Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
Раздел 1.1. Бифидобактерии 7
Раздел 1.2. Легионеллы 20
Раздел 1.3. Идентификация и классификация микроорганизмов с использованием молекулярно- генетических методов . 32
Раздел 1.4. Серологические методы 47
Глава 2. Материалы и методы исследования 61
Раздел 2.1. Материалы 61
Раздел 2.2. Методы исследования 65
Глава 3. Результаты и обсуждение 70
Раздел 3.1 Определение видовой принадлежности бактерий рода Bifidobacterium, выделенных из кишечника детей раннего возраста 70
Раздел 3.2 Генотипирование бактерий рода Legionella 78
Глава 4. Заключение. 110
Выводы 112
Список литературы 113
Список публикаций по теме диссертации 125
- Бифидобактерии
- Идентификация и классификация микроорганизмов с использованием молекулярно- генетических методов
- Определение видовой принадлежности бактерий рода Bifidobacterium, выделенных из кишечника детей раннего возраста
- Генотипирование бактерий рода Legionella
Введение к работе
Дифференциация штаммов и видов , микроорганизмов - актуальная задача
микробиологии и эпидемиологии. Методы идентификации бактерий, основанные на фенотипических признаках, ПЦР, фрагмент-анализе в большинстве случаев не характеризуются высоким значением коэффициента дифференциации, воспроизводимостью, требуют применения в каждом эксперименте референсных штаммов. Генотипирование на основе секвенирования фрагментов генома микроорганизмов свободно от указанных недостатков, что открывает более широкие возможности в идентификации штаммов.
Анализ последовательности 16S рДНК, проведенный Woese С. [123, 124], Stackebrandt Е. [103] и другими исследователями, стал основой филогении доменов Bacteria wArchaea. Однако возможности данной мишени ограничены, поскольку с ее помощью нельзя различить генетически близкородственные виды и штаммы одного вида бактерий. Для решения этого вопроса были разработаны другие подходы, например, метод генотипирования на основе мультилокусного секвенирования (multilocus sequencing, MLST) [77]. В настоящее время протоколы MLST используют для генотипирования 25 различных групп микроорганизмов. Один из них для штаммов бактерий вида Legionella pneumophila был разработан представителями Европейской рабочей группы по легионеллезу (EWGLI, European Working Group for Legionella Infections).
Преимущества MLST заключаются в том, что, во-первых, оперируя «housekeeping» генами, эволюционирующими медленно и являющимися селективно нейтральными, этот метод различает штаммы по длительно сохраняющимся изменениям в геноме. Во-вторых, в рамках описываемого подхода можно создавать базы данных о штаммах на основе секвенированных аллелей, анализировать их и прогнозировать вирулентность, резистентность к антибиотикам и другие значимые свойства изолятов. В связи с вышесказанным, применение MLST для анализа штаммов бактерий открывает новые перспективы в исследованиях как молекулярно-биологического, так и эпидемиологического направления.
Нестабильность экологической обстановки в условиях техногенной цивилизации вызывает существенные изменения в составе микробиома человека и видовом разнообразии потенциально опасных микроорганизмов в окружающей среде. В
качестве моделей для изучения популяционного и динамического разнообразия бактерий на основе секвенирования нескольких локусов генома и выработки последующих рекомендаций по экологическому и эпидемиологическому мониторингу нами были выбраны микроорганизмы - представители внутренней среды организма человека (род Bifidobacterium) и окружающей среды (род Legionella).
Бактерии рода Bifidobacterium - важный компонент микрофлоры кишечника детей раннего возраста. Они участвуют в утилизации пищевых субстратов, синтезируют витамины (витамин К, пантотеновую кислоту, витамины группы В), способствуют защите от патогенных микроорганизмов, обладают иммуномодулирующим действием. Присутствие В: infantis в ЖКТ с первых дней развития ребенка оказывает положительное влияние на формирование всех систем организма. Изменения в составе бифидофлоры приводят к проявлению аллергических реакций. Своевременная коррекция видового состава с помощью синбиотических препаратов и оценка ее эффективности может быть проведена только на основе информации о первоначальном и последующем состоянии бифидофлоры ребенка. Для выполнения такого исследования необходим метод секвенирования нескольких локусов генома.
