Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I . Пути образования одноуглеродных соединений в природе 8
1.1. Образование формиата 8
1.2. Образование метанола 10
1.3. Образование метиламина 14
ГЛАВА 2 . Метаноеразуювде бактерии использующие cj - соединения
2.1. Общая характеристика метанобразующих бактерий 16
2.2. Использование Ст-соединений метанобразующими бактериями . 30
2.2.1. Кокки и кокковидные микроорганизмы, использующие формиат 30
2.2.2. Палочковидные бактерии, использующие формиат 32
2.2.3. Кокки и кокковидные бактерии, использующие для метаногенеза метанол и метилированные амины 33
2.2.4. Палочковидные бактерии рода Methano-bacillus, использующие одноуглеродные соединения 39
ГЛАВА 3 . Пути образования метана сообществами анаэробных микроорганизмов 44
3.1. Образование метана из %+С02 и ацетата 44
3.2. Образование метана из Cj-соединений 45
3.2.1. Образование метанаизшетанолай метилированных аминов 45
3.2.2. Образование метана из формиата 48
ГЛАВА 4. Использование одноуглеродных соединений ацетогенными бактериями 50
4.1. Общая характеристика ацетогенов (распространение, учет численности, морфо-физиологические особенности) 50
4.2. Источники углерода, азота и серы для микроорганизмов; потребности в факторах роста 58
4.3. Биохимические особенности фиксации углекислоты ацетогенными микроорганизмами 62
ГЛАВА 5. Сйнтрофные ассоциации анаэробных шкроорганизмов
ГЛАВА 6. Объекты и методы исследования 72
6.1. Источники выделения накопительных культур 72
6.2. Состав сред и процедура их приготовления 73
6.3. Выделение накопительных метанобразующих культур, использующих одноуглеродные соединения 78
6.4. Техника выделения облигатных анаэробов 78
6.5. Чистые культуры анаэробных микроорганизмов, использованных в работе 80
6.6. Микроскопические методы 81
6.7. Методы анализа 84
ГЛАВА 7. Образование метана из одноуглеродных соелинений накопительными культурами шкроорганизмов 87
7.1. Термофильное образование метана из одноуглеродных субстратов нативными пробами 88
7.2. Исследование накопительных культур бактерий, образующих метан из одноуглеродных соединений 91
а) мезофильные накопительные культуры 92
б) термофильные накопительные культуры, образующие метан из одноуглеродных соединений 96
ГЛАВА 8 . Исследование термошльной палочковидной метанобразующей ассоциации, растущей на метаноле НО
8.1. Выделение метилотрофного компонента 117
8.2. Выделение метанобразущих микроорганизмов 133
8.3. Реассоциация термофильной метанобразующей культуры на метаноле из чистых культур Clostridium thermoautotrophicum Z-99 И Methanobacterium thermoautotrophicum Z-19Q1. 136
8.4. Образование H?s при росте на метаноле комбинированной культурой Clostridium thermoautotrophicum Z-99 И Desulfotomaculum nigrificans-781 138
8.5. Синтез корриноидов и других тетрапиррольных соединении Clostridium thermoautotrophicum Z-99 141
ГЛАВА 9. Образоваше метана из пектина комбинированной культурой clostridium eectinofebmehtaffs и methanosarciua vacuolata 154
ГЛАВА 10. Формиат-использущие метанобразующйе бактерии выделение и сравнительные характеристики мезошльного и термофильного штаммов 160
ГЛАВА II . Определение путей использования метанола в процессе анаэробной деструкции с помощью иніишторов ианогенеза 168
Заключение 173
Выводы 180
Список литературы 181
- Образование формиата
- Общая характеристика метанобразующих бактерий
- Образование метанаизшетанолай метилированных аминов
- Общая характеристика ацетогенов (распространение, учет численности, морфо-физиологические особенности)
Введение к работе
Конечным этапом разложения органического вещества в анаэробных условиях является образование восстановленных газообразных продуктов: н2, еж, H2s, тц.
