Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
В. anthracis - возбудитель сибирской язвы 14
Сибиреязвенный токсин - структура, механизм действия, функции и генетическая детерминация 17
Вьщеление протективного антигена из культуральных фильтратов аттенуированных и рекомбинантных штаммов и его практическое использование 24
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3 8
Штаммы микроорганизмов, бактериофаги и плазмиды, использованные в работе 38
Питательные среды, реактивы и лабораторные животные 39
Методы исследования 40
Определение видовых признаков В. anthracis 40
Определение протеолитической активности штаммов В. anthracis 40
Определение способности сибиреязвенных культур к споруляции 41
Определение стабильности свойства аспорогенности 41
Приготовление споровой взвеси 42
Определение ЛД5о штаммов В. anthracis для лабораторных животных 42
Определение протективных свойств рекомбинантного протективного антигена 42
Трансформация штаммов В. anthracis 43
Выделение плазмидных ДНК штаммов В. anthracis 43
Определение стабильности гибридных плазмид in vitro 43
Метод полимеразной цепной реакции 44
Исследование белкового состава культуральных фильтратов 44
Выделение и очистка протективного антигена из культу-рального фильтрата рекомбинантного штамма Б. anthracis 46
Определение концентрации белка в препаратах 47
Получение иммунных сывороток и специфических антител к протективному антигену 47
Реакция радиальной диффузной преципитации на среде
с анти-ПА антителами 4 7
Постановка иммуноблот анализа с поликлональными антителами к протективному антигену 48
Постановка дот-иммуноанализа с поликлональными антителами к протективному антигену 49
Твердофазный иммуноферментный анализ 49
Количественная оценка продукции протективного антигена рекомбинантными и вакцинными штаммами В. anthracis 50
2.3.21. Статистические методы 50
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ АСПОРОГЕННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО
ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА СИБИ
РЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА 51
Генетическое конструирование аспорогенного штамма-продуцента протективного антигена 54
Стабильность репликации гибридной плазмиды pUBl 10РА-1 в аспорогенных трансформантах 61
Определение уровней продукции протективного антигена аспорогенными и спорообразующими клонами с pUBHOPA-1 64
3.4. Изучение стабильности биологических свойств аспороген-
ного штамма-продуцента протективного антигена при
пассировании на питательных средах и хранении 73
ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА ИЗ КУЛЬ-
ТУРАЛЬНОГО ФИЛЬТРАТА РЕКОМБИНАНТНОГО АСПОРОГЕН-
НОГО ШТАММА В. ANTHRACIS И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ОЧИ
СТКА ПРЕПАРАТА 77
Оптимизация условий культивирования аспорогенного продуцента протективного антигена 77
Разработка экспериментальной схемы выделения и очистки протективного антигена из культурального фильтрата рекомбинантного штамма 80
ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВА
НИЕ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ СКОНСТ
РУИРОВАННОГО ПРОДУЦЕНТА В. ANTHRACIS 55АТПА-1 (SPO~) 88
Характеристика препарата протективного антигена, выделенного из культурального фильтрата аспорогенного рекомбинантного продуцента 88
Получение специфичных антител к рекомбинантному про-тективному антигену 90
Использование рекомбинантного протективного антигена
и антител к нему в иммунохимических реакциях 91
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 98
ВЫВОДЫ 109
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 111
Введение к работе
Актуальность исследования. Сибирская язва - особо опасное зооантро-понозное заболевание. Возбудителем инфекции является грамположительный спорообразующий микроорганизм - Bacillus anthracis, принадлежащий к роду Bacillus, семейству Bacillaceae, отряду Enterobacteriales. Вследствие чрезвычайной резистентности к воздействию повреждающих факторов, споровые формы бактерий способны длительно сохраняться в объектах внешней среды. При попадании в организм человека или восприимчивого животного споры В. anthracis прорастают и инициируют развитие инфекционного процесса.
В реализации патогенного действия сибиреязвенного микроба ключевая роль отводится полиглютаминовой капсуле и бифункциональнуму экзотоксину. Капсула защищает бактериальные клетки от фагоцитоза, способствуя их размножению и накоплению в организме хозяина. Экзотоксин, состоящий из про-тективного антигена (ПА), отечного (ОФ) и летального (ЛФ) факторов, запускает основные звенья патогенеза сибиреязвенной инфекции. При взаимодействии протеолитически активированного ПА с ОФ и ЛФ образуются токсичные комплексы, оказывающие повреждающее действие на клетки макроорганизма (Lep-pla S., 1991; Singh Y. et al., 1989).