Бактерии рода Legionella — возбудители легионеллезной инфекции. Только за период с 1997 года по май 2008 год они стали причиной 51 вспышки болезни легионеров. Принимая во внимание эпидемиологическую опасность бактерий рода Legionella, в 2008 г. В РФ были усовершенствованы методы эпидемиологического надзора за легионеллезной инфекцией. Роспотребнадзором утверждены методические указания (МУК) по микробиологическому мониторингу систем, согласно которым особое внимание необходимо уделять искусственным водным системам с большим количеством циркулирующей теплой воды в сочетании с образованием водного аэрозоля [17]. Для выполнения требований МУК необходимы анализ популяционного разнообразия штаммов рода Legionella на территории РФ и оценка их эпидемиологической значимости.
Таким образом, представляется актуальным мониторинг видового разнообразия бифидо бактерий и популяционного разнообразия штаммов рода Legionella,
выделенных на территории РФ на основе эффективного метода многолокусного секвенирования.
Цель исследования:
Оценить популяционное и динамическое разнообразие бактерий внутренней среды человеческого организма и окружающей среды на примере бактерий рода Bifidobacterium и Legionella с использованием метода мультилокусного секвенирования.
Задачи исследования:
Изучить видовое разнообразие бифидофлоры группы клинически здоровых детей раннего возраста
Проследить становление бифидофлоры детей раннего возраста после воздействия синбиотического препарата «Бифидум-Мульти-1»
На основе методов мультилокусного секвенирования и серотипирования с использованием моноклональных антител разработать систему ведения и контроля отечественной коллекции легионелл
Изучить популяционное разнообразие штаммов L. pneumophila в потенциально опасных водных системах РФ (градирнях и системах водоснабжения). Выявить характерные для штаммов РФ кластеры аллельных профилей и проследить взаимосвязь между ними.
На основе сравнения аллельных профилей выделенных штаммов РФ и клинических изолятов базы данных EWGLI, а также результатов серологического типирования оценить потенциальную опасность штаммов L. pneumophila для человека.
Список сокращений, используемых в тексте
16S рРНК - 16S рибосомальная РНК
tal (transaldolase) - трансальдолаза
FHHMB - Federal Human Host Microflora Bank - Государственная коллекция микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора
АТСС (American Type Culture Collection) - американская коллекция типовых культур
DSM (Deutsche Samrnlung von Microorganismen and Zellkulturen) - немецкая коллекция микроорганизмов
JCM (Japan Culture Collection of Microorganism) - японская коллекция микроорганизмов
EWGLI (European Working Group for Legionella Infections) - Европейская рабочая группа по легионеллезу
EULV - номер штамма в коллекции EWGLI
dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфаты
ddNTP - дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты
ST ( Sequence Туре) - тип секвенирования
ЖКТ - желудочно-кишечный тракт
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПААГ - полиакриламидный гель
ЭФ - электрофорез
УФ - ультрафиолет
Бифидобактерии
Особенно важны бифидобактерии для формирования пищеварительной и иммунной систем детей раннего возраста. ЖКТ новорожденного стерилен, и во время рождения ребенка происходит заселение его кишечника теми микроорганизмами, которые присутствуют в организме матери и окружающей среде. Первоначально кишечник новорожденных заселяют факультативные анаэробы, такие как Е. coli и энтерококки. Впоследствии данные микроорганизмы вытесняются строгими анаэробами, среди которых бифидобактерии составляют до 95% [51].
На основе анализа данных литературы можно прийти к заключению, что в настоящее время происходят изменения качественного и количественного состава бифидофлоры детей раннего возраста.
В некоторых случаях наблюдается отсутствие бифидофлоры даже у детей, находящихся на грудном вскармливании. Например, в работе Vilkova Е. et al. показано, что у 17 из 51 обследованного ребенка в возрасте от 3 до 276 дней не обнаружены бифидобактерии, у 5 детей отмечено сниженное количество бифидобактерии (3-6 log CFU/g) [116].
