Введение к работе
Актуальность исследования
Bacillus anthracis – грам-положительный, спорообразующий микроорганизм, вызывающий опасное зооантропонозное инфекционное заболевание, поражающее восприимчивых животных и людей. Ежегодно практически во всех регионах мира регистрируются многочисленные случаи сибиреязвенной инфекции. Данные мониторинга за развитием эпидемической ситуации в России свидетельствуют о неуклонном росте неблагополучных по сибирской язве территорий (Онищенко Г.Г., 2008). Расширение нозоареала патогенного микроорганизма, способного длительно сохраняться и накапливаться в окружающей среде, может привести к увеличению эпидемических проявлений сибиреязвенной инфекции (Черкасский Б.Л. с соавт., 2002). Крупнейшая вспышка сибирской язвы в Зимбабве в 1978 – 1979 гг. охватила почти 10 тысяч человек и унесла около 450 жизней (Davies J., 1982, 1983, 1985). В России в период с 2003 по 2007 гг. было зарегистрировано 43 подтвержденных случая заболевания сибирской язвой людей, из них 3 - с летальным исходом (Государственный доклад, 2007; Онищенко Г.Г., 2008). Повышение уровня заболеваемости отмечалось в 2004 году - 16 случаев в 5 областях Российской Федерации (Ясинский А.А. с соавт., 2005).
Высокая патогенность сибиреязвенного микроба в сочетании с уникальной устойчивостью споровых форм к воздействию факторов внешней среды, ставят его в разряд крайне опасных биологических агентов, имеющих потенциальную угрозу применения в качестве оружия массового поражения (Spencer R., Wilcox M., 1993; Redmond C . et al., 1998; Spencer R., Lightfoot N., 2001). Осуществленная в 2001 году рассылка контаминированной спорами B. anthracis корреспонденции вызвала панику среди населения США и привела к гибели пяти человек от легочной формы заболевания (Jernigan J. et al., 2001; Bush L. et al., 2001; Brachman P., 2002).
В системе ветеринарных и медико-санитарных мер, направленных на обеспечение эпидемиологического благополучия по сибирской язве, центральное место принадлежит вакцинации сельскохозяйственных животных и людей. Наиболее длительный и напряженный иммунитет обеспечивают живые сибиреязвенные вакцины. Однократное подкожное введение одной дозы распространенной в мире ветеринарной вакцины B. anthracis Sterne 34F2 защищает животных от заражения возбудителем сибирской язвы в течение года (Turnbull P., 1991). В России живая вакцина на основе штамма B. anthracis СТИ-1 используется для профилактики сибирской язвы у людей. В практике ветеринарной медицины применяется штамм B. anthracis 55, полученный специалистами Всесоюзного научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии на основе природного бескапсульного изолята (Гаврилов В.А. с соавт., 1997). Существенным недостатком живых вакцин является относительно высокий уровень реактогенности (Turnbull P. et al., 1986; Ivins B. et al., 1990; Stepanov A. et al., 1996). Побочные эффекты связаны с воздействием на организм человека или животного токсичных продуктов жизнедеятельности вакцинных штаммов.
Рекомендованные для иммунопрофилактики живые вакцины получены в середине прошлого столетия классическими способами аттенуации вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы. В геноме B. anthracis присутствуют высокомолекулярные репликоны - pXO1 и pXO2 (Mikesell P. et al., 1983; Green B. et al., 1985; Uchida I. et al., 1985; Okinaka R. et al., 1999). В процессе аттенуации происходит элиминация плазмиды pXO2, детерминирующей синтез капсулы. В отсутствие капсулы сибиреязвенный микроб чувствителен к фагоцитозу и при попадании в макроорганизм не способен реализовать свой патогенный потенциал. Плазмида pXO1 содержит детерминанты, кодирующие синтез протективного антигена (ПА), отечного и летального факторов, входящих в состав экзотоксина бинарного действия. Отечный и летальный факторы, взаимодействуя с протеолитически активированным ПА, формируют токсичные комплексы, вызывающие структурные и функциональные изменения в восприимчивом организме (Leppla S., 1991). Вместе с тем, иммуногенный потенциал ПА сибиреязвенного микроба послужил основанием для создания на его основе химических вакцин.