Ежегодно практически во всех регионах мира регистрируются многочисленные случаи сибиреязвенной инфекции. Эпидемическая обстановка по сибирской язве находится в зависимости от эпизоотической ситуации (Бургасов П.Н., 1984). Заражение человека происходит обычно при контакте с заболевшими животными или инфицированными продуктами и сырьем животного происхождения. К увеличению эпидемических проявлений может привести расширение но-зоареала патогенного микроорганизма, ухудшение ветеринарного контроля за скотомогильниками и сельскохозяйственным сырьем, снижение масштабов иммунизации сельскохозяйственных животных и населения групп риска (Черкасский Б.Л. с соавт., 2002). Кроме того, необходимо помнить о трагичном опыте и возможности использования сибиреязвенного микроба в качестве биологического агента для совершения террористических актов и создания оружия массо-
вого поражения (Spencer R., Wilcox M., 1993; Jernigan J. et al., 2001; Bush L. et al., 2001; Spencer R., LightfootN., 2001; Brachman P., 2002).
В системе профилактических мероприятий, направленных на поддержание эпидемического благополучия по сибирской язве, особое место отводится вакцинации сельскохозяйственных животных и людей, относящихся к группам риска заражения. В настоящее время используют живые, химические и комбинированные сибиреязвенные вакцины. Основными достоинствами живых вакцин является напряженность и продолжительность создаваемого ими иммунитета. К существенным недостаткам можно отнести реактогенность, проявляющуюся в возникновении поствакцинальных осложнений.
За синтез и регуляцию компонентов экзотоксина отвечают гены, входящие в состав плазмиды pXOl (182 т.п.н.). Образование капсулы кодируют детерминанты, расположенные на внехромосомном репликоне рХ02 (93,5 т.п.н.) (Mikesell P. et al., 1983; Uchida I. et al., 1985; Okinaka R. et al., 1999). Вакцинные штаммы, лицензированные для использования в медицине (В. anthracis СТИ-1) или ветеринарии (В. anthracis Sterne34F2, В. anthracis 55), в процессе аттенуации утратили плазмиду рХ02. Результатом элиминации рХ02 стало резкое снижение их вирулентности. Чувствительные к фагоцитозу микробные клетки неспособны реализовать свое патогенное действие. Иммуногенность вакцинных штаммов обеспечивается, главным образом, протективным антигеном (ПА) -одним из компонентов экзотоксина. На основе ПА в середине прошлого столетия ученые разработали химическую вакцину для иммунопрофилактики людей (Wright G.etal., 1954).
В производстве лицензированных бесклеточных препаратов продуцентами ПА служат аттенуированные штаммы В. anthracis. В специальных условиях выращивания они экскретируют сибиреязвенный токсин. Для очистки его им-муногенной составляющей отечественными и зарубежными авторами предлагались методические приемы с использованием различных видов хроматографии: ионообменной (Александров Н.И. с соавт., 1963 (а,б); Дербин М.И. с соавт., 1976, 1977; Абалакин В.А. с соавт., 1992; Безносов М.В., 1997; Wright G. et al.,
1954; Leppla S., 1988); иммуносорбентной (Larson D. et al., 1988); комбинации ионообменной хроматографии и гель-фильтрации (Барков A.M. с соавт., 2000); того же сочетания, но с добавлением хроматографии гидрофобного взаимодействия (Quinn С. et al., 1988).
Опыт выделения ПА из культуральных фильтратов аттенуированных штаммов В. anthracis показал, что полного разделения компонентов сибиреязвенного токсина, имеющих лишь небольшие отличия в значениях молекулярных масс (ПА - 83 кДа, ОФ - 89 кДа, ЛФ - 85 кДа), достигнуть практически невозможно. Данное обстоятельство неблагоприятно сказывается на свойствах выпускаемых в настоящее время химических вакцин. По данным медицинских наблюдений в США у 30 % людей, вакцинированных против сибирской язвы, наблюдаются локальные реакции в виде аллергических проявлений или даже некроза тканей (Swanson-Biearman В., Krenzelok Е., 2001). Токсическое действие бесклеточных препаратов связывают, прежде всего, с содержанием в них примесей ОФ и ЛФ, а также некоторых других продуктов жизнедеятельности клеток. Еще одной проблемой промышленного получения ПА является его выраженная деградация на этапах выделения и очистки, что связано с высокой активностью протеолитических ферментов большинства культур В. anthracis.
