 г. она называется Global Influenza Surveillance and Response System- GISRS), главной задачей которой является получение текущей репрезентативной картины изменений вируса гриппа на глобальном уровне. Программа была организована как сеть лабораторий, нацеленных на изучение циркуляции и особенностей генетического строения штаммов вируса гриппа, выделенных из клинических образцов и секционного материала Национальными центрами по гриппу (WHO/CDS/2005.29).
Сегодня Глобальная программа ВОЗ по надзору за гриппом включает 138 Национальных центров по гриппу из 108 стран, шесть сотрудничающих с ВОЗ референс-центров, расположенных в Лондоне (Англия), Атланте (США), Мельбурне (Австралия), Токио (Япония), Пекине (Китай), Мемфисе (США), 4 Головные контрольные лаборатории (в Австралии, Японии, Великобритании, США), 12 референс-лабораторий по диагностике А/Н5.
Современная концепция надзора за гриппом в России сложилась благодаря совместным усилиям Руководителя Роспотребнадзора, акад. РАМН, проф. Г.Г. Онищенко, академика РАМН, проф. Д.К. Львова и академика РАМН, проф. О.И. Киселева. Система базируется на деятельности двух Национальных центров по гриппу, существующих на базе НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского и НИИ гриппа, и 59 базовых
вирусологических лабораторий Роспотребнадзора. Система охватывает практически всю территорию РФ.
После 2005 г., когда высокопатогенный вирус гриппа птиц A(H5N1) вызвал несколько эпизоотии на территории России, на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» был организован референс-центр по надзору за высокопатогенным вирусом гриппа и референс-лаборатория ВОЗ по диагностике А/Н5. Помимо работ, связанных с эпизоотиями, вызванными высокопатогенным гриппом, в перечень задач этой лаборатории всходит выявление случаев инфицирования людей вирусами гриппа птиц и появления в человеческой популяции вирусов гриппа с пандемическим потенциалом.
В появлении новых вариантов вируса гриппа велико значение Азиатских регионов РФ. Так, юг Западной Сибири (долины рек Оби и Иртыша, Обь-Иртышское междуречье) богат реками и озерами, находится на путях миграции многих видов птиц и является гнездовым ареалом большого числа видов, экологически связанных с водоемами. Территориальные связи западно-сибирских птиц, которые устанавливаются в процессе сезонных миграций, весьма обширны, поскольку здесь сходятся миграционные потоки птиц, зимующих в различных регионах мира - Европе, Африке, на Ближнем Востоке и в Средней Азии, Индостане и Юго-Восточной Азии. Поскольку Юго-Западная Сибирь - это регион с развитой инфраструктурой, относительно высокой для Сибири плотностью населения, то здесь высока вероятность появления реассортантных штаммов между вирусами гриппа человека и животных и возникновения локальных вспышек заболевания людей, вызванных необычными вариантами вируса гриппа.
Физико-географическое положение Восточной Сибири и экологические особенности орнитофауны этого региона также создают благоприятные условия для реассортации геномов различных штаммов вируса гриппа А. Это, в свою очередь, способствует увеличению гетерогенности вирусной популяции и обеспечивает формирование большого разнообразия штаммов, появления и распространения новых, ранее не описанных вариантов вируса гриппа (Львов, 2004).
Дальневосточный регион имеет особое значение в экологии и эпидемиологии гриппа. По его территории пролегает восточноазиатско-австралийский пролетный путь, который включает территории Австралии, Индонезии, Китая, Японии, США, России и некоторых других стран. Таким образом, птицы, мигрирующие этим путем, могут осуществлять перенос патогенных штаммов, эндемичных для Индонезии и Китая, где
постоянно регистрируются вспышки, вызванные вирусом подтипа A(H5N1). Дальневосточный регион имеет самую протяженную в РФ границу с Китаем, страной, где наиболее часто появляются эпидемические штаммы вируса гриппа.
В связи с вышесказанным представляется очевидным, что для своевременного выявления новых вариантов вируса гриппа человека, ретроспективного эпидемиологического анализа и оценки степени защищенности населения от эпидемически значимых типов / субтипов вируса, в дополнение к ординарному эпидемиологическому надзору необходимо проводить комплексное исследование, включающее выявление циркулирующих штаммов вирусов, анализ их молекулярно-биологических и антигенных свойств, филогенетических связей, поиск маркеров высокопатогенных вирусов в сыворотках крови людей из групп риска, анализ динамики популяционного иммунитета.
Цель исследования. Цель настоящей работы - охарактеризовать пандемию гриппа 2009-2010 гг., предпандемический и постпандемический периоды в Азиатской части России, используя комплексную методологию молекулярно-эпидемиологического мониторинга.