Деструкция органического вещества в анаэробных условиях происходит в несколько этапов. На первом этапе в результате гидролиза полимеров образуются мономеры: сахара, аминокислоты и жирные кислоты. Затем происходит сбраживание этих веществ до спиртов, основным из которых является этанол, и летучих жирных кислот, среди которых преобладает ацетат. Оба этапа сопровождаются выделением водорода и углекислого газа. Заключительным этапом деградации органического вещества при отсутствии в среде нитратов и сульфатов, является метанобразование. На ацетатный и водородный пути приходится соответственно 70 и 30$ образованного в природе метана (jeris, McCarty, 1965; Smith, Mah, 1966; Cappenberg, Prins, 1974). Кроме ацетата и водорода, субстратами метаногенов могут быть также одно-углеродные соединения, как муравьиная кислота, метанол и метилированные соединения азота и серы (Жилина, 1973; Mah et al., 1977; Zeikus, 1977; Hippe et al., 1979; Zinder et al., 1977). Однако о роли этих соединений в метаногенезе известно мало. Имеются данные, что в эвтрофных озерах на долю метана, образовавшегося из метанола и триметиламина, приходится меньше 6% от всего образованного метана (Lovley, KLug, 1983). В илах солевых водоемов, содержащих сульфаты, метаногенез идет исключительно за счет метанола и метилированных аминов, в то время как ацетат и водород полностью используются сульфатредупирующими бактериями (Oremland et al., 1982а; Oremland et al., 1982Ъ).
При исследовании процесса образования метана из целлюлозы
была показана роль 3-углеродных соединений: лактата и пропионата (Бонч-Осмоловская, 1979). Образование метана из этих соединений идет в синтрофных ассоциациях, основанных на межвидовом переносе водорода.
Настоящая работа посвящена исследованию роли одноуглеродных соединений в процессе метаногенеза, а также изучению микробных ассоциаций и чистых культур бактерий, использующих эти соединения.
Целью данной работы является исследование особенностей процесса образования метана из формиата, метанола и метилированных аминов; определение ведущих групп микроорганизмов и характера их взаимоотношений.
Конкретные задачи исследования состояли в следующем.
Исследование морфологии и физиологии микрофлоры, доминирующей при образовании метана из формиата, метанола и метиламинов.
Выделение чистых культур анаэробных микроорганизмов, использующих одноуглеродные соединения, изучение их морфологии, ультратонкой структуры и физиолого-биохимических особенностей.
Исследование выделенных чистых культур анаэробных микроорганизмов для создания лабораторных моделей, воспроизводящих природный процесс образования метана из одноуглеродных соединений.
Научная новизна работы. Выделен в чистую культуру и описан новый вид Methanobacterium thermoformicicum, термофильный организм, образующий метан из формиата.
Показано, что в ряде термофильных биоценозов процесс образования метана из метанола осуществляется синтрофной ассоциацией микроорганизмов.
Выделены и описаны в чистую культуру основные компоненты ассоциации: Clostridium thermoautotrophicum Z-99 И* Methanobacterium thermoautotrophicum z-1901. Свойства ассоциации изучены на комби-
-«санированной культуре,, состо^$г из чистых культур. Показано, что
ассоциация основана ідайежвидовом переносе водорода. ' Практическая ценность исследования. Показано, что при ана- эробном использовании метанола, метаногенез сопровождается образованием ацетата, что отрицательно влияет на скорость и стабильность процесса. Полученные данные могут быть использованы для регуляции процессов в ферментерах при производстве биогаза.
Выделенные чистые культуры метаногенных и ацетогеиных бактерий могут быть использованы для проведения биохимических, энзимо-логических и экологических исследований. C.thermoautotrophicum Z-99 может быть рекомендован как продуцент кобаламина, его образование достигает до 2250 мкг/г сухой биомассы.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзном совещании "Анаэробные микроорганизмы" (г.Пущино, 1982); на конференции молодых ученых Института микробиологии АН СССР (Москва, 1983); на Всесоюзной конференции "Термофильные микроорганизмы в природе и практике народного хозяйства" (Москва, 1983); на Ш Республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых микробиологов "Биология, культивирование и использование микроорганизмов (бактерий, грибов, водорослей) в народном хозяйстве" (Ташкент, 1983); на ІУ конференции по химии и применению порфирри-нов (Ереван, 1984).
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 9 статьях.