С развитием генно-инженерных технологий стало возможным получение рекомбинантных штаммов, продуцирующих только один компонент токсина -ПА. Известно много прецедентов клонирования детерминанты синтеза ПА (pag) в штаммах различных видов бактерий, а также в геномах вирусов и трансгенных растений (Тедиков В.М., Добрица А.П., 1993; Алимов А.П., Павлов В.М., 1995; Дармов И.В. с соавт., 1999; Vodkin М., Leppla S., 1983; Ivins В., Welkos S., 1986; Iacono-Connors L. et al., 1991; Coulson N. et al., 1994; Baillie L. et al., 1998; Zegers N. et al., 1999; Barnard J., Friedlander A., 1999; Gupta P. et al, 1999; Cohen S. et al., 2000; Chauhan V. et al., 2001; Garmory H. et al., 2003; Azhar A. et al., 2002; Hull A. et al., 2005; Chichester J. et al., 2007; Stokes M. et al., 2007). Однако далеко не во всех случаях авторам удалось добиться стабильного функционирования гибридных плазмид в гетерологичных системах. Проблематичным оказалось и достижение достаточно высокого уровня продукции ПА.
Ранее в лаборатории прикладной генетики РосШШЧИ "Микроб" были созданы генно-инженерные штаммы, продуцирующие ПА (Микшис Н.И. с со-авт., 2007). Посредством встраивания участка pXOl, содержащего ген pag, детерминирующий синтез ПА сибиреязвенного микроба, в мультикопийный вектор pUBllO по сайтам рестрикции BamHl бьша сконструирована гибридная плазмида pUB 11ОРА и селектирован ее делеционный вариант pUB 11 OP А-1. Плазмида pUB110PA-l стабильно функционировала в геномах бациллярных штаммов В. anhtracis СТИАТ, В. anthracis 55АТ и В. subtilis WB600, обеспечивая продукцию ПА на уровне до 100 мкг/мл, что в несколько раз превышает секретируемый синтез данного белкового продукта, зарегистрированный для вакцинных штаммов В. anthracis.
С позиций биологической и экологической безопасности в промышленном производстве химических сибиреязвенных вакцин предпочтительнее использование штаммов-продуцентов, не образующих спор. Анализируя отечественный и зарубежный опыт создания бациллярных продуцентов ПА, выявили лишь единичные случаи получения их аспорогенных вариантов. Самой перспективной оказалась конструкция на основе рекомбинантного штамма В. anthracis ASterne-l(pPA102) (Worsham P., Sowers M., 1999). Хотя селектированный в его популяции спонтанный аспорогенный мутант отличался выраженной про-теолитической активностью, добиться приемлемого выхода очищенного ПА (20 -30 мкг/мл) удалось за счет коррекции условий его культивирования (Farchaus J. et al., 1998). В США зарегистрирован патент на метод приготовления химической вакцины на основе ПА, продуцируемого аспорогенным штаммом В. anthracis ASteme-l(pPA102)CR4 (Ivins В. et al., 2002). Отечественных аналогов продуцентов для безопасной и экологичной технологии выделения ПА не существует.
Все вышеизложенное определяет актуальность планируемой диссертационной работы,
целью которой является: получение стабильного аспорогенного рекомби-нантного штамма В. anthracis и оценка его в качестве продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба.
Задачи исследования:
Получить рекомбинантный штамм с клонированным геном pag, являющийся продуцентом протективного антигена сибиреязвенного микроба и характеризующийся отсутствием способности к образованию спор.
Оценить стабильность биологических свойств аспорогенного ре-комбинантного штамма-продуцента в условиях хранения и при культивировании на питательных средах.
Провести оценку уровня продукции протективного антигена сконструированного штамма, сравнить с уровнями продукции вакцинных культур.
Оптимизировать условия культивирования аспорогенного рекомби-нантного штамма, разработать экспериментальную схему выделения и хромато-графической очистки протективного антигена из его культурального фильтрата.
Получить высокоочищенный препарат рекомбинантного протективного антигена, осуществить его биохимическую и иммунохимическую характеристику.
В экспериментах in vivo показать перспективность использования рекомбинантного протективного антигена в создании профилактических сибиреязвенных препаратов.
Получить поликлональные антитела к рекомбинантному ПА и оценить возможность их применения для постановки иммунохимических реакций.
Научная новизна исследования:
Впервые на основе бесплазмидного производного отечественного вакцинного штамма В. anthracis 55 получен аспорогенный рекомбинантный продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба. Штамм стабильно наследует гибридный репликон pUB110PA-l и не реверсирует к спорообразую-щему фенотипу.