Снижение содержания бифидобактерий в составе кишечной микрофлоры грудных детей отмечала Гончарова Г.И. еще в 1980-е г.г. Она показала, что лишь у 75,3% детей, получавших грудное молоко, бифидобакетрии высевались из оптимальных 10"9-10"10 разведений фекалий и составляли 85-90% всей микрофлоры толстой кишки. Кроме того, по мнению Гончаровой Г.И., многолетнее применение антибиотиков привело к тому, что у здоровых доношенных детей, находящихся на грудном вскармливании, стабильное преобладание бифидофлоры над аэробными микроорганизмами наступало к 8-9 суткам жизни вместо 3-4 [7].
Анализ литературы показал, что с течением времени происходило изменение видового состава бифидофлоры детей раннего возраста по сравнению с данными 1960-х г.г. Следует отметить, что из 43 известных на сегодняшний день видов бифидобактерий 7 были выделены из фекалий детей при первоначальной идентификации: В. adolescentis, В. bifidum, В. breve, В. catemdatum, В. infantis, В. longum, В. pseiidocatenulatum. В 1963 г. Reuter G. отмечал у младенцев следующие виды бифидобактерий: В. longum (biotype b), В. bifidum (biotype b), В. breve, В. parvidorum, отнесеный позднее к В. breve, В. infantis, В. liberonim и В. lactentis, признанные в дальнейшем идентичными В. infantis [93]. Эти виды и биотипы исследователь обнаружил только у младенцев. Поясняя свои данные 1963 г. и 1971 г. на основе сведений о видах, открытых позднее, Reuter G. в 2001 г. изолят В. adolescentis биотип «а» описал как строгий В. adolescentis, который может присутствовать у младенцев в кишечнике и влагалище, а В. adolescentis биотип «с», как относительный В. adolescentis, включающий виды В. catenulatiim и В. pseiidocatenulatum [96].
Mitsuoka Т. в 1974 г. отмечал В. infantis как преобладающий вид у детей грудного возраста не зависимо от типа питания (молоко материнское, коровье или сухое). По данным исследователя В. breve был вторым по частоте встречаемости. По наличию бифидобактерий этого вида существенно различались дети, питавшиеся грудным и сухим молоком (43% и 0,9%, соответственно). Также у всех детей были идентифицированы виды В. longum, В. adolescentis и В. bifidum. Частота встречаемости В. adolescentis у детей на сухом молоке была в 2 раза выше, чем у детей, питавшихся материнским молоком [86].
Biavati В. в 1984 г. еще отмечал наличие В. infantis у грудных детей, как на естественном, так и на искусственном вскармливании [28], но в дальнейшем в этот вид как преобладающий у грудных детей не фиксировался. В 1987 с частотой менее 5% В. infantis был выделен только у детей 6-12 недель на грудном вскармливании в Нидерландах [84]. Исключением являются дети республики Гана. У 72% обследованных в 2004 г. месячных младенцев присутствовали бактерии В. infantis. Авторы публикации полагают, что это связано с тем, что дети африканского государства растут в менее стерильных условиях, чем дети развитых стран (Великобритании и Новой Зеландии), у которых не выделен вид В. infantis. Следует отметить, что одновременно у 22% обследованных месячных детей Ганы отсутствовала бифидофлора, тогда как в Новой Зеландии процент таких детей был очень низким, а в Великобритании бифидофлора присутствовала у всех грудных детей проверяемой выборки [126].
Исследования, проведенные в Японии через 10 лет после упомянутой работы Mitsuoka Т. в его же лаборатории, показали, что у младенцев 28-46 дней, как на грудном, так и на искусственном вскармливании в составе бифидофлоры кишечника отсутствуют В. infantis, но преобладают В. breve (52 и 53% всех изолятов). У детей на искусственном вскармливании в 2 раза выше частота встречаемости В. bifidum. Самое примечательное, что в данной работе у младенцев обнаружили 7 отличаемых, но не идентифицированных видов бифидобактерий. Количество этих видов было выше у детей на грудном вскармливании. Всего 13 видов и биоваров и 7 не идентифицированных видов было изолировано у детей на грудном вскармливании и 12 видов и биоваров и 2 не идентифицированных вида у детей на искусственном питании [26]. Таким образом, бифидофлора грудных детей с естественным вскармливанием богаче видами бифидобактерий.