Используемые в США и странах Западной Европы химические вакцины ввиду особенностей технологии получения их компонентов из аттенуированных культур B. anthracis, неизбежно содержат минимальные примеси отечного и летального факторов (Turnbull P. et al., 1991). Именно с данными продуктами связывают аллергические реакции, возникающие почти у 30 % вакцинированных в США людей (National communicable disease center, 1970; Swanson-Biearman B., Krenzelok E., 2001). Бесклеточные вакцины индуцируют выработку антител в высоких титрах и в ранние сроки, но для поддержания напряженного иммунитета необходимо проведение ревакцинаций.
В России для специфической профилактики сибирской язвы у людей и животных разработана также комбинированная вакцина, представляющая собой композицию спор вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 и бесклеточного препарата ПА адсорбированного на геле гидроокиси алюминия (Садовой Н.В. с соавт., 1998; Кожухов В.В. с соавт., 2002).
Достижения биологической и медицинской наук за последние несколько десятилетий изменили представления о средствах специфической профилактики инфекционных болезней. Развитие иммунологии, генетики и биохимии позволило приблизиться к разгадке тайн природы о клеточных и молекулярных механизмах взаимодействия макро- и микроорганизмов. В этих условиях аттенуированные штаммы утрачивают свою актуальность. В конструировании вакцин нового поколения на первый план выходят рекомбинантные технологии.
Кодирующий синтез ПА ген pag клонировали в штаммах различных бактериальных видов: Escherichia coli (Алимов А.П., Павлов В.М., 1995; Vodkin M., Leppla S., 1983; Gupta P. et al., 1999; Chauhan V. et al., 2001); B. subtilis (Тедиков В.М., Добрица А.П., 1993; Ivins B., Welkos S., 1986; Baillie L. et al., 1998(а)); B. anthracis (Barnard J., Friedlander A., 1999; Cohen S. et al., 2000); Francisella tularensis (Дармов И.В. с соавт., 1999); Salmonella typhimurium (Coulson N. et al., 1994; Garmory H. et al., 2003; Stokes M. et al., 2007) и Lactobacillus casei (Zegers N. еt al., 1999). В качестве экспрессирующих систем предлагались также вирусы (Iacono-Connors L. et al., 1991) и трансгенные растения (Azhar A. et al., 2002; Hull A. et al., 2005; Chichester J. et al., 2007). Однако далеко не во всех случаях удалось решить проблемы стабилизации гибридных молекул и оптимизации параметров экспрессии клонированных генов.
Отвечающие современным требованиям профилактические препараты должны разрабатываться с учетом всего арсенала накопленных знаний о структуре, свойствах, молекулярной природе, генетической детерминации, путях синтеза и регуляции факторов патогенности и иммуногенности инфекционного агента. Все вышеизложенное определяет актуальность планируемой диссертационной работы,
целью которой является: разработка комплексного подхода к созданию средств специфической профилактики сибирской язвы на основе рекомбинантных технологий.
Задачи исследования:
-
На основании экспериментальных данных о факторах иммуногенности и патогенности возбудителя сибирской язвы хромосомной детерминации создать коллекцию оптимальных реципиентов для генетического конструирования штаммов-продуцентов биологически-значимых антигенов сибиреязвенного микроба.
-
Сконструировать стабильные авирулентные рекомбинантные штаммы-продуценты протективного антигена B. anthracis. Оценить эффективность продукции протективного антигена штаммами с клонированным геном pag.
-
Разработать условия безопасной и экологичной технологии получения протективного антигена сибиреязвенного микроба. Сконструировать стабильный аспорогенный рекомбинантный штамм-продуцент протективного антигена, перспективный для производства основного компонента химических сибиреязвенных вакцин.