Сконструированный штамм не содержит гены, детерминирующие синтез факторов вирулентности В. antlwacis, и характеризуется низкой активностью
протеолитических ферментов. Перспективы его использования в качестве продуцента протективного антигена связаны с отсутствием риска контаминации помещений и оборудования спорами В. anthracis.
Аспорогенный бациллярный штамм с клонированным геном pag - В. anthracis 55ATIIA-l(Spo"), продуцирует в 4 раза больше протективного антигена, чем вакцинный штамм В. anthracis 55.
Биологические характеристики протективного антигена, синтезируемого штаммом В. anthracis 55ATnA-l(Spo"), позволяют предложить его в качестве основного компонента современных химических и комбинированных сибиреязвенных вакцин. Установлено, что двукратная иммунизация кроликов дозой 50 мкг очищенного препарата протективного антигена, выделенного из аспоро-геннного рекомбинантного штамма В. anthracis 55ATiTA-l(Spo"), обеспечивает защиту 100 % животных от заражения 50 ЛД5о высоковирулентного штамма В. anthracis 81/1.
Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом Российской Федерации на изобретение: № 2321629 - аспорогенный рекомбинантный штамм В. anthracis 55ATIIA-l(Spo")(pUB110PA-l) -продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба.
Практическая ценность и формы внедрения:
В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирован рекомбинантный штамм - В. anthracis 55ATTIA-l(Spo") (КМ97) - стабильный аспорогенный продуцент протективного антигена возбудителя сибирской язвы.
Штамм и иммунные сыворотки к ПА использовались при выполнении генетических, молекулярно-генетических, молекулярно-биологических, биохимических и других исследований по плановым НИР: "Конструирование рекомби-нантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин" (№ Гос. регистрации 0.1.200.208130, 2002 -2004 гг.), «Использование препаратов протективного антигена и белков S-слоя для создания средств диагностики и профилактики сибирской язвы» (№ Гос.
регистрации 0120.0 603179, 2006-2008 гг.), а также в совместных исследованиях с отделом профилактических препаратов РосНИПЧИ "Микроб".
По материалам диссертации составлены методические рекомендации "Комплекс методических подходов к определению продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба", одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (протокол Учг-ного совета РосНИПЧИ "Микроб" №2 от 17.04.06 г.)
Материалы диссертации используются в лекциях по генетике бактерий на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов при РосНИПЧИ «Микроб» и биотехнологическом факультете Саратовского Государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова.
Основные положения, выносимые на защиту:
Получен аспорогенный рекомбинантный продуцент протективного антигена - В. anthracis 55ATTIA-l(Spo"). При пассировании in vitro штамм сохраняет свойство аспорогенности и способность к репликации гибридной плазми-ды. Рекомбинантный штамм содержат структурный ген pag в составе гибридного репликона pUB110PA-l и не содержат детерминанты, кодирующие синтез основных факторов патогенности возбудителя сибирской язвы.
Уровень продукции протективного антигена аспорогенным генно-инженерным штаммом составляет около 80 мкг/мл, что в 4 - 5 раз больше значений, установленных для вакцинных штаммов В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55.
Из сконструированного штамма В. anthracis 55ATnA-l(Spo") выделен белковый препарат, на основании биохимических, иммунохимических и иммунологических характеристик являющийся протективным антигеном сибиреязвенного микроба. Получены поликлональные антитела к рекомбинантному про-тективному антигену, перспективные для осуществления диагностических исследований.
Протективный антиген, синтезируемый аспорогенным рекомбинант-ным продуцентом, является биологически активным. Двукратная иммунизация
дозой 50 мкг очищенного рекомбинантного продукта обеспечивает защиту 100 % кроликов от заражения 50 ЛД5о высоковирулентного штамма возбудителя сибирской язвы.
Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология -XXI век» (Саратов, 2004); Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005); VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безо-пастности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); Российском медицинском форуме "Фундаментальная наука и практика" (Москва, 2006 г.); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); Межгосударственной научно-практической конференции «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007), а также на научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов, 2005-2008).
Публикации. Основное содержание работы отражено в 12 научных публикациях, из них - 1 статья в рекомендованных ВАК изданиях, 1 патент и 10 тезисов, в том числе 6 тезисов в сборниках международных и Российских конференций.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 39 отечественных и 95 зарубежных источников. Общий объем диссертации составляет 124 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 5 таблицами и 18 рисунками.