В работах начала XXI века как преобладающий вид в бифидофлоре младенцев уже фигурирует В. longnm. Самая высокая частота встречаемости упомянутого вида отмечена в исследованиях Шкопорова А.Н. и соавторов (75,9%) [23]. Из видов, которые стали чаще выявлять в кишечной микрофлоре грудных детей, следует отметить В. catenulatum и В. psendocatenulatum, В. dentium, В. angulalum и В. animalis.
Помимо изменений видового состава бифидофлоры снижается и количество видов, входящих в состав бифидофлоры детей раннего возраста. В исследованиях 1960-70 г.г. отмечалось, что у младенцев на грудном вскармливании бифидофлора чаще представлена 2 видами бифидобактерий. В работе Mitsuoka Т. (1974) показано, что у 71% детей, получавших материнское молоко, изолировали бифидобактерий 2-х видов, а среди младенцев, вскармливаемых сухим молоком, таких было только 29% [86]. В публикации Mevissen-Verhage Е.А.Е. 1987 г. такое отличие еще подтверждалось: у детей на грудном молоке выделяли в среднем 2,9 вида на ребенка, а у младенцев на искусственной диете только 1,4 вида [84]. Однако уже Гончарова Г.И. в 1986 г. обращала внимание на уменьшение количества видов бифидобактерий, изолируемых у младенцев, питавшихся грудным молоком: у 87% детей бифидофлора была представлена одним видом бактерии. Результаты Young S.L. et al. (2004 г.) показывают, что у каждого из обследованных грудных детей были выделены бифидобакетрии только одного вида.
Идентификация и классификация микроорганизмов с использованием молекулярно- генетических методов
В большинстве случаев внимание исследователей сконцентрировано на анализе гена, кодирующего 16S рРНК. На анализе последовательностей данной мишени основаны методы ARDRA, PFGE и риботипирование.
Метод ARDRA (amplified ribosome DNA restriction analysis) заключается в том, что гены рРНК предварительно амшшфицируют методом ПЦР и затем расщепляют рестриктазами. После проведения гидролиза фрагменты разделяют при помощи электрофореза в высокоразрешающем геле. Данный метод используют для быстрого скрининга большого числа изолятов. Сравнение полученных профилей ДНК-фрагментов с имеющимися в базах данных позволяет отнести изолят к тому или иному виду (или группе видов).
Данный метод используется для типирования бифидобактерий. Как и в методе BRENDA особое внимание при различении видов с использованием данного метода следует уделять выбору ресриктаз, поскольку от этого зависит разрешающая способность метода. Ventura М. et al. применили ARDRA для типирования бифидобактерий и продемонстрировали, что с его помощью можно разделить виды В. animalis, В. longwn, В. infantis, В. breve, В. bifidiun, В. adolescentis, В. cimiculi, В. magnum, В. pseudocatenulatiim и В. pullonim. При этом мишенью для амплификации служила 16S рДНК, рестрикцию проводили с использованием эндонуклеаз BamHI и Sau3AI. Разрешающая способность данного метода ограничена, и с помощью данного набора рестриктаз исследователи не смогли различить ряд видов. Так, при использовании рестриктазы Sau3AI Ventura М. et al не смогли различить виды В. adolescentis и В. coryneforme, В. anymalis и В. pseudolongun, В. snis и В. longum. Использование дополнительной рестриктазы BamHI повысило разрешающую способность метода, однако В. siiis и В. longwn имели сходные профили[117]. PFGE (pulsed-field gel electrophoresis, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов в денатурирующем геле). Данный метод представляет собой модификацию метода BRENDA с введением дополнительной стадии гибридизации. После проведения рестрикции и разделения в высокоразрешающем геле получившиеся фрагменты переносят на мембрану и анализируют путем гибридизации с мечеными зондами - фрагментами ДНК. Как и метод BRENDA данный метод имеет в основном прикладное значение.
Риботипирование представляет собой вариант метода PFGE. Различие методов заключается в том, что при проведении риботипирования в качестве зондов используются меченые фрагменты рибосомальной РНК и рибосомальной ДНК. Однако получаемый при использовании данного метода набор полос сложнее PFGE-набора, поскольку гены рРНК у прокариот одни из немногих, присутствующих в геноме во множестве копий — от 1 до 12-15 в зависимости от таксона. Поэтому разрешающая способность метода зависит от изучаемого вида и выбранных рестриктаз.