Место проведения работы. Работа проведена в Институте микробиологии АН СССР в Отделе литотрофных микроорганизмов (зав.отделом - член-корреспондент АН СССР, профессор Г.А.Заварзин). Ряд работ проводилось совместно с Е.А.Бонч-Осмоловской, Т.Н.Жилиной, В.И.Чу-диной, Т.Н.Назиной, В.Я.Быховским и Н.И.Зайцевой.
Образование формиата
В настоящее время у бактерий известно два пути образования формиата. Первый из них осуществляется при сбраживании гексоз по пути Эмбдена-Мейергофа до пирувата, который с помощью пируват-фор-миат-лиазы превращается в формиат и ацетил-КоА. Такой тип образования формиата характерен прежде всего для энтеробактерий. У этих организмов отсутствует формиатлиаза, расщепляющая формиат до водорода и углекислоты (Готтшалк, 1982).
Сходный путь образования имеют некоторые микроорганизмы рода Bacillus йуд, і963), а также представители следующих родов: Рерococcus, Ccjprpcoccus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, которые относятся к облитатно-анаэробным грам-положительным коккам с бродильным типом метаболизма. Местом обитания этих организмов является желудочно-кишечный тракт животных (Hungate, 1966; Тараканов, 1979). Наиболее изученным является биоценоз рубца жвачных животных.
Известно также, что анаэробные грам-:отрицательные палочки, относящиеся к родам Bacteroides, Fusobacterium, Lachnospira, Buty-rivibrio, сбраживают сахара с образованием формиата (Bergey, 1974). Кроме того, было показано, что несерная пурпурная бактерия способна сбраживать фруктозу в темноте в анаэробных условиях, образуя при этом формиат, ацетат, пропионат, Н2 и С02 (Schon, Bilderman, 1973).
Второй путь образования формиата - восстановление С02; он характерен для гомоацетатных бактерий из рода Clostridium: C.aci-dijlhrici и C.cylindrosporum (Стейнер и др., 1979; Готтшалк, 1982; Byg, 1963; Ljungdahl, Wood, 1982). В большинстве случаев формиат подвергается дальнейшему восстановлению, главным образом, в ацетат. Например, восстановление С02 до ацетата происходит у Clostridium thermoaceticum по следующей схеме: (Ljungdahl et al., 1965; Ljungdahl et al., 1976). При сбраживании гексоз Clostridium formicoaceticum в стационарной фазе своего развития кроме ацетата образует еще и формиат (Andreesen et al., 1970). Механизм образования пока не известен; вероятней всего, он сходен с механизмом образования формиата у Clostridium thermoaceticum (Ljungdahl et al., 1965). Таким образом, формиат является распространенным продуктом брожения. Как будет показано ниже, в некоторых биоценозах он может быть основным субстратом метанобразования. Одним из основных источников метанола в природе является пектин (Schink, Zeikus, 1980). Он представляет собой полимер, состоящий из мономеров галакт- уроновой кислоты, соединенных 1,4-гликозидными связями, небольшая часть карбонильных групп которых этерифицироЕана метиловым спиртом (рис.1) (Кретович, 1980). г- он н он н _ Рис.1 Метоксилированная полигалакт уроновая кислота Пектиновые вещества, содержатся в растительных соках, в плодах яблок, груш, лимонов-и т.д., в мясистых корнях свеклы и моркови (Кретович, 1980; Ward, 1978). В сухом веществе белого клевера содержится до % пектина (Тараканов, 1981). В начальных стадиях стенки растений ее матрикс в основном состоит из пектиновых веществ (Мецлер, 1980). Кроме того, пектин может быть частью внеклеточных полисахаридов, вырабатываемых синезелеными водорослями, например, АпаЪаепа flos-ague (Wang, Fischer, 1973). В слизи неко - II торых других водорослей также отмечено наличие пектина (Саневич и др., 1979; Wolk, 1973; Ward, 1978). Так, присутствие пектина об наружено в клеточной оболочке зеленых водорослей (Sikes, 1978). . родам Некоторые бактерии,, относящиеся к Clostridium, Erwinia и представители рода Pseudomonas обладают пектинметилэстеразами (E.C.3.I.I.I.I) - ферментами, которые разрывают эфирные связи, в результате чего образуется метанол и свободная пектиновая кислота (Rexova-Benkova, Markovic, 1976; Schink, Zeikus, 1980; Donnely, Dagley, 