Введение к работе
Акіуальносіь проблемы
Существование на территории Российской Федерации многочисленных стойких природных очагов туляремии определяет напряженность эпидемиологической обстановки в ряде административных территорий страны, где ежегодно регистрируются заболевания этой инфекцией (Они-щенко Г.Г. и др., 1999). Кроме того, возбудитель туляремии обладает рядом особенностей, обеспечивающих высокую возможность использования его в качестве потенциального средства биотерроризма (Ellis J. et al., 2002; Granow R., Finke E.J., 2002; Navas E., 2002). В связи со сказанным остаются актуальными исследования, направленные на усовершенствование методов диагностики туляремии, конструирование новых диагностических тест-систем, обеспечивающих специфичность, достаточно высокую чувствительность и в то же время технологичность изготовления, доступность ингредиентов, простоту постановки реакции, оперативность получения результатов и их информативность. Актуальным является и разработка новых эффективных и безопасных субъединичных вакцин, пригодных для специфической профилактики туляремии, поскольку используемая в настоящее время живая вакцина не лишена недостатков (ДзагуроваС.Г., РезеповаФ.Ф., 1975; Козловский В.Н., 1997; Салтыков Р. А, 1976; Tarnvik A., Berglund L., 2003). Это вызывает необходимость углубленного изучения иммунобиологических свойств антигенных струк-туриотдельнькантигеноввозбудзтгелятуляремииігайсие//аґм/агей5'м.
Несмотря на большое внимание, уделяемое исследованиям механизмов патогенности и иммуногенности возбудителя туляремии, многие вопросы изучения антигенной структуры туляремийного микроба остаются до конца невыясненными. В частности предстоит еще решить, какие антигены, в каком виде и соотношении должны входить в состав эффективных молекулярных вакцин. Наибольший интерес в этом аспекте вызывают поверхностные структуры бактериальной клетки, которые выполняют важнейшие функции во взаимодействии с иммунной системой хозяина, определяя характер специфического и неспецифического иммунного ответа (Бондаренко В.М., 1999; ЕзепчукЮ.В., 1985; Наумов АВ. и др., 1995; Павлович Н.В., 1993; Brown R.W. etal., 1988). Поэтому не удивительно, что при поиске субстанций, перспективных для диагностики или создания химических вакцин против туляремии, искомыми зачастую оказываются биомолекулы поверхностных структур бактериальных клеток (Анисимов П.И. идр., 1999; Хлебников B.C. и др., 1991,1994; FulopM. etal., 1996; Golovliov I.R. etal., 1991; KayhtyH., 1985; SjostedtA, 2003; SzostakM.P. etal., 1997).
Большие надежды возлагаются на использование изолированных липополисахаридов (ЛПС) и белков наружной мембраны (БНМ) как наиболее изученных поверхностных антигенов туляремийного микроба
для усовершенствования соответствующих профилактических (Хлебников B.C. и др., 1992) и диагностических препаратов (Мещерякова И.С, 1990; Viljanen М.К. et al., 1983). Важными моментами в этих исследованиях, безусловно, являются усовершенствование методов выделения, очистки, идентификации антигенов туляремийного микроба, позволяющих в максимальной степени сохранить их иммунохимическую специфичность и протективную активность. Особое внимание необходимо уделять подбору щадящих способов инактивации бактериальной массы с целью сохранения исходных свойств выделяемых антигенов, так как отмечено, что традиционные способы обеззараживания существенно влияют на их структуру и физико-химические свойства (Ефанова ЕА и др., 1991; Nutter J.E., 1971; SandstromG. etal., 1984). Все вышеизложенное определило цель и основные задачи настоящего исследования.
Цель работы:
Выделениеиочисткаантигеноввозбудителятуляремищхаракте-ристикаихфизико-химических,иммунобиологическихсвойствиоценка пригодностидляконструированиядиагностическихипрофилактических препаратов.
Основные задачи исследования
В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи диссертационной работы:
Получить экстракты антигенов, препараты клеточных стенок и ЛПС F. tularensis с использованием разных методов инактивации микробной массы.
Разработать новые способы выделения и очистки ЛПС туляремийного микроба, используя липофильные свойства антибиотика по-лимиксина В и детергентов Тритона Х-114 и Твина 80.
Изучить физико-химические, иммунохимические и биологические свойства полученных антигенов туляремийного микроба.
Оценить пригодность выделенных антигенов для конструирования диагностических тест-систем с целью обнаружения антигенов туляремийного микроба и антител к ним.
Научная новизна
Показана возможность инактивации и одновременной экстракции антигенов возбудителя туляремии с помощью растворов мочевины и катионного детергента цетавлона. Разработаны новые методы получения высокоочищенного препарата ЛПС туляремийного микроба с использованием иммобилизованного полимиксина В и неионных детергентов Твина 80 и Тритона Х-114. Новизна разработки подтверждена патентом РФ № 2051969.