В работе, проведенной Schoonmaker D. С. соавторами, сравнивается эффективность использования методов риботипирования и PFGE анализа для разделения бактерий вида L. pneumophila на подвиды. Авторы признают пригодность методов для этой цели, однако согласно полученным ими данным, эти два метода не всегда дают сходные результаты при типировании. Основным недостатком метода PFGE является наличие большого числа фрагментов разной длины, что сильно затрудняет анализ. Этот недостаток устраняется правильным подбором рестриктаз. Так, например, для разделения L. pneumophila на подвиды был использован метод PFGE с применением только одной рестриктазы Sfll, в результате получали набор из 8-13 фрагментов ДНК, доступный для анализа [101].
Для проведения риботипирования бифидобактерий на уровне вида в качестве меченых зондов для проведения гибридизации по Саузерну используют последовательности 16S рДНК. Перед проведением гибридизации тотальную ДНК бифидо бактерий расщепляют рестриктазами EcoRI, Hhal, Bfal или Rsal. В настоящее время с помощью данного метода, можно идентифицировать В. adolescentis, В. animalis, В. bifidum, В. breve, В. infantis, В. longum и некоторые другие виды. В работе Sakata Sh. et al. было отмечено, что по результатам риботипирования 28 штаммов, обладавших типовыми фенотипическими характеристиками, и 64 референсных штамма видов В. animalis sbsp. animalis, В. breve, В. catemdatum, В. dentium, В. merycicum, В. psuedocatemdatum и В. riiminantium сформировали отдельные кластеры в соответствии с видовой принадлежностью [97]. Только один из штаммов В. bifidum по результатам риботипирования не был включен в кластер с референсными штаммами данного вида.
К методам анализа отдельных фрагментов генома с использованием ПЦР относится мультиплекс ПЦР. Самой распространенной мишенью при видовой идентификации бифидобактерий служит уже упомянутая последовательность 16S рДНК. Мультиплекс ПЦР предусматривает проведение нескольких реакций с набором праймеров, комплементарных последовательностям 16S рДНК, в одной пробирке. При этом используемые для постановки реакции праймеры являются видоспецифичными. В настоящее время описаны праймеры для идентификации рода Bifidobacterium, а также некоторых видов бифидобактерий - В. longum, В. adolescentis, В. bifidum, В. breve, В. dentium, В. angnlatum, В. infantis, а также группы В. catenulatum и В. gallicum [34]. Однако возможности данного метода таюке ограничены, и с его помощью нельзя разделить бактерии видов В. catenulatum и В. psuedocalenidatum [34].
AFLP (amplified fragment length polymorphism) метод, сочетающий рестрикционный анализ и полимеразную цепную реакцию, был разработан для анализа растений и запатентован в 1992 году (European patent application 0534858А1) [114]. Он позволяет детектировать полиморфизм длин рестрикционных фрагментов непосредственно в агарозном геле, минуя стадию гибридизации.
На данный метод в 2002 году обратила внимание Европейская рабочая группа по легионеллезу (EWGLI) с целью дифференциации штаммов L. pneumophila. Исследователями было выделено 16 наиболее значимых AFLP-профилей. В 2002 году метод AFLP был утвержден в качестве стандарта для различения штаммов L. pneumophila, и создана база AF- профилей на основе европейских коллекций штаммов этого микроорганизма [47]. Метод был оформлен в виде протокола, включающего рестрикцию с помощью эндонуклеазы PstI, лигирование, амплификацию (с использованием праймеров AFLP-LG1 и AFLP-LG2) и электрофорез в 1,5% агарозном геле [105].
Определение видовой принадлежности бактерий рода Bifidobacterium, выделенных из кишечника детей раннего возраста
Первым тестом, основанным на латекс-агглютинации, был Rheumatoid Factor Test, предложенный Singer J.M. и Plotz СМ. в 1956 году [52]. Метод основан на том, что антитело (или антиген) прикрепляют к поверхности частицы латекса. Когда к частицам добавляют специфичный антиген (или антитело), возникает агглютинация (слипание частиц). Установлено, что для того, чтобы слипшиеся частицы были видны человеческим глазом, их размер должен быть около 50 мкм, а число - около 100 [52]. Средний размер латексной частицы составляет 0,8 мкм, для формирования видимой латексной частицы необходимо 10 таких частиц. Для того чтобы увидеть агрегаты в некоторых случаях необходимо более чувствительное оборудование. Поэтому для визуализации агглютинации латексных частиц применяют спектрофотометры и нефелометры, измеряющие адсорбцию или рассеянный свет.