1981). Организмы, обладающие такой ферментативной активностью, получили название пектинолитических бактерий. Сходной активностью, возможно, обладает гомоацетатный микроорганизм Aceto-bacterium woodii, способный к гидролизу метоксигрупп этерифициро-ванных ароматических кислот типа ванилиновой, кофеиновой, 3,4,5-триметоксибензойной, протокатеховой кислот и в дальнейшем использующий образовавшийся метанол для своего роста (Bache, pfennig, 1981). Детальное изучение деградации пектина до метана и С02 было проведено в двух эвтрофных озерах Мендота и Кнаак (Schink, Zei Т4 kus, 1982). С -пектин полностью разлагался после 3-4 дней в озере Мендота и за 10-11 дней в озере Кнаак. Такая разница в биодеградации пектина обусловлена, как считают исследователи, различным характером поступления органического вещества в озера. В озере Кнаак минерализуется в основном органическое вещество листового опада деревьев, окружающих это озеро. Основным организмом, разлагающим пектин в обоих озерах, был Clostridium butyricum. Один из его штаммов использовал пектин согласно следующему уравнению (в микромолях):
Исследователи показали, что максимальная численность пектино А Ч литических анаэробов, составляющая 8 10 -5.10 кл/мл, приходится на октябрь-ноябрь месяц, что связано с массовым развитием водорослей и накоплением в донном осадке листового опада, который содержит пектиновые вещества; минимальная численность наблюдается в апреле-мае и составляет 5 10 -5«10 кл/мл. Таким образом, наибольший приток пектиновых веществ в водоемы наблюдается в осенние месяцы. В связи с этим очевидно, что при анализе путей метанобразования следует учитывать время года, чтобы более объективно оценить роль метанола в метанобразовании. Другим широко распространенным в природе метоке шифрованным соединением является лигнин, который составляет 20-30% от всей растительной биомассы (Головлева, Ганбаров, 1982). Лигнин не разлагается в анаэробных условиях без предварительной химической обработки или микробиологического воздействия в аэробных условиях (Hackett et al., 1977). Поэтому лигнин не может быть источником углерода и энергии для анаэробных микроорганизмов. Шинк и Зейкус (Schink, Zeikus, 1980) считают, что главными продуцентами метанола в природе могут быть метанокисляющие бактерии, и что количество выделяемого ими метанола значительно превышает его образование из пектина и лигнина. Существуют работы, которые подтверждают данное предположение.
Общая характеристика метанобразующих бактерий
Метанобразующие бактерии являются специализированной группой микроорганизмов, осуществляющих конечный этап деструкции органического вещества в анаэробных условиях. Около 80$ атмосферного метана образуется при разложении органического вещества. Это количество метана составляет по углероду 0,5% всего органического вещества, образованного в результате фотосинтеза (Ehhalt, Voltz, 1975). Выделение и изучение метанобразующих бактерий стало возможным лишь с разработкой специальной техники для работы в строго анаэробных условиях (Hungate, 1969; Poston et al., 1971; Edwards, McBride, 1975; Balch, Wolfe, 1979a).
Местом обитания метанобразующих бактерий являются донные отложения морей и пресноводных водоемов (blah et al., 1977; Zeikus, 1977; Taylor, 1982), рубец жвачных животных (Smith, Hungate, 1958), сточные воды (Braynt et al., 1976; Wildgruber et al., 1982). В Лаборатории биогеохимии (ИБФМ г.Пущино) были разработаны очень чувствительные методы с использованием радиоактивных изотопов по учету численности живых клеток метанобразующих микроорганизмов (Беляев, Финкелыптейн, 1973; Беляев, 1974) и скорости мета-ногенеза (Беляев, Иванов, 1975; Беляев, 1976; Беляев и др., 1977; Беляев и др., 1979; Иванов и др., 1980). С применением этих методов было показано, например, что процесс образования метана в неоген-четвертичных отложениях Прикаспийской впадины является совре-менным процессом и происходит со скоростью 2-48 10 см СН на литр воды в сутки (Беляев и др., 1977).
