Введение к работе
Актуальность исследования. Сибирская язва – особо опасное инфекционное заболевание, поражающее людей и восприимчивых животных. Потенциальная возможность заражения человека вирулентными штаммами Bacillus anthracis поддерживается периодически возникающими эпизоотиями болезни, а также существованием множественных почвенных очагов сибиреязвенной инфекции на территории многих стран, в том числе Российской Федерации – более 43 тысяч (Черкасский Б.Л., 2002). Кроме того, B. anthracis отнесен к категории А агентов биотерроризма (Онищенко Г.Г. с соавт., 2006).
Патогенность возбудителя сибирской язвы обусловлена синтезом капсулы и экзотоксина (Mock M., Fouet A., 2001). Токсин B. anthracis состоит из трех компонентов: отечного фактора (ОФ), летального фактора (ЛФ) и протективного антигена (ПА). Участвуя в реализации вирулентных свойств, ПА в то же время является основным иммуногеном сибиреязвенного микроба.
Эффективной превентивной мерой в отношении сибирской язвы является вакцинация населения групп риска и сельскохозяйственных животных. В России для профилактики сибирской язвы у людей лицензированы две вакцины - сибиреязвенная живая сухая для накожного и скарификационного применения и сибиреязвенная комбинированная - жидкая и сухая для подкожного применения. Комбинированная вакцина состоит из клеток вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 и полученного из него препарата ПА (Пименов Е.В. с соавт., 2002). В США и Великобритании для вакцинопрофилактики людей с начала 50-х годов ХХ века производятся химические вакцины, основой которых является адсорбированный на гидроокиси алюминия ПА, выделенный из культуральных фильтратов некапсулообразующих сибиреязвенных штаммов. Однако получение иммуногенного антигена из природных или аттенуированных штаммов B. anthracis проблематично ввиду трудностей хроматографического разделения компонентов токсина, имеющих близкие значения молекулярных масс. Наличие в химических сибиреязвенных вакцинах ненормированных примесей ОФ и ЛФ приводит к возникновению, примерно в 20 % случаев, побочных эффектов различной степени выраженности (Centers for disease control and prevention, 2000).
Для вакцинации людей предпочтительнее использовать ПА, получаемый из генно-инженерных штаммов с клонированным геном pag, кодирующим его синтез. За рубежом разработаны эффективные генно-инженерные продуценты ПА (Baillie L. et al., 1998; Cohen S. et al., 2000; Chauhan V. et al., 2001). На основе синтезируемого ими иммуногенного белка разрабатываются усовершенствованные химические вакцины, некоторые из них в настоящее время проходят клинические испытания (Campbell J. et al., 2007; Brown B. et al., 2010; www. clinicaltrials. gov).
В лаборатории прикладной генетики РосНИПЧИ «Микроб» был сконструирован аспорогенный штамм B. anthracis 55ТПА-1(Spo-), содержащий гибридную плазмиду с клонированной детерминантой синтеза ПА (Микшис Н.И., 2009). Использование его в качестве продуцента ПА позволяет создать технологию получения иммуногенного сибиреязвенного антигена без микробной контаминации лабораторных и производственных помещений и оборудования. Всестороннего исследования влияния синтезируемого штаммом ПА на макроорганизм не проводилось.
При разработке прототипов химических сибиреязвенных вакцин следует также учитывать иммуностимулирующее действие отдельных клеточных компонентов, например, белков S-слоя B. anthracis (Ariel N. et al., 2003; Baillie L. et al., 2003; Гончарова А.Ю., 2007).
Все вышеизложенное определяет актуальность диссертационной работы, целью которой является оценка перспективности использования протективного антигена, синтезируемого генно-инженерным штаммом B. anthracis 55ТПА-1(Spo-), в качестве основного компонента химических сибиреязвенных вакцин.
Задачи исследования:
-
Изучить стабильность характерных свойств аспорогенного штамма B. anthracis 55ТПА-1(Spo-). Оптимизировать условия культивирования рекомбинантного продуцента для увеличения выхода протективного антигена сибиреязвенного микроба.