Для выполнения поставленной цели необходимо решить следующие задачи.
-
Организовать сбор сывороток крови людей, проживающих на территориях, неблагополучных по гриппу птиц A(H5N1).
-
Разработать методику и провести тестирование сывороток людей на наличие антител к вирусу гриппа A(H5N1).
-
Организовать всесезонный сбор образцов сывороток крови в условиях случайной независимой выборки по категориям: мужчины, женщины, возраст 0-18 лет, 19 - 45, 46 - 60 лет и старше 60 лет. На каждого человека собрать основную анамнестическую информацию с обязательными данными о вакцинации.
-
Провести анализ сывороток на наличие специфических антител к серотипам вируса гриппа A (H1N1, H1N1 pdm09; H3N2, H5N1) и вирусу гриппа В двух генетических линий - Виктория и Ямагата. Сыворотки крови, положительные в РТГА к вирусам гриппа птиц A(H5N1), исследовать методом микронейтрализации.
-
Организовать сбор клинических образцов от пациентов с диагнозом «ОРВИ» и патологического материала от людей, скончавшихся от пневмонии, и исследовать их на возможное присутствие различных типов и серотипов вируса гриппа с применением ПЦР-анализа и серологических методов типирования и субтипирования вирусов.
-
Провести секвенирование всех генов у изолированных нетипичных и пандемических штаммов вируса гриппа, у типичных штаммов определить нуклеотидные последовательности генов поверхностных белков - гемагглютинина и нейраминидазы, построить филогенетические деревья генов НА и NA.
-
Провести анализ аминокислотных замен в белках выделенных штаммов по отношению к соответствующим белкам вакцинных штаммов.
-
Определить лекарственную чувствительность штаммов вируса гриппа к используемым в России противогриппозным препаратам.
-
Проанализировать особенности эпидемических сезонов по гриппу в Сибири в сравнении с другими регионами мира.
Научная новизна. Обоснована комплексная методология молекулярно-эпидемиологического мониторинга гриппа, позволяющая выявлять варианты вируса с пандемическим и эпидемическим потенциалом, проводить ретроспективный анализ эпидемических вспышек заболевания, оценивать популяционный иммунитет населения в отношении значимых типов / субтипов вируса гриппа.
Впервые получены данные о наличии специфических антител к поверхностному антигену вируса гриппа птиц серотипа A(H5N1) в сыворотках крови людей на территории России.
Предложен подход к выявлению специфических антител к вирусу гриппа птиц в сыворотках людей, в котором, наряду с референс-антигеном, используются штаммы вируса гриппа, выделенные от птиц данного региона; при постановке РТГА используются нативные эритроциты лошади, макаки-резус или формалинизированные эритроциты лошади, макаки-резус и гуся.
Показано, что эпидемия гриппа в 2009 г. в Азиатской части России была вызвана пандемическим вирусом гриппа A(HlNl)pdm09. В предпандемический период эпидемию вызывали вирусы гриппа A(H1N1), A(H3N2) и вирусы гриппа В (линия Виктория), в первый постпандемический сезон преобладал вирус гриппа A(HlNl)pdm09, коциркулировали вирусы A(H3N2) и гриппа В (линия Виктория). Во второй постпандемический сезон преобладали вирусы гриппа A(H3N2) и В (линия Ямагата). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей показал генетическое разнообразие штаммов вируса гриппа, циркулировавших в Сибири в 2009-2012 гг.
С помощью молекулярно-генетического анализа была определена лекарственная чувствительность выделенных в 2009 г. штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm09 к используемым в России противогриппозным препаратам (все штаммы были чувствительны к антинейраминидазным препаратам озельтамивир, занамивир, препарату арбидол и устойчивы к ремантадину).
Практическая значимость работы. Полученные в ходе работы данные были использованы при подготовке лекционных и практических занятий по курсу Микробиология в Новосибирском государственном университете и на курсах повышения квалификации врачей-вирусологов Центров гигиены и эпидемиологии субъектов РФ, проводимых на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Результаты, полученные при выполнении настоящей работы, были использованы для подготовки пяти учебных и учебно-методических пособий.
Данные о лабораторно подтвержденных случаях гриппа еженедельно предавались во всемирную сеть надзора за гриппом FluNet.
61 нуклеотидная последовательность генов разных типов / субтипов вируса гриппа депонированы в международную базу GenBank (табл.1).
Создана и принята на патентное депонирование в Коллекцию микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» коллекция из 43 штаммов вируса гриппа различных типов / субтипов, выделенных в Азиатской части России в 2008-2012 гг. (табл. 2).
Получены два патента РФ.
