Введение к работе
Актуальность проблемы. Сибирская язва относится к группе особо опасных зоонозных инфекций и до сих пор продолжает оставаться актуальной проблемой для здравоохранения и ветеринарии многих стран
Вспышки сибирской язвы у животных и людей связаны с существованием стойких почвенных очагов, в которых споры возбудителя, обладая высокой устойчивостью во внешней среде, способны сохраняться десятилетиями (Соркин ЮИ, Родзиковский А.В, 1997, Ипатенко НГ, Выдрин ВН, 1998, Бакулов И А с соавт, 2000, Hauwaert Th , 2002) На территории Российской Федерации зарегистрировано значительное количество почвенных очагов (Федотова Ю М , Уланова А Л , 1970, Жуков А Н с соавт, 2000, Еременко Е И с соавт, 2001) Ежегодно регистрируются случаи заболевания людей и животных сибирской язвой (Лебединская И С с соавт , 1974, Черкасский Б Л , 2002, Онищенко Г Г , 2003).
Стационарность почвенных очагов связана не только со стойкостью спор, но и с накоплением микроба за счет вегетации (Буравцева Н П с соавт, 1983, Завирюха А И , 1990)
Со времен второй мировой войны В anthracis считался наиболее вероятным агентом бактериологического оружия События 2001 года в США служат подтверждением возможности использования спор возбудителя сибирской язвы как орудия биотерроризма (Жуков А Н с соавт , 2000, Черкасский Б Л , 2002, Perkins В, 2003)
Бактериологические методы считаются основными при диагностике сибирской язвы и идентификации возбудителя заболевания (Буравцева Н П с соавт, 1983, Маринин Л И с соавт, 1999) Однако они не всегда могут быть использованы, что обусловливает необходимость применения иммунологических и других методов Видоспецифические методы иммунологической диагностики сибирской язвы и идентификации возбудителя этого заболевания в настоящее
время разработаны недостаточно, в связи с известной антигенной схожестью сибиреязвенного микроорганизма с близкородственными сапрофитами
Использование сывороток к вегетативным клеткам или спорам как основы для получения диагностических препаратов оказалось малоперспективным из-за низкой видоспецифичности
Возможности идентификации возбудителя сибирской язвы значительно возросли в связи с получением монорецепторных сывороток и в частности с получением сывороток или моноклональных антител к белкам S - слоя С этой целью чаще всего применяли экстракты вегетативных клеток авирулентных штаммов В anthraas (Ezzell J , Abschire T , 1988, Ezzell J et al, 1990, Безносое MB, 1997, De BKet al, 2002, Свешников П.Г с соавт, 2004) Результаты исследований свидетельствуют о возможности использования антигенов культуральных фильтратов В anthracis для разработки видоспецифических диагностикумов Так, из культурального фильтрата В anthracis СТИ при разделении на сефакриле S - 300 был выделен белок, который элюировался в свободном объеме Сыворотка к этому белку позволяла дифференцировать В anthracis от близкородственных сапрофитов Однако его выход был незначительным, что затрудняло препаративное накопление (Евтеева Е В, 2003)
В связи с изложенным, представлялось перспективным исследование антигенов В anthracis с учетом поиска штаммов - продуцентов и новых подходов к выделению белков этого микроорганизма
Цель исследования — антигенный анализ и идентификация отдельных белков, продуцируемых авирулентными штаммами В anthracis, и определение их роли в иммунодиагностике сибирской язвы
Задачи исследования:
1 Выделить и сравнить антигенные свойства белков, которые элюируются
в свободном объеме (фракция 1) при разделении на сефакриле S - 300 культу
ральных фильтратов авирулентных штаммов В anthracis СТИ (рХ01+, рХ02),
Davies (рХОГ, рХ02"), 81/lTR(pXOr, рХ02")
-
Установить принадлежность выделенных белков к антигенам S - слоя В anthracis
-
Определить видоспецифические свойства сывороток к фракциям 1 культуральных фильтратов авирулентных штаммов В anthracis
4 Оценить возможности МФА и ТИФМ с антигенами S - слоя и
сыворотками к ним для иммунодиагностики сибирской язвы
Научная новизна:
-
Впервые в сравнительном аспекте исследованы антигенные свойства культуральных фильтратов штаммов В anthracis СТИ (рХО]+, рХ02'), Davies (рХОГ, рХ02+), 81/lTR(pX01", рХ02") и белков, которые элюировались в свободном объеме (фракция 1) при разделении культуральных фильтратов на сефакриле S — 300 Установлено, что антигенный спектр культуральных фильтратов обусловлен межштаммовыми различиями В anthracis, одним из которых может быть содержание в штамме плазмид вирулентности
-