Большинство метанобразующих организмов являются мезофильными, оптимальная температура развития которых лежит в интервале от 30 до 45С (табл.І) (Бонч-Осмоловская, 1979; Zehnder, Wuhrman, 1977; Balch et al., 1979; Taylor, 1982). Однако в последнее время в чистую культуру был выделен ряд термофильных организмов, развивающих в интервале температур от 50 до 97С (Ножевникова, Ягодина, 1983; Zeikus, Wolfe, 1972; Zinder, Mah, 1979; Stetter et al., 1981; Zillig. et al., 1981; Huber et al., 1982; Ferguson, Mah, 1983). В накопительной культуре наблюдали процесс образования метана при температуре выше I00C (Bazoss et al., 1982). Диапазон рН, в котором происходит развитие метанобразующих организмов, довольно широк: от 5,5 до 9,7 (Жилина, Заварзин, 1978; Бонч-Осмоловская, 1979; Zehnder, Wuhrman, 1977; Oremland et al.,!I9,82a) Ferguson, Mah, 1983). Но большинство из них развивается, главным образом, при значениях рН близких к нейтральному (табл.І).Известно, что процесс метанобразования может идти в местах с повышенной минерализацией. Например, в содовом озере метаногенез наблюдался в пробах с концентрацией солей 87 г/л (Oremland et al., ji982a.) Назина наблюдала образование метана в пластовых гидрокарбо-натно-натриевых водах нефтяных коллекторов месторождений Биногады и Сабунчи (Ашперонский полуостров) (Назина, 1983). В целом, однако, увеличение солености среды отрицательно сказывается на метан-образовании (Лауринавичюс, 1984).
Основными субстратами роста метаногенных бактерий в природе считаются %+С02 и ацетат (Беляев и др., 1975; Беляев и др., 1977; Назина, 1983; Jeris, McCarty, 1965; Smith, Mah, 1966; Cap-penberg, Prins, 1974). Однако выход метана из этих соединений может варьировать в широких пределах в зависимости от экологических условий. Так, метанобразование в озере Киву происходит, главным образом, за счет восстановления углекислоты водородом CDeuser(
При исследовании метаногенеза в озерах Марийской АССР Беляевым было показано, что из водорода образуется от 32 до 90$ метана (Беляев, 1976). Метаногенез в пластовых водах подкир-манской свиты месторождения Бинагады (Апшеронский полуостров) происходит на 96$ и более за счет восстановления углекислоты и лишь на 0,14-4,0$ метана образуется из ацетата (Назина, 1983). В альго-бактериальном мате, формирующемся вблизи газогидротерм, 70-80$ метана образуется путем восстановления углекислоты (Sand-beek, Ward, 1981).
Кроме ацетата и I +COg метанобразующие бактерии могут использовать метанол, формиат, метилированные соединения азота и серы, а также СО (Жилина, 1976; Schnellen, 1947; Zeikus, Wolfe, 1972; Zeikus, 1977; Balch et al., 1979; Patterson, Hespell, 1979; Taylor, 1982).
Метановые бактерии морфологически очень разнообразны: среди них встречаются палочковидные организмы, кокки, сардины и спириллы (Жилина, Заварзин, 1974; Жилина, 1983; Smith, Hungate, 1958; Zeikus, Wolfe, 1972; Perry et al., 1974). Современная систематика метаногенов была разработана на основании данных об олигонуклеотидном составе 16-S рРНК (Balch et al., 1977; Balch et al., 1979; Pox et al., 1980). В настоящее время известно около 40 видов метаногенов, подразделенных на 13 родов, относящихся к 4 семействам и 3 порядкам.
Образование метанаизшетанолай метилированных аминов
Тот факт, что метаногенез идет при наличии сульфатов, можно объяснить тем, что кроме ацетата и водородно-углекислотной газовой смеси, субстратами метаногенов могут быть одноуглеродные соединения, такие как метанол, моно-, ди- и триметиламины, а также метилированные соединения серы, исключая метионин (Жилина, 1976; Schnellen, 1947; Hippe et al., 1979; Patterson, Hespell, 1979), которые не являются субстратами сульфатредуцирующих бактерий (Man et al., 1977; Postgate, 1979).