-
Оптимизировать экспериментальную схему выделения и очистки протективного антигена, синтезируемого генно-инженерным продуцентом. Получить высокоочищенный препарат рекомбинантного протективного антигена, осуществить его биохимическую и иммунохимическую характеристику. В экспериментах in vivo показать возможность применения рекомбинантного протективного антигена для осуществления специфической профилактики сибирской язвы.
-
Оценить иммуногенный потенциал белков S-слоя B. anthracis. Получить эффективные продуценты экскретируемого компонента S-слоя. Выделить, очистить, идентифицировать и охарактеризовать протеины Sap и ЕА1.
-
Изучить иммуногенность и остаточную вирулентность генно-инженерных штаммов в сравнении с лицензированными препаратами живых сибиреязвенных вакцин. Оценить перспективы рекомбинантных штаммов в плане создания на их основе менее реактогенных живых вакцин.
-
Определить основные направления использования генетически сконструированных штаммов и синтезируемых ими биологически значимых белковых продуктов.
Научная новизна исследования:
С учетом фундаментальных знаний о факторах патогенности и иммуногенности сибиреязвенного микроба и применением рекомбинантных технологий разработана комплексная экспериментальная система, включающая: а) протеазодефицитные и аспорогенные реципиентные штаммы B. anthracis; б) сконструированные на их основе стабильные, эффективные и безопасные продуценты иммуногенных антигенов; в) перспективные для создания ареактогенной химической вакцины препараты протективного антигена и компонентов S-слоя; г) генно-инженерный штамм B. anthracis, являющийся прототипом менее реактогенной живой сибиреязвенной вакцины.
Впервые получены стабильные и эффективные генно-инженерные продуценты ПА на основе бесплазмидных производных отечественных вакцинных штаммов B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55.
Разработаны условия безопасной и экологичной технологии производства химической сибиреязвенной вакцины. Сконструирован не образующий спор стабильный рекомбинантный авирулентный штамм B. anthracis, продуцирующий ПА в 4 - 5 раз больше, чем вакцинные штаммы B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55. Установлено, что двукратная иммунизация кроликов дозой 50 мкг очищенного препарата ПА, выделенного из аспорогенного рекомбинантного штамма B. anthracis 55DTПА-1Spo-, обеспечивает защиту 100 % животных от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма B. anthracis 81/1.
В экспериментах на лабораторных животных показана перспективность использования рекомбинантного штамма B. anthracis СТИDТПА-1 для создания менее реактогенной и эффективной живой сибиреязвенной вакцины. Однократная иммунизация морских свинок дозой 5 107 спор сконструированных штаммов B. anthracis СТИDТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 вызывает развитие иммунного ответа, характеризующегося высокими значениями индексов иммунитета и титров антител к протективному антигену. Генно-инженерные штаммы не обладают остаточной вирулентностью для морских свинок и мышей линии BALB/с.
Впервые у штаммов возбудителя сибирской язвы обнаружены различия в продукции in vitro одного из белков S-слоя – Sap. Среди природных изолятов и аттенуированных производных B. anthracis обнаружены культуры, не продуцирующие Sap в среду выращивания.
Показано, что условия температурной элиминации плазмид в лабораторных условиях способствуют возникновению спонтанных Sap- мутаций.
На основании изучения вирулентности изогенных производных B. anthracis 81/1 установлено, что спонтанные мутации, приводящие к сочетанному нарушению протеолитической, гемолитической активности, пигментсинтеза и пигментсорбции не вызывают значительного изменения патогенности штаммов B. anthracis. Спонтанные мутации, приводящие к смене фенотипа со спорообразующего на аспорогенный, сопровождаются снижением почти на два порядка степени патогенности штамма для беспородных белых мышей. Результаты изучения вирулентности спонтанных аспорогенных мутантов, инсерционного Spo- мутанта и сконструированного Spo+ трансдуктанта свидетельствуют о влиянии на патогенность продуктов генов, находящихся в непосредственной близости от генов spo оперона или в функциональном взаимодействии с ними.
В основу эффективной селекции протеазодефицитных и аспорогенных штаммов B. anthracis положена выявленная корреляция экспрессии хромосомных признаков - протеолиза, гемолиза, пигментсорбции, пигментсинтеза и спорообразования.
Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена 7 патентами Российской Федерации на изобретения: № 2321628 - рекомбинантный штамм B. anthracis СТИDТПА-1 (pUB110PA-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба; № 2321629 - аспорогенный рекомбинантный штамм B. anthracis 55DТПА-1 Spo- (pUB110PA-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба; № 2180349, № 2180916, № 2180917 и № 2180350 – аспорогенные штаммы B. anthracis, являющиеся продуцентами сибиреязвенных антигенов или реципиентами для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов; № 2193597 - способ получения аспорогенных штаммов B. anthracis.
Практическая ценность и формы внедрения:
В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирована система штаммов B. anthracis, необходимая для изучения генетической детерминации факторов патогенности и иммуногенности возбудителя сибирской язвы, направленного конструирования продуцентов биологически-значимых макромолекул, лабораторного и промышленного получения иммуногенных антигенов сибиреязвенного микроба. Она включает 25 бациллярных штаммов, в том числе: а) стабильные и эффективные рекомбинантные продуценты ПА сибиреязвенного микроба - B. anthracis СТИDТПА-1 (КМ96), B. anthracis 55ТПА-1 (КМ95) и B. subtilis WB600ПА-1 (КМ199); б) аспорогенный рекомбинантный продуцент ПА - B. anthracis 55DTПА-1Spo- (КМ97); в) продуценты белка S-слоя (Sap) - B. anthracis Sterne H1 и B. anthracis 71/12H2 (КМ87 и КМ88); г) коллекцию реципиентных бесплазмидных штаммов для экспериментов по генетическому конструированию - B. anthracis 55DT (КМ92(2)) и его аспорогенный мутант (КМ92(3)), аспорогенный мутант B. anthracis СТИDT (КМ91), инсерционный аспорогенный мутант B. anthracis SterneDT (КМ90), спонтанный и инсерционный Sap- мутанты B. anthracis SterneDT (КМ93 и КМ94); д) коллекцию из 11 изогенных штаммов B. anthracis - ди-, моно- и бесплазмидных производных B. anthracis 81/1 (КМ86(1-11)), различающихся по степени выраженности хромосомных признаков: протеолитической, гемолитической активности, способностей к сорбции и синтезу пигмента, спорообразованию; е) спонтанные аспорогенные мутанты вакцинных штаммов B. anthracis Sterne 34F2 и B. anthracis 55 (КМ89 и КМ92).
Перечисленные штаммы использовались при выполнении НИР "Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин" (2001 - 2002 гг.), "Разработка и совершенствование средств и методов профилактики и лечения опасных и особо опасных заболеваний" (2002 - 2004 гг.) в рамках Федеральных целевых научно-технических программ: «Создание методов и средств защиты населения и среды обитания от опасных и особо опасных патогенов в чрезвычайных ситуациях природного и техногенного характера”, "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники". С применением депонированных штаммов проведены: хоздоговорная НИР с НИИ микробиологии МО РФ - "Получение аспорогенных производных вакцинных штаммов B. anthracis" (2000 г.), а также плановые НИР: "Изучение хромосомных факторов патогенности возбудителя сибирской язвы" (1997 - 2001 гг.), "Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин" (2002 - 2004 гг.), «Использование препаратов протективного антигена и белков S-слоя для создания средств диагностики и профилактики сибирской язвы» (2006-2008 гг.). Аспорогенные штаммы B. anthracis (КМ89-92) применяются при проведении научно-технических разработок, проводимых в ФГУ «48 Центральный научно-исследовательский институт МО РФ» и ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора».
Материалы диссертации вошли в практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней», утвержденное руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (12.12.07 г.).
По материалам диссертации составлены методические документы, одобренные Ученым советом и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб»: пособие для научных сотрудников - «Выделение в популяциях Bacillus anthracis фенотипов, различающихся по протолитической, гемолитической активности, способности к сорбции пигмента и спорообразованию» (30.04.99 г.); методические рекомендации - «Комплекс методических подходов к определению продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба» (17.04.07 г.) и «Селекция штаммов сибиреязвенного микроба, продуцирующих белок Sap S-слоя» (27.06.07 г.).