-
В экспериментах на лабораторных животных (кролики, морские свинки, мыши линии BALB/c) определить динамику титров специфических антител и индексы иммунитета для рекомбинантного протективного антигена, полученного из культурального фильтрата штамма B. anthracis 55ТПА1(Spo-). Сравнить иммунизирующую активность рекомбинантного протективного антигена и вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1.
-
При экспериментальной сибиреязвенной инфекции выявить иммуностимулирующее действие белка S-слоя B. anthracis - ЕА1. Исследовать влияние сибиреязвенных антигенов – рекомбинантного протективного антигена и ЕА1, на экспрессию толл-подобных рецепторов.
-
Оценить реактогенность и токсичность препаратов, содержащих рекомбинантный протективный антиген, в экспериментах in vivo и in vitro.
-
Определить компонентный состав прототипов химических сибиреязвенных вакцин, подобрать оптимальные дозы и схемы введения лабораторным животным.
Научная новизна исследования. Впервые установлено, что оптимизация условий культивирования аспорогенного рекомбинантного штамма B. anthracis 55ТПА-1(Spo-) – добавление в бульон Хоттингера триптона в концентрации 20 мг/мл и сокращение продолжительности выращивания с 24 часов до 16 часов, приводит к увеличению в 5 раз выхода протективного антигена. В экспериментально подобранных условиях штамм B. anthracis 55ТПА-1(Spo-) синтезирует в 20 раз больше протективного антигена, чем вакцинный штамм B. anthracis СТИ-1.
Впервые осуществлено сравнение иммунизирующей активности вакцинного штамма возбудителя сибирской язвы B. anthracis СТИ-1 и препарата протективного антигена, полученного из аспорогенного генно-инженерного продуцента B. anthracis 55ТПА-1(Spo-). Установлено, что продукция анти-ПА антител при двукратном введении биомоделям рекомбинантного протективного антигена характеризуется более высокими титрами, с превышением значений до 30 раз - для линейных мышей и морских свинок, и до 20 раз – для кроликов. На модели кроликов максимальные титры анти-ПА антител регистрировались через 1 месяц после последней инъекции препарата рекомбинантного протективного антигена, у морских свинок и линейных мышей - через 2,5 и 2 месяца, соответственно.
Двукратная иммунизация биомоделей препаратом очищенного протективного антигена в сочетании с адъювантом обеспечивает защиту от заражения тест-штаммом B. anthracis 71/12, сопоставимую с протективностью живой сибиреязвенной вакцины B. anthracis СТИ-1. На модели мышей линии BALB/c значения ЛД50 тест-заражающего штамма для интактных и иммунизированных рекомбинантным протективным антигеном животных различались на два порядка, в экспериментах на морских свинках – на четыре порядка. Индексы иммунитета препарата рекомбинантного протективного антигена и вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 сопоставимы.
Впервые установлено, что добавление к рекомбинантному протективному антигену очищенного протеина S-слоя сибиреязвенного микроба - ЕА1, приводит к повышению в 2,5 раза индекса иммунитета на модели линейных мышей.
Препараты рекомбинантного протективного антигена и ЕА1 не токсичны и не оказывают повреждающего действия на тимоциты и спленоциты лабораторных животных. Введение линейным мышам сибиреязвенных антигенов, рекомбинантного протективного антигена и ЕА1, достоверно увеличивает экспрессию толл-подобных рецепторов 2 и 6 типа.
Впервые получены данные, свидетельствующие о перспективности использования препарата рекомбинантного протективного антигена для бустерной иммунизации с целью уменьшения на порядок вводимой дозы живой сибиреязвенной вакцины.
Практическая значимость. По материалам диссертации составлены методические рекомендации: «Технологии выделения и очистки рекомбинантного протективного антигена и белка S-слоя (ЕА1) сибиреязвенного микроба», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (протокол Ученого совета РосНИПЧИ "Микроб" № 7 от 22.12.2011 г.); «Определение экспрессии генов Toll-подобных рецепторов 2 и 4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей и экспериментальных животных», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (протокол Ученого совета РосНИПЧИ "Микроб" № 7 от 16.12.2010 г.).
Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах первичной специализации и повышения квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб» и биотехнологическом факультете Саратовского государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Аспорогенный рекомбинантный штамм B. anthracis 55ТПА1(Spo-) синтезирует 640 мкг/мл протективного антигена при выращивании в течение 16 часов в жидкой питательной среде (бульон Хоттингера), содержащей триптон в концентрации 20 мг/мл. В оптимизированных условиях культивирования продукция протективного антигена генно-инженерным штаммом B. anthracis 55ТПА-1(Spo-) и вакцинным штаммом B. anthracis СТИ-1 различается в 20 раз. Более высокая продукция протективного антигена рекомбинантным штаммом является следствием отсутствия негативного регулятора синтеза протективного антигена pagR и увеличения числа копий кодирующего гена pag за счет мультикопийности векторной плазмиды.
-
Протективный антиген, синтезируемый аспорогенным генно-инженерным штаммом B. anthracis 55DТПА-1(Spo-), эффективно защищает лабораторных животных при экспериментальном моделировании сибиреязвенного инфекционного процесса. Показатели ЛД50 тест-заражающего штамма для морских свинок, двукратно иммунизированных дозой 25 мкг рекомбинантного протективного антигена в сочетании с адъювантом, и интактных особей, различаются на четыре порядка. Индексы иммунитета рекомбинантного протективного антигена при двукратной иммунизации морских свинок (дозой 25 мкг) и мышей линии BALB/c (дозой 10 мкг) сопоставимы с индексами иммунитета живой вакцины B. anthracis СТИ-1 для тех же биомоделей.
-
Препарат протективного антигена, полученный из аспорогенного продуцента B. anthracis 55DТПА-1(Spo-), индуцирует выраженное образование анти-ПА антител при двукратном подкожном введении кроликам, морским свинкам и мышам линии BALB/c. На протяжении всего срока наблюдения (до 4,5 месяцев) у биомоделей отмечается более высокий уровень синтеза специфических антител, чем при однократном введении споровой культуры вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1.
-
В комбинированной схеме специфической профилактики сибиреязвенной инфекции, включающей однократную инъекцию споровой культуры штамма B. anthracis СТИ-1 и последующее однократное введение рекомбинантного протективного антигена в сочетании с адъювантом, доза вакцинного штамма снижается на порядок (с 5 107 спор до 5 106 спор для морских свинок).
-
Очищенный препарат протективного антигена, выделенный из культурального фильтрата аспорогенного рекомбинантного штамма-продуцента B. anthracis 55DТПА-1(Spo-), не обладает реактогенностью и токсичностью для линейных мышей и морских свинок. В тестируемой дозе 10 мкг он не оказывает повреждающего действия на тимоциты и спленоциты мышей линии BALB/c и не изменяет их пролиферативную активность. Введение лабораторным животным препаратов, содержащих рекомбинантный протективный антиген и белок S-слоя сибиреязвенного микроба (ЕА1), приводит к достоверному усилению экспрессии толл-подобных рецепторов врожденного иммунитета 2 и 6 типов на клетках селезенки и тимуса.
Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008); научно-практических школах-конференциях молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010, 2011); Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010); X Межгосударственной научно-практической конференции государств – участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств - участников СНГ» (Ставрополь, 2010); Х съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2012), а также на ежегодных научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов, 2009-2012).
Работа выполнена в рамках плановой НИР "Конструирование современных средств специфической профилактики и иммунодиагностики сибирской язвы" (2009 - 2013 гг.), шифр 41-3-09; Федеральной целевой программы "Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации", темы: "Совершенствование специфической профилактики чумы, сибирской язвы и туляремии".
Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, из них - 4 статьи в рекомендованных ВАК изданиях.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 31 отечественный и 171 зарубежный источник. Общий объем диссертации составляет 140 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 5 таблицами и 22 рисунками.