В опытах с меченным по углероду метионином было отмечено, что метильная группа метаболизируется до метана в пробах, где сравнительно низки концентрации сульфатов, но при высоких концентрациях сульфатов он превращается в СО2 (Winfrey, Ward, 1983). В то же время образование метана из метанола и триметиламина не зависит от присутствия в среде сульфатов в концентрации до 20 мМ, то есть метанол и триметиламин не являются субстратами сульфатредуцирующих бактерий (oremiand et ai.,19826)., Кроме того, они установили, что при добавлении к пробам специфического ингибитора метанобразования 2-бромэтансульфоновой кислоты, которая является структурным аналогом коэнзима М, присутствующего только в клетках метанобразующих бактерий, происходит накопление метанола и триметиламина. Это было подтверждено и в опытах с этими соединениями, меченными по углероду. По мнению авторов, главным потребителем метанола и триметиламина в морских осадках являются метанобразую-щие бактерии Methanosarcina barker! и Methanococcus mazei.
Но, как оказалось впоследствии, в морских осадках существует специализированная кокковая микрофлора, использующая метанол и метилированные амины. Совсем недавно из морских осадков был выделен кокк неправильной формы, образующий метан только из моно-, ди-, триметиламина и метанола. Ни ацетат, ни водород-углекислотная смесь данным организмом не использовалась. По ряду признаков, отличающих его от известных выделенных метанобразующих бактерий, авторы сочли возможным отнести выделенный организм к новому роду Methanococcoides (Sowers, Ferry, 1983).
Другой облитатно-галофильный морской мезофильный метанобра-зующий организм был выделен Т.Н.Жилиной (Жилина, 1983). Рост данного организма, как и бактерии, выделенной Соверсом и Ферри, наблюдался только на моно-, ди-, триметиламине и метаноле. Морфологически культура представляла собой полигональные кокки, одиночные или в парах. Оптимальный рост организма наблюдался при 1% Naci в среде .Фенотипически организм представляет комбинацию признаков родов Methanosarcina, Methanococcus, Methanogenium. Организм был отнесен к роду Methanococcus с видовым названием haio-philus.
Количественная оценка метана, образованного из меченных по углероду метанола и метиламина в донных осадках эвтрофного озера была дана Лавлем и Клугом (bovley, KLug, 1983). Оказалось, что метанол и метиламин являются предшественниками менее чем Ъ% и 1% образованного метана соответственно, Такой небольшой процент метана, образованного из метанола и метиламина, исследователи объясняют тем, что в природе существует довольно ограниченный круг органических соединений,при микробиологическом использовании которых образуется метанол и метилированные амины.
Однако эти соединения потребляются с довольно высокой скоро - 47 стью. Так, метаногенез из Сі4-метанола в донных осадках эвтрофно-го озера происходит сравнительно быстро и заканчивается в пределах от 0,5 до I часа, а продукция С -метана сохранялась линейной первые 3 минуты. В этих условиях метилированные амины метаболизи-руются более медленно, чем метанол (Lovley, KLug, 1983).
Очень интересные данные были получены при изучении метаноге-неза в содовом озере с щелочным значением рН и высокой минерализацией (oremiand et ai., . 1982а}# Основными субстратами метанобра-зования в этом озере являются метанол и метилированные амины, другие соединения - формиат, ацетат и Ikj+COg, либо вообще не стимулировали метаногенез, либо увеличение продукции метана за счет этих соединений происходило очень незначительно. Оптимальное значение рН, при котором протекал метаногенез, равно 9,7, а соленость в придонных слоях озера, где происходил отбор проб, составляла 87 г/л. При микроскопировании в люминесцентном микроскопе накопительной культуры, выделенной из проб содового озера и культивируемой на метаноле, были отмечены флюоресцирующие кокки.