Методы получения латексных частиц. Латексные частицы получают путем полимеризации эмульсии. Для этого стирол смешивают с поверхностно-активным веществом (например, додецил сульфатом натрия), в результате получается большое число мицелл, примерно одинаковых по размеру. Потом к эмульсии добавляют инициатор полимеризации, например персульфат калия. При этом цепи полистирола агрегируют с образованием мицелл с углеводородной частицей в центре и ионами сульфата на поверхности сферы. Помимо стирола применяют другие углеводороды и их производные, например винил толуол, поливинил толуол, стирол дивинилбензол, полиметилметакрилат и т.д.
Прикрепление антитела к поверхности латексной частицы. Для прикрепления антител к поверхности латексной частицы используют пассивную адсорбцию и ковалентное связывание. Для того чтобы произошла адсорбция, частицы латекса и антитела смешиваются в соответствующем буфере, затем производят отмывку частиц от не связавшихся антител. Недостатки пассивной адсорбции состоят в десорбции антител с поверхности латексных частиц, приводящей к снижению чувствительности латекс-агглютинации с течением времени.
Другой способ - ковалентное присоединение молекул к поверхности латексной частицы. Ковалентное связывание осуществляется с использованием различных функциональных групп: карбоксильных, аминогрупп, альдегидных, гидроксильных и т.д. Для сшивки используют различные бифункциональные агенты, такие как глутаровый альдегид, карбоимиды и др.
Определение антигена легионелл можно проводить как в сыворотке крови, так и в моче пациентов. Кроме того, существует ряд коммерческих наборов, применяемых для выявления легионелл не только в клиническом материале, но и в образцах, взятых из окружающей среды.
Для определения антигена в сыворотке крови пациентов в основном используют метод непрямой иммунофлуоресценции. Четырехкратное увеличение титра антител, является стандартом, в соответствии с которым ставится диагноз. В среднем антитела вырабатываются у заболевших в течение 2 недель, у 25% заболевших их нельзя детектировать, поскольку анализ сыворотки осуществляется поздно: после 8 и более недель с момента возникновения легионеллеза. Кроме того, антитела могут давать положительные реакции с другими бактериями, такими как Campylobacter и Pseudomonas. В связи с описанными выше . недостатками определения антигена в сыворотке крови был разработан ряд других методов для выявления антигена легионелл.
В начале 80-хх годов прошлого века было показано, что в самом начале болезни (2-3 сутки) антиген возбудителя можно обнаружить в моче больного легионеллезом, причем сам возбудитель в моче отсутствует [20]. Антиген термостабилен и может быть выявлен в течение примерно 30 дней после начала заболевания [20]. В 1989 году метод был стандартизован компаниями Binax (США) и Biotest (Германия). Преимущество данного метода над традиционными методами (бактериологическим и определением антигена в сыворотке крови) состоит в первую очередь в сроках исследования. Бактериологический метод занимает не менее 4-5 суток, причем требуются инвазивные процедуры для получения материала, содержащего возбудитель (биопсия, бронхоскопия), поскольку из мокроты возбудителя удается выявить не всегда. Выявление нарастания титров антител в реакции непрямой имунофлуоресценции возможно лишь на 3-й неделе заболевания, когда уже проведен курс антибиотикотерапии, и ясна клиническая картина.
Существует две.модификации определения антигена в моче больных - ИФА и иммунохроматографическое определение. ИФА позволяет количественно оценить наличие антигена и проверить одновременно более 80 образцов мочи, что важно при крупных вспышках заболевания. Как уже было упомянуто, в основе ИФА лежит ферментативная реакция расщепления неокрашенного субстрата с образованием окрашенного продукта, поэтому срок хранения данной системы определяется периодом стабильности активности фермента. При соблюдении условий хранения данная система сохраняет свои диагностические свойства в течение полугода.