Впервые селекционирован и охарактеризован бесплазмидный штамм В anthracis 81/1TR, использование которого позволяет выделять из культуралыюго фильтрата белок S - слоя в препаративном количестве Новизна исследования подтверждена патентом на изобретение № 2230570 от 4 ноября 2002г
3 Впервые установлено, что белки, которые элюировались в свободном
объеме (фракция 1) при разделении культуральных фильтратов штаммов
В anthracis СТИ и 81/1TR на сефакриле S - 300, не идентичны по антигенным
свойствам и относятся к белкам S - слоя сибиреязвенного микроба
-
Иммуноглобулины сывороток к фракциям 1, выделенным соответственно из культуральных фильтратов токсинпродуцирующего штамма В anthracis СТИ и бесплазмидного штамма В anthracis 81/1 TR, позволяют дифференцировать вегетативные клетки и споры В anthracis от близкородственных сапрофи-тов в методе флуоресцирующих антител, а также в реакции иммунодиффузии с растущими культурами
-
С помощью ТИФМ установлено наличие антител к антигенам S - слоя, наряду с антителами к протективному антигену, в сыворотках выживших после заражения В anthracis животных и больных сибирской язвой людей, что свидетельствует о целесообразности использования антигенов S - слоя для диагностики сибирской язвы
Практическая значимость
На основании проведенных исследований разработаны, одобрены ученым советом, утверждены директором Волгоградского научно-исследовательского противочумного института
«Методические рекомендации по выделению гсльхроматографией отдельных внеклеточных антигенов Bacillus anthracis» (протокол № 14, от 28 12 2001г) Приоритетность способа защищена патентом №2230570 от 4 11 2002г «Способ выделения высокомолекулярного соматического антигена»
Практическое значение имеет полученный результат по выживанию в течение 35 суток (срок наблюдения) морских свинок, которым перед заражением вводили неполный адъювант Фрейнда Эта модель может быть использована для получения сывороток к антигенам вирулентного штамма Bacillus anthracis и изучения факторов неспецифической резистентности при сибирской язве Приоритетность способа защищена патентом на изобретение №2252031 от 24 09 2003г «Способ получения иммунной сыворотки к антигенам вирулентного штамма Bacillus anthracis »
«Инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных моноспецифических жидких для обнаружения и идентификации вегетативных и споровых форм В anthracis» (протокол № 1, 12 01 200бг)
Материалы диссертации включены в научно - исследовательские работы № Г Р 0120 0 407 953 «Разработка и изучение диагностических препаратов на основе моноклональных антител против антигенов спор сибирской язвы» (2004 - 2006г), № ГР 0120 0 600 850 «Серодиагностика сибирской язвы, сапа, мелоидоза и туляремии в условиях чрезвычайных ситуаций» (2005 - 2009г), в которых автор является исполнителем
Материалы диссертации включены в лекционный материал курсов при Волгоградском научно-исследовательском институте для постдипломной переподготовки и повышения квалификации врачей - бактериологов, биологов и лаборантов учреждений санитарно-эпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий по вопросам специфической индикации, лабораторной диагностики особо опасных заболеваний и противодействию биотерроризму
Положения, выносимые на зашиту:
1 Штаммы В anthracis СТИ, Davies, 81/1TR при выращивании в R - сре
де, обогащенной казаминовыми кислотами, различаются по продукции отдель
ных белков токсинпродуцирующий штамм В anthracis СТИ продуцирует пре
имущественно протективный антиген и в меньшей мере белки S - слоя, бес-
плазмидный штамм В anthracis 81/1TR и капсулообразующий штамм
В anthracis Davies продуцируют главным образом белки S - слоя
2 Сыворотки к белкам, которые элюируются в свободном объеме
(фракция 1) при разделении культуральных фильтратов В anthracis СТИ и
В anthracis 81/1TR на сефакриле S - 300, содержат антитела к различным анти
генам S - слоя Эти сыворотки сходны по видоспецифическим свойствам, они в
отличие от сыворотки к фракции 1 капсулообразующего штамма В anthracis Davies не содержат антител к антигенам близкородственных микроорганизмов
-
Использование сыворотки к фракции 1 КФ В anthracis 81/1TR для идентификации в МФА В anthracis целесообразно в связи с ее видоспецифичностью и наличием штамма-продуцента {В anthracis 81/1TR), который позволяет накапливать, достаточно очищенный, антиген в препаративном количестве
-
В ТИФМ с сыворотками зараженных В anthracis морских свинок и больных сибирской язвой людей наряду с антителами к протиставному антигену содержатся антитела к антигенам S - слоя, что свидетельствует о целесообразности использования этих антигенов в диагностике сибирской язвы
Структура и объем диссертации