Сбраживание метанола в пробах, инокулированных илом метано-тенка, изучали Винсент и Сильвестер (Vincent, Silvester, 1979). Оказалось, что сбраживание метанола может идти двумя путями. По первому пути метанол непосредственно превращается в метан, по второму пути он вначале трансформируется в летучие жирные кислоты, а они, в свою очередь, сбраживаются до метана. Пути превращения метанола зависели от рН среды, ионов НСО3 и наличия в среде таких микроэлементов, как НІ, СО, МО. Так, было установлено, что увеличение содержания в среде микроэлементов приводит к сбраживанию метанола в основном до летучих жирных кислот. Эти данные были подтверждены и другими авторами (Андреезен, 1977; Lettinga et ai., 1979; Lettinga et ai., 1981). Кроме того, ими было установлено, что метанол и ацетат, полученный от сбраживания метанола, при дальнейшем культивировании используется одновременно.
Общая характеристика ацетогенов (распространение, учет численности, морфо-физиологические особенности)
В группу ацетогенных бактерий входят представители различных родов, способные к образованию монокарбоновых кислот из различных субстратов, в том числе из углекислоты при восстановлении ее водородом, и из других одноуглеродных соединений. Более узким является термин "гомоацетатные бактерии", относящиеся к организмам, образующим единственный продукт - ацетат (Wieringa, 1940; Balch et al., 1977; Braun et al., 1981; Wiegel et al., 1981; Leigh et al., 1981).
Однако известны также бактерии, использующие те же субстраты, что и гомоацетатные, но кроме ацетата они образуют и другие КИСЛОТЫ (Zeikus et al., 1980; Sharak, Genthner et al., 1981). Поэтому в дальнейшем мы будем пользоваться термином "ацетогенные бактерии" как более общим, имея в виду все микроорганизмы, способные к образованию летучих жирных кислот из одноуглеродных субстратов.
Следует сразу отметить, во избежании путаницы с терминологией, что иногда под термином "ацетогенная микрофлора" подразумевается совсем иная группа организмов. Этот термин в экологическом значении был введен Брайантом (Bryant et al., 1976) при описании структуры метаногенного сообщества. Под ацетогенной микрофлорой в данном случае подразумеваются организмы, разлагающие различные продукты брожения (кислоты, спирты) до ацетата и водорода. Такие организмы, входящие в синтрофные метаногенные ассоциации, будут рассмотрены в пятой главе обзора. Объектом нашего внимания в данной главе будут лишь ацетогенные организмы, способные к использованию одноуглеродных соединений и образованию CJ-CJ связей.
В настоящее время выделено около двух десятков ацетогенных бактерий. Морфологические характеристики большинства из них помещены в табл.2. Ацетогенные бактерии широко распространены в природе. Так, местами выделения этих бактерий служил ил водоемов (Ohwaki, Hun-gate, 1977; Adamse et al., 1982) ИЛИ ОСадокімвтаЙТбНЯа (Zeikus et al., 1980; Samain et al., 1982). Из осадка озер и морских эстуарий был выделен ГОМОацетаТНЫЙ ОргаНИЗМ Acetobacterium woodii (Baich et al., 1977). Желудок жвачных животных также послужил источником выделения ацетогенных бактерий (Sharak, Genthner, 1981). Разнообразные грязевые и почвенные пробы из различных районов земного шара служили источниками для выделения термофильного гомоацетатного микроорганизма Clostridium thermoautotrophicum (Wiegel et al., 1981), другой термофильный ацетоген Acetogenium kivui выделили из анаэробных осадков озера Киву (Leigh et al., 1981). Из отложений болот, находящихся вблизи Марбурга (ФРГ), был выделен ацетогенный метилотроф Butyribacterium methy-lotrophicum (Zeikus et al., 1980). При учете численности различных ацетогенных бактерий, производящих ацетат из Н2 и COg, было установлено, что число клеток таких организмов в донных отложениях некоторых пресноводных во 2 5 доемов составляет от 7 10 до 4 10 кл/мл, что на два порядка меньше числа метанобразующих микроорганизмов (Braun et al., 1979). Возможно, водород-углекислотная смесь не является главным - 55 субстратом для ацетогенных микроорганизмов. По некоторым данным, эти бактерии используют лишь 2% от всего образованного в эвтроф-ных озерах водорода (Lovley, KLug, 1983). По подсчетам других авторов, число Н?