Материалы диссертации представлены в лекционных циклах по генетике бактерий - на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов при РосНИПЧИ «Микроб», на биологическом факультете Саратовского Государственного университета имени Н.Г. Чернышевского и биотехнологическом факультете Саратовского Государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
С применением комплексного подхода, учитывающего дополнительные сведения о факторах иммуногенности и патогенности B. anthracis и использующего рекомбинантные технологии, создана экспериментальная система для конструирования сибиреязвенных вакцин. Ее компонентами являются: коллекция протеазодефицитных и аспорогенных бесплазмидных производных вакцинных штаммов B. anthracis; генно-инженерные бациллярные штаммы с высокой продукцией биологически активного протективного антигена, в том числе - стабильный аспорогенный продуцент; очищенные препараты рекомбинантного протективного антигена и белков S-слоя сибиреязвенного микроба; высокоиммуногенный штамм B. anthracis с клонированным геном pag.
-
Рекомбинантные штаммы B. anthracis СТИDТПА-1, B. anthracis 55ТПА-1 и B. subtilis WB600ПА-1 - безопасные, стабильные и эффективные продуценты протективного антигена сибиреязвенного микроба. Генно-инженерные штаммы не содержат детерминанты синтеза основных факторов вирулентности возбудителя сибирской язвы, сохраняют биологические свойства при пассировании в селективных условиях и секретируют в пять раз больше иммуногенного антигена, чем вакцинные культуры B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55.
-
Генно-инженерные штаммы с гибридным репликоном pUB110PA-1 обладают высокой иммунологической эффективностью. Однократная иммунизация биомоделей (мышей линии BALB/с, морских свинок) дозой 3 - 5 107 спор рекомбинантных штаммов B. anthracis СТИDТПА-1и B. subtilis WB600ПА-1 вызывает развитие напряженного иммунитета с высокими значениями титров антител к протективному антигену и эффективно защищает от заражения тест-штаммом возбудителя сибирской язвы.
-
Рекомбинантный аспорогенный штамм B. anthracis 55DТПА-1(Spo-) при пассировании in vitro не реверсирует к спорообразующему фенотипу и в селективных условиях сохраняет способность к репликации гибридной плазмиды, определяя концепцию экологичной и безопасной технологии производства химической сибиреязвенной вакцины. Генно-инженерный штамм синтезирует биологически активный протективный антиген - двукратная иммунизация дозой 50 мкг очищенного рекомбинантного продукта обеспечивает защиту 100 % кроликов от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма возбудителя сибирской язвы.
-
Белки S-слоя B. anthracis являются дополнительными факторами иммуногенности хромосомной детерминации на основании изучения протективных свойств очищенных белковых препаратов и изогенных Sap+ и Sap- штаммов B. anthracis. Спонтанные или индуцированные мутации в штаммах B. anthracis, приводящие к смене фенотипа со спорообразующего на аспорогенный, сопровождаются снижением на 1 - 3 порядка степени их патогенности для белых мышей.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на международных конференциях: 3-й международной конференции по сибирской язве (Плимут, Великобритания, 1998), 2-ой международной конференции по молекулярной биологии Bacillus cereus, Bacillus anthracis и Bacillus thuringiensis (Таос, Нью-Мексико, США, 1999), 1-ой международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), Межгосударственной научно-практической конференции «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); на Российских конференциях: 2-ой Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Саратов, 1998); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - ХХI век» (Саратов, 2004); IX Всероссийской научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2004); ХХ Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2004); Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005); Российском медицинском форуме «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); а также на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998) и ежегодных научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2000-2008).
Публикации. Основное содержание работы отражено в 48 научных публикациях, из которых 12 статей в рекомендованных ВАК изданиях, 16 тезисов в сборниках международных и Российских конференций, 7 патентов.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 66 отечественных и 250 зарубежных источников. Общий объем диссертации составляет 297 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 47-ю рисунками.