Получены новые данные о наличии в составе туляремииного микроба гликопротеинов, углеводная часть которых обладает сродством к конканавалину А. С помощью аффинной хроматографии на Кон А-Сефарозе выделен препарат гликопротеинов туляремииного микроба, обладающий иммунохимической активностью с диагностической сывороткой. Дополнены новыми данными сведения о физико-химических свойствах ЛПС и белково-липополисахаридного комплекса туляремииного микроба: химическом составе, электрофоретических спектрах, метахроматическом эффекте, активности в тесте гелирования лизата амебоцитов Limulus polyphemus (IAL-тест), антигенных свойствах, протективной активности и токсичности.
Разработан вариант дот-иммуноанализа для обнаружения антигенов туляремииного микроба и антител к ним с использованием в качестве метки иммунореагентов частиц коллоидного серебра (Пат. РФ № 2203496).
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты проведенных исследований дополняют новыми научными данными сведения о поверхностных структурах и антигенах туляремииного микроба, позволяют глубже понять их роль в формировании иммунитета и синтезе антител. Теоретический аспект исследований представлен анализом возможных причин снижения иммуногенности антигенных структур бактериальных клеток при их изоляции и обоснованием важности способов обеззараживания бактерий для сохранения их протективной активности. Наряду с теоретическим интересом изучение иммунобиологических свойств клеточных оболочек и ЛПС имеет важное значение для разработки вопросов иммунодиагностики и профилактики туляремии.
Разработан и внедрен в практику комплекс методических приемов выделения, очистки, количественного анализа бактериальных ЛПС, получения диагностических сывороток и иммунохимических тест-систем. На основе экспериментальных данных составлены и одобрены Ученым советом Иркутского НИПЧИ «Методические рекомендации по очистке бактериальных ЛПС с использованием детергента Тритона X-114» (утверждены зам. пред. Госкомсанэпиднадзора РФ 17.03.96 г.), «Методические рекомендации по определению бактериальных липополиса-харидов колориметрическим методом» (утверждены Первым зам. Министра здравоохранения РФ 3.02.97 г.), «Методические рекомендации по приготовлению туляремииного антигенного эритроцитарного диагнос-тикума» (утверждены директором Иркутского НИПЧИ 3.03.97 г.), «Методические рекомендации по комплексному сероаллергическому исследованию на туляремию сывороток крови человека и животных» (утверждены Первым зам. Министра здравоохранения РФ 17.03.97 г.), «Методические рекомендации по определению функциональной активности лимфоцитов цитофлуориметрическим методом с использованием акри-
динового оранжевого» (утверждены зам. диреьстора по научной работе Иркутского НИПЧИ 22.03.99 г.), «Методические рекомендации по при-готовлениютест-системьідляобнаруженияантигеновігаисме//аґм/агеи5'м на основе специфических антител, меченных коллоидным серебром» (утверждены зам. директора по научной работе Иркутского НИПЧИ 14.03.03 г.), получено два патента на изобретения «Способ получения бактериальных липополисахаридов» (Пат. РФ № 2051969) и «Способ обнаружения антигенов туляремийного микроба» (Пат. РФ № 2203496).
Основные положения, выносимые на зашиту
Новые способы очистки туляремийного липополисахарида с использованием иммобилизованного полимиксина В и неионных детергентов Твина 80 и Тритона Х-114.
ЛПС туляремийного микроба при взаимодействии с карбоциа-ниновым красителем вызывает сдвиг максимума поглощения последнего в коротковолновую часть спектра (метахроматический эффект), что может быть использовано для количественного определения содержания ЛПС в различных антигенных препаратах.
Туляремийный микроб в своем составе содержит гликопротеи-новый комплекс, у которого углеводная составляющая его компонентов обладает сродством к конканавалину А.
Изготовление туляремийного антигенного эритроцитарного диагностикума с использованием неионного детергента Тритон Х-114 и разработка варианта дот-иммуноанализа для обнаружения антигенов туляремийного микроба с использованием в качестве метки иммуноглобулинов частиц коллоидного серебра.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены и представлены на Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы профилактики туляремии» (Симферополь, 1991); 2nd Conference of International Endotoxin Society (Vienna, Austria. 1992); научной конференции «Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней» (Омск, 1993); научно-практической конференции, посвященной 75-летию образования санитарной службы в Иркутской области (Иркутск, 1997); Международной научно-практической конференции «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы», посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкурганской противочумной станции (Талдыкурган, 2001 г.) и на научных конференциях Иркутского НИПЧИ (Иркутск, 1985-2004 гг.).
Материалы диссертации оформлены на основе двух научных отчетов по плановым темам НИР.
Публикации
Основные результаты диссертации опубликованы в 16 печатных работах и 2 патентах на изобретения.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Текст работы изложен на 169 страницах машинописного текста, иллюстрирован 13 таблицами, 17 рисунками. Список цитированной литературы содержит 145 отечественных и 152 иностранных источника.