-использующих клостри-дий в пробах полуразложившейся органики болот варьировало от 0,04-Ю4 до 700-10 кл/мл (Ohwaki, Hungate, 1977). Методом разведений была учтена численность Eubacterium limosum в желудке овец, которая равнялась 6,3 10 кл/мл, в болотных же осадках она равнялась 9,5-Ю4 кл/мл (Sharak, Genthner et al., 1981). Все выделенные к настоящему времени ацетогенные бактерии можно условно разделить на три группы. К первой группе относятся ацетогены, имеющие истинные эндоспоры. Это представители рода Clostridium: С.aceticum, C.formicoaceticum, C.thermoaceticum, C.thermoautotrophicum. Ко второй группе относятся неспоровые ацетогенные бактерии Acetobacterium woodii, Eubacterium limosum, Acetogenium kivui. К третьей группе принадлежит пока единственный организм Butyribacterium methylotrophicum (Zeikus et al., 1980), характерной чертой которого является образование устойчивых к нагреванию при 80С клеток, которые не образовывали кор-текса и слоя экзоспориума, характерных для строения истинных эндоспор . В работах Tanner et al. (1981) и Tanner et al. (1982) были проанализированы 16-s рРНК некоторых ацетогенов и показана близкородственная СВЯЗЬ между Eubacterium limosum, Clostridium barker! и Acetobacterium woodii. Очень близкими видами оказались Clostridium formicoacеticum и Clostridium aceticum, коэффициент подобия S у них больше 0,9, что характерно для штаммов одного вида (wiegei et al., 1981). Родственность этих двух видов подтверждает ДНК-ДНК гибридизация, составляющая 54% (Braun et al.,
Clostridium thermoaceticum И Clostridium thermoautotro-phicum, по-видимому, являются близкими видами, о чем свидетельствует гомология ДНК, которая составляет около 50$ (wiegei et al., 1981). Кроме того, после адаптации Clostridium thermoaceticum к росту на Н2+С02 и СО (Kerby, Zeikus, 1983), единственное различие между ними осталось лишь в способности использовать метанол, хотя оба вида могли расти на другом одноуглеродном соединении - формиате.
Все известные в настоящее время ацетогены являются палочковидными организмами (табл.2). Butyribacterium methylotropnicum имеет слегка изогнутые плеоморфные палочки, способные к рудиментарному ветвлению. На основании этой способности и высокого уровня корриноидов в клетках этот организм сначала отнесли к семейству Propionibacteriaceae (Zeikus et al., 1980), однако в дальнейшем ЭТО Предположение бЫЛО отвергнуто (Tanner et al., 1982).
Большая часть ацетогенных бактерий является мезофильными микроорганизмами с оптимумом температуры 30-40С. Гораздо меньшей по численности является группа термофильных организмов, развивающихся в интервале температур 55-60С. Оптимум рН, при котором развиваются мезофильные ацетогенные микроорганизмы, лежит в пределах значений 6,8-6,0. У термофильных микроорганизмов оптимальное значение рН ниже. Так, у Acetogenium kivui pHQnT = 6,4 (Leigh et al., 1981), у Clostridium thermo-autotrophicum оптимум рН соответствовал 5,7 (Wiegei et al., 1981).
Такие микроорганизмы, как Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium AA-I, Acetogenium kivui И организм Х-4 окрашиваются по Граму отрицательно, a Acetobacterium woodii, Eubacterium limocum, Butyribacterium - грам-положительно. У
Clostridium thermoautotrophicum окраска по Граму менялась в зависимости от возраста: так, молодые клетки окрашивались положительно, а старые - отрицательно (Wiegei et ai., 1981). Хотя по строению клеточной стенки все ацетогенные организмы являются грам-положительными.
Детальное электронно-микроскопическое исследование клеточной стенки ацетогенных микроорганизмов было проведено у Acetobacte-rium woodii (Mayer et al., 1977). Оказалось, что клеточная стенка Acetobacterium woodii содержит три слоя. При исследовании состава клеточной стенки Acetobacterlum woodii выяснилось, что она состоит из муреина типа В. D-орнитиловый остаток функционировал как межпептидный мостик между У-карбоксильной группой кислоты и карбонильной группы d-аланинового остатка соседней пептидной субъединицы. В отличие от типичного пептидогликана, в пептидных остатках муреинового слоя Acetobacterium woodii в положении I пептидной субъединицы вместо L -аланина был L -серии (Kandler, Schobert, 1979).