Положения, выносимые на защиту
-
Дана характеристика пандемии гриппа 2009-2010 гг., предпандемического и постпандемического периодов в Азиатской части России.
-
Обоснована комплексная методология молекулярно-эпидемиологического мониторинга гриппа, позволившая выявить маркеры вируса с пандемическим потенциалом в сыворотках крови у жителей Западной Сибири, провести ретроспективный анализ эпидемических сезонов гриппа, оценить популяционный иммунитет населения в отношении значимых типов / субтипов вируса.
-
В последний предпандемический по гриппу сезон 2008-2009 гг. в Западной Сибири заболевание вызывали штаммы вируса гриппа A(H1N1), A(H3N2) и вируса гриппа В, по молекулярно-биологическим характеристикам подобные вакцинным штаммам.
-
В 2009 г. грипп вызывали штаммы пандемического вируса A(HlNl)pdm09, по молекулярно-биологическим и антигенным характеристикам подобные референс-штамму A/California/04/2009. От пандемического гриппа наиболее пострадало население Дальнего Востока, в меньшей степени - население Восточной и Западной Сибири, болели в основном люди в возрасте до 30 лет.
-
В эпидемические сезоны по гриппу в 2010-2011 и 2011-2012 гг. заболевание вызывали штаммы вируса гриппа A(HlNl)pdm09, A(H3N2), и вирусы гриппа В двух генетических линий - Виктория и Ямагата.
-
С марта 2009 по май 2012 г. состояние популяционного иммунитета к гриппу в Западной Сибири существенно изменилось, что было связано с появлением пандемического вируса A(HlNl)pdm09.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Международных конференциях по молекулярной эпидемиологии и эволюционной генетике инфекционных болезней (Бангкок, Таиланд, 2006, Амстердам, Нидерланды, 2010), 3-ей Международной конференции «Фундаментальная наука медицине» (Новосибирск, 2007), Международной конференции «Грипп птиц 2008: интеграция для познания и контроля» (Бангкок, Таиланд, 2008), 10-ом Международном симпозиуме по респираторным вирусным инфекциям (Сингапур, 2008), Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, 2008), 7-м Международном симпозиуме по гриппу птиц «Грипп у домашних и диких птиц» (Афины, Джорджия, США, 2009), Международной конференции «Патогенез гриппа: взаимодействие вируса и хозяина» (Гонконг, Китай, 2011) и др. международных и всероссийских научных конференциях.
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 45 печатных работ, в том числе 21 статья (из них 16 в научных журналах, рекомендованных ВАК и 4 статьи в высокорейтинговых международных журналах), 2 патента РФ, 5 учебных и учебно-методических пособия и 15 тезисов научных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 271 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы,
результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, список литературы, содержащий 453 работы отечественных и зарубежных авторов, приложения. Диссертация иллюстрирована 26 таблицами и 23 рисунками.
Личный вклад автора в исследования, вошедшие в диссертацию, был определяющим. Постановка задач, планирование экспериментов, анализ результатов, представленных в диссертационной работе, написание основополагающих научных трудов осуществлялись автором лично. Автором лично или под ее руководством проведено выделение, типирование и субтипирование изолятов вируса гриппа, исследованы их антигенные свойства (при участии А.Г. Дурыманова, О.Г. Курской), проведены молекулярно-биологические исследования (при участии к.б.н. И.М. Суслопарова, И.А. Соболева, М.В. Сивай), исследована чувствительность вирусов к химиопрепаратам, получены иммунные сыворотки животных (совместно с к.б.н. А.В. Зайковской и к.б.н. А.А. Романовской). Сыворотки крови людей, собранные в 2005-2007 гг., были исследованы автором лично в СЦ ВОЗ по гриппу, CDC, Атланта, США, в лаборатории д-ра
А. Климова! и лаборатории д-ра J. Katz. В организации сбора образцов от людей и животных принимали участие к.б.н. К.А. Шаршов, к.б.н. А.Ю. Алексеев, СИ. Золотых, B.C. Беспалов, Л.М. Горбатовская. Синтез новых противовирусных препаратов проводился сотрудниками ИОХ СО РАН, ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН., ИОС УрО РАН. Анализ противовирусной активности препаратов автор проводила лично или совместно с к.б.н. О.А. Плясуновой, Т.Р. Проняевой, к.б.н. Е.Ф. Белановым под руководством д.м.н., проф. А.Г. Покровского. В обсуждении концепции работы участвовали научные консультанты: чл.-корр. РАН, д.б.н., проф. СВ. Нетесов и д.б.н., проф. A.M. Шестопалов. Все материалы, использованные в диссертационной работе, проанализированы и обобщены автором лично. Вклад в работу соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Всем коллегам автор выражает глубокую искреннюю благодарность за совместную работу.