Иммунохроматографический метод используется для быстрой диагностики спорадических и групповых случаев легионеллеза. В качестве метки в данной системе используют частицы окрашенного латекса или коллоидного золота, при связывании антитела с антигеном происходит окрашивание комплекса антитело/антиген/метка с образованием голубой (при использовании латекса) или коричневой (при использовании коллоидного золота) окраски. Стабильность данной системы определяют используемые антитела, срок ее хранения - до 2-х лет.
Серологические методы используют для выявления бактерий рода Legionella, видов легионелл и разделения вида L. pneumophila на серогруппы. В настоящее время существует ряд коммерческих наборов и разработанных внутри лабораторий некоммерческих наборов (так называемые in-house assay) для тестирования бактерий рода Legionella. Тестирование производится на основе ИФА, иммунофлуоресцентного анализа и латекс-агглютинации.
Среди некоммерческих наборов наиболее востребованным является набор антител Дрезденской панели. Она состоит из 98 моноклональных антител. Helbig J.H. et al. [60] оценивали возможность применения панели для тестирования серогрупп L. pnemophila. 17 моноклональных антител Дрезденской панели отобрано для различения серогрупп L. pnemophila (включая 15-ю серогруппу Lansing 3) и другие 26 - для разделения серогрупп 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13, 14 на подгруппы. Было выделено 9 моноклональных антител для разделения серогруппы 1 L. pnemophila на подгруппы. При использовании отобранных моноклональных антител, а таюке дополнительного моноклонального антитела МаЪ 3 из коллекции АТСС серогруппу 1 можно разделить на 15 подгрупп. Также было показано, что помимо серогруппы 1 некоторые другие серогруппы можно разделить на подгруппы. К таким серогрупам относят 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13 и 14 серогруппы L. pneumophila.
Помимо антител Дрезденской панели Helbig J.H. et al. был разработан набор на основе Mab, для выявления рода Legionella, определения L. pneumophila и разделения бактерий этого вида на 6 генетически различных групп. В основе лежит взаимодействие Mab с антигенными детерминантами, расположенными в пределах белка Мір, являющегося фактором инфицирования макрофагов [58]. Однако широкого распространения данный набор не получил.
Международная стандартная панель, разработанная Joly J. et al., состоит из следующих антител: Mabl, Mab 2, Mab 3, W32, 33G2, 32А12, 144С2 [67]. С помощью данного набора антител серогруппу 1 L. pnemophila можно разделить на подгруппы: Philadelphia, Allentown, France, Benidorm, Knoxwille, OLDA/Oxford и Bellingham. В настоящее время моноклональные антитела панели (за исключением W32) доступны в коллекции АТСС.
Генотипирование бактерий рода Legionella
Штаммы, относящиеся к разным серогруппам, имеют разную опасность для здоровья людей. Наиболее опасны представители серогруппы 1. Помимо упомянутой серогруппы, для людей с ослабленным иммунитетом опасность представляют штаммы серогруппы 6. Кроме того, применение иммуноферментного метода позволяет увеличить коэффициент дифференциации метода. Известно, что моноклональные антитела, идентифицирующие подгруппы Sg 1, получают на O-polysaccharide [82]. Следовательно, антитела дополняют схему SBT (7 генов) продуктом еще одного, восьмого гена, кодирующего липополисахарид легионелл. Например, Ratzow S. et al. подчеркивали, что при использовании совместно с протоколом SBT (7 генов) монрклональных антител, различающих подгруппы Legionella pneumophila серогруппы 1, значение D возрастало до 0,98 [93].
Нами было проанализировано 97 штаммов 2005-2008 гг. и 2 коллекционных образца. Данные, отражающие результаты серотипирования штаммов, представлены в таблицах 14 и 15. Наибольшее количество штаммов (38) было отнесено к серогруппе 6, 30 штаммов - к первой серогруппе. Штаммы серогрупп 2, 10, 12, 5 и 8 отмечены в единичных случаях. При этом выявленные нами штаммы подгруппы Dallas IE серогруппы 5 не характерны для европейских штаммов, которые принадлежат подгруппе Cambrige 1.
Среди первой серогруппы наиболее часто встречающейся подгруппой была подгруппа Oxford, в которую вошли 14 штаммов, 5 штаммов были отнесены к подгруппе Heysham, 4 - к подгруппе Benidorm, 3 - к подгруппе Bellingham и один -Philadelphia.
Данные, полученные при определении серогрупп L. pnemophila с использованием латекс-агглютинации и иммуноферментного анализа, в ряде случаев не совпадали. Серогруппа штаммов GICL 38: Pyshma-9, GICL 65: Sophia, GICL 43: Pyshma-14, GICL 44: Pyshma-16, GICL 75: Pyshma-33 при использовании латекс-агглютинации была определена как 1, однако применение Mab показало, что штамм GICL 38: Pyshma-9 относится к серогруппе 2, GICL 65: Sophia - к серогруппе 3, GICL 43: Pyshma-14 и GICL 75: Pyshma-33 - к серогруппе 6, GICL 44: Pyshma-16 к - серогруппе 10.
Между ST и подгруппой серогруппы 1 наблюдается корреляция. Все штаммы с ST 7 и 324 были отнесены к подгруппе Oxford, 521 и 498 - к подгруппе Benidorm.
Штаммы с ST 1, 7 и 320, относящиеся к подгруппе Oxford, имеют аналогичный аллелъный профиль и отличаются друг от друга по 1-2 заменам. Штамм GICL 108: UNL-1 (ST 1) отличается от штаммов GICL 39: Pyshma-199-5, GICL 47: Pyshma-19, GICL 49: Pyshma-22, GICL 51: Pyshma-26, GICL 46: Pyshma-18 и GICL 76: Pyshma 34 (ST 7) no мишени nenA, от штамма GICL 37: Pyshma-5 (ST 320) по мишени pro.
Несоответствие наблюдается только в случае штаммов подгруппы Bellingham. Из 3-х штаммов, относящихся к данной подгруппе, два (GICL 67: Moscow-4.7 и GICL 34: Pyshma-2) являются аналогичными и имеют 2 замены по аллелям fla и pro, штамм GICL 63: TOTAL-16 отличен от вышеупомянутых штаммов по 6 из 7 аллелей.
В большинстве случаев мы наблюдали корреляцию между аллельным профилем штамма и его серогруппой. Так, все штаммы с ST 292, 514, 516, 519 и 114 были отнесены к серогруппе 6, 319 - к 5-й серогруппе, 321 - ко 2-й, 325 - к 10-й, 517 - к 14-й. Однако в некоторых случаях отмечено несовпадение между ST и серогруппой. Из 3-х штаммов с ST 17 два были отнесены к серогруппе 10, 1 - к серогруппе 3. Из штаммов с ST 191 один принадлежал к серогруппе 6, а второй - к серогруппе 3.
Несоответствия между аллельным профилем и серогруппой или подгруппой Sg 1, определенными для штаммов, можно объяснить более совершенной схемой типирования, включающей дополнительную 8-ю мишень (липополисахарид легионелл). Coscolla М. et al. называют это несоответствие не конгруэнтностью, приводя пример, когда близкие по аллельному профилю штаммы относятся к разным серогруппам и наоборот [38].
Серологический метод анализа имеет большое практическое значение, поскольку разные серогруппы L. pnemophila и различные подруппы серогруппы 1 данного вида легионелл имеют различную вирулентность. Например, согласно данным Harrison T.G. et al., 97,6 % клинических изолятов Англии и Уэльса принадлежали L. pnemophila серогруппе 1. Из них 22,8% относились к подгруппе Allentown. Клинические изоляты этой подгруппы были выделены также во Франции и в Нидерландах. Среди штаммов из окружающей среды только 1 относился к подгруппе Allentown, а 17,0% - к подгруппе Oxford/OLDA [57].
Следует обратить внимание на подгруппы Philadelphia и Benidorm. Штаммы обеих подгрупп реагируют с моноклональными антителами 3/1, которые, согласно данным Helbig J.H. et al., специфичны для поверхностной детерминанты, отвечающей за вирулентность легионе лл [59]. В нашем случае штаммы, относящиеся к подгруппе Philadelphia, были вьщелены из клинического материала. Это штаммы GICL 20: 194-Н (коллекционный штамм) и GICL 33: Pyshma-1 (легочная ткань больного легионе ллезом). К подгруппе Benidorm относились штаммы GICL 50: Pyshma-24 (градирня) и GICL 100: Khimki-1 (МО, система водоснабжения).